茯苓多糖的提取及其抑菌研究
茯苓多糖的提取及含量测定
茯苓多糖的提取及含量测定目的:建立茯苓多糖的含量测定方法。
方法:用水提醇沉法提取茯苓多糖,酚-硫酸法紫外分光光度法测定茯苓多糖的含量。
一、仪器与试药1、仪器：UV2754 紫外分光光度计2、试剂与样品样品：云苓、葡萄糖对照品苯酚、浓硫酸（1）5 %苯酚试剂的配制取苯酚加热蒸馏收集182 ℃的馏分,吸取此馏分10ml 加水至200ml 置棕色瓶内,放冰箱备用。
（2）对照品溶液的配制精密称取105 ℃干燥恒重的葡萄糖50mg 加水溶解并定容至1000ml 量瓶中,即得。
（3）供试品溶液的配制精密称取茯苓提取物50mg ,加水溶解并定容至500ml 量瓶中,过滤,滤液备用,即得。
二、提取准确称取茯苓500g ,切成碎片,加入4～6 倍量的水,回流提取 3 次,时间分别是3 ,2 和1h。
合并 3 次提取液滤过,除去不溶性杂质,得2000ml 滤液。
取600ml减压蒸馏浓缩成76ml ,在搅拌下加入乙醇,使含醇量达到80 % ,静置12h ,离心,收集沉淀,加蒸馏水60ml 溶解煮沸,趁热滤除不溶物,滤液在搅拌下再加入乙醇,使含醇量达到80 % ,放置,析出褐色沉淀后,低温干燥,即得茯苓多糖粗品。
3、吸收波长的选择精密吸取对照品溶液1. 0ml ,和供试品溶液1. 0ml ,分别置于20ml 的试管中,各精密加入5 %的苯酚液1. 0ml ,然后缓慢精密加入 5. 0ml 浓硫酸,摇匀,放置30min后,在分光光度仪上测定波长从400～524nm之间的吸收度,两者均在490nm处有最大吸收,故选择490nm波长测定。
4、重现性实验分别吸取对照品溶液0. 5ml 5 份置试管中,同前操作,吸光度为:0. 614 ,0. 612 ,0. 614 ,0. 613 和0. 615 ,结果RSD = 0. 199 %( n = 5) 。
5 、样品含量测得吸取供试品溶液 1. 0ml 3 份,分别置于20ml 试管中,加入5 %苯酚溶液2. 0ml ,混合后加入浓硫酸6. 0ml ,放置30min ,在490nm处分别测得其吸收度 A 值:A1 =0. 871 ,A2 = 0. 872 ,A3 = 0. 876 ,根据回归方程求出百分含量为74. 16 % , 74.27 %和74. 62 % , 平均含量74. 35 %。
茯苓多糖的提取实验报告
一、实验目的1. 掌握茯苓多糖的提取方法；2. 熟悉茯苓多糖的理化性质；3. 了解茯苓多糖的提取工艺及其影响因素。
二、实验原理茯苓多糖是一种天然高分子化合物，具有多种生物活性，如抗肿瘤、抗病毒、调节免疫等。
本实验采用水提法提取茯苓多糖，通过调节提取温度、时间、pH值等条件，提高茯苓多糖的提取率。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：茯苓菌核、蒸馏水、95%乙醇、无水硫酸钠、盐酸、氢氧化钠等；2. 实验仪器：电子天平、电热恒温水浴锅、旋转蒸发仪、真空干燥箱、磁力搅拌器、离心机、pH计、分光光度计等。
四、实验步骤1. 茯苓菌核预处理：将茯苓菌核粉碎，过100目筛，备用；2. 水提法提取茯苓多糖：（1）称取一定量的茯苓菌核粉末，加入适量蒸馏水，搅拌均匀；（2）调节pH值至6.0；（3）在恒温水浴锅中加热提取，温度为80℃，时间为2小时；（4）提取液过滤，取滤液；（5）将滤液加入95%乙醇，静置过夜；（6）沉淀物用蒸馏水洗涤，再用无水硫酸钠干燥；（7）干燥后的沉淀物称重，计算茯苓多糖提取率；3. 茯苓多糖纯化：（1）将干燥后的沉淀物溶解于蒸馏水中；（2）通过离心分离，去除杂质；（3）使用透析袋去除小分子物质；（4）将透析后的溶液冷冻干燥，得到纯化的茯苓多糖；4. 茯苓多糖理化性质测定：（1）测定茯苓多糖的分子量；（2）测定茯苓多糖的紫外吸收光谱；（3）测定茯苓多糖的溶解度；（4）测定茯苓多糖的抗氧化活性。
五、实验结果与分析1. 茯苓多糖提取率：根据实验结果，在提取温度80℃，时间2小时，pH值6.0的条件下，茯苓多糖的提取率为1.23%；2. 茯苓多糖纯化：经过纯化处理后，茯苓多糖的纯度达到90%以上；3. 茯苓多糖理化性质：（1）分子量：茯苓多糖的分子量为5.2×10^5；（2）紫外吸收光谱：茯苓多糖在200-400nm范围内具有较强紫外吸收；（3）溶解度：茯苓多糖在水中的溶解度为1.5mg/mL；（4）抗氧化活性：茯苓多糖的抗氧化活性较强，IC50值为25.8μmol/L。
茯苓多糖抗糖尿病作用的实验研究_郑彩云
12基础研究中国医疗前沿 2010年7月 第5卷 第14期National Medical Frontiers of China, Jul 2010, Vol.5 No.14茯苓Poria cocos (Schw.) Wolf 为常用中药，为多孔菌科卧孔菌属真菌茯苓的干燥菌核，多依附松树根生长。
傍松根而生的为茯苓(别名：玉灵、茯灵、万灵桂、茯菟)，始载于《本草经》，列为上品，它的菌核为球形、长圆形、卵圆形或不规则团块，茯苓主要分布在我国云南、贵州、湖北、安徽、福建、广东、广西等地[1]。
我国食用茯苓的历史已有两千多年。
《神农本草经》称其“久服安魂养神，不饥延年”。
茯苓性甘、淡、平，入心、脾、肾经。
药理实验表明茯苓具有渗湿利尿、合胃健脾、宁心安神、抑菌、增强机体抗病能力的功效[2,3]。
茯苓多糖(pachyman)是近年来研究较多的一种真菌多糖，约占整个茯苓菌核干重的70%～90%[4]，具有抗肿瘤、提高免疫力的功能，可以提高人体抗病能力，起到防病、延缓衰老的作用，还可以促进细胞分裂，抗诱变、抗肿瘤，对肝炎、鼻咽癌和胃癌患者有一定的疗效[5]。
但茯苓多糖防治糖尿病的相关研究尚未见报道。
因此，本实验对茯苓多糖的降血糖作用进行了研究，为将茯苓多糖开发成糖尿病易感人群或患者的日常保健食品的可行性，提供初步的理论依据。
1 材料与仪器1.1 药品制备 茯苓Poria cocos (Schw.) Wolf 于2007年9月购于河南省医药公司。
按药典(1990年版)方法，粉碎后于60℃～80℃热水4h，收集提取液，减压浓缩至适当体积，按Sevag 法去除蛋白，再用乙醇沉淀为粗品多糖。
粗品多糖经SephadexG-100柱层析分离。
蒸馏水洗脱，收集峰部位的多糖液，流水透析，适当浓缩，乙醇沉淀，干燥后得纯化的多糖精品(简称RP)，总糖含量92.6%。
采用聚丙酰胺电泳法，结果为RP 为单一区带；凝胶过滤法，结果为RP 为单一洗脱峰。
茯苓多糖提取分离的方法
3.1水提醇沉法 称取一定量茯苓粉末→热水浸提→ 抽滤→滤液减压浓缩(浸提液∶浓缩 液=10∶1) →95%乙醇沉淀（含醇 量达80%）→于冰箱中静置过夜→ 离心→沉淀物用无水乙醇、丙酮、乙 醚洗涤→真空干燥得茯苓多糖粗品。 该法采用水作为溶剂，具有价廉、无 毒、操作安全等优点，其缺点是浸提 时间长且提取率较低。
1 概述 2 茯苓多糖结构及理化性质
3 茯苓多糖的提取
4 茯苓多糖纯化方法
1 概述
多糖是来自高等植物、动物细胞膜、微生物细胞中癿天 然大分子物质，一般常由100个以上甚至几千个单糖通过糖 苷键连接而成，分子量在数万至数百万之间…。多糖类包括 植物多糖、动物多糖及微生物多糖，在某种程度上均具有免 疫促迚作用，而植物多糖尤为重要。多糖作为生物效应调节 剂，主要影响网状内皮系统、巨噬细胞、淋巴细胞、白细胞， 以及RNA、DNA和蛋白质癿合成，CAMP不cGMP癿含量、 抗体或补体癿形成以及干扰素癿诱生旧1。多糖具有多方面 癿生物活性，能够调节机体免疫机能，具有抗病毒、抗菌、 抗寄生虫、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老等功能，因而越来越受 重视，尤其是对其抗肿瘤作用癿研究已达到分子受体水平。 多糖癿抗肿瘤途径主要为直接抑制肿瘤细胞的生长、抗氧化、 清除自由基，改变肿瘤细胞膜的生长特性、诱导肿瘤细胞凋 亡及影响癌基因的表达等一-
常用癿去除多糖中蛋白质癿方法有：Sevag法、三氟三氯乙 烷法、三氯醋酸法，这些方法癿原理是使多糖丌沉淀而使蛋 白质沉淀，其中Sevag方法脱蛋白效果较好，它是用氯仿： 戊醇或丁醇，以4：1比例混合，加到样品中振摇，使样品中 癿蛋白质变性成丌溶状态，用离心法除去。 Sevage 法：利用蛋白质在三氯乙烷等有机溶剂中变性癿特 点，将提取液不 Sevage试剂[氯仿：正丁醇=5：1 （V/V）]5：1 混合，振荡，离心，变性后癿蛋白质介于提 取液不 Sevage 试剂交界处。此法癿优点是条件温和，丌 会引起多糖癿变性。
茯苓多糖的酶解工艺及抑菌性研究
经验交流中国酿造2018年第37卷第5期总第315期•177*茯苓多糖的酶解工艺及抑菌性研究李世杰，李勇，曾海英*(贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025)摘要:采用屮葡聚糖酶酶解茯苓多糖获得水溶性茯苓多糖，优化水溶性茯苓多糖的最佳酶解提取工艺，测定酶解产物抑菌效果。
通 过苯酚-硫酸法测定其含量，以水溶性茯苓多糖含量为评价指标，采用L9(34)正交试验设计，优化酶解工艺条件为酶解反应温度55 T；，pH值5.5,时间150m in，酶用量9 000U。
在此条件下获得水溶性多糖含量达到9.20%。
牛津杯法测定其抑菌活性，结果表明，酶解产物 对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌产生较好的抑菌作用，抑菌圈直径分别为14.67 m m、8.89 m m，对枯草芽孢杆菌未见产生明显抑菌圈，为茯苓水溶性多糖深度开发提供前期研究数据。
关键词:茯苓;多糖;酶解;抑菌性中图分类号：S567.3+2 文章编号：0254-5071 (2018)05-0177-04 doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2018.05.034Hydrolysis technology and bacteriostatic activity o f p olysaccharide from Poria cocosLI Shijie, LI Y ong, ZEN G Haiying*(C ollege o f L iq u o r an d F ood E ngineering，G uizhou U niversity，G uiyang 550025, C hina)A bstract: The soluble polysaccharide i^om Poria cocos was extracted with P-glucan enzymolysis. The optimal enzymatic hydrolysis extraction process o f water-soluble polysaccharides was optimized and the antibacterial effect of the enzymolysis products was determined. Using water soluble polysaccharide yield as evaluation index, the optimal process conditions were determined by Lp(34) orthogonal experiments as follows: enzymolysis temperature 55^, pH 5.5, time 150 m in and enzyme addition 9 000 U. At the conditions, the water-soluble polysaccharide content reached 9.20%. The antimicrobial activity o f soluble polysaccharide was study with oxford cup method. It was found that soluble polysaccharide could inhibit Staphylococcus aureus and Escherichia coli,and the antibacterial circle diameters were 14.67 mm and 8.89 mm, respectively. It showed no obvious inhibitory effect on Bacillus subtilis, the results provided preliminary research data for the in-depth development o f water-soluble polysaccharides of P. cocos.Key w ords：Poria cocos; polysaccharide; enzymatic hydrolysis; bacteriostatic activity茯苓(Poria cocos)又名茯菟、万灵桂、茯灵等[1]，是一 种寄生于松科植物马尾松或赤松等树根上，担子菌纲(Ba-sidiomycetes)非褶菌(Aphyllophorales)多孑L菌科(Polypo-raceae)的真菌干燥菌核[2]，在我国分布广泛，主要分布在云南、广西、广东、福建、安徽、湖北、贵州等地，以云南产的 最好[34]。
茯苓多糖的提取
茯苓多糖的提取技术作者：周琳班级：食品0931班【摘要】茯苓多糖为我国传统中药茯苓的主要有效成分，具有抗肿瘤、抗病毒、增强机体免疫力、抗氧化、降血糖血脂、保肝、催眠等作用，可用于医疗、保健等领域，具有广阔的开发应用前景。
为进一步优化茯苓多糖的提取工艺，促进其开发应用，文章参考大量国内外文献，对近几年茯苓多糖的提取及其应用作一综述。
【关键词】茯苓多糖，提取，超声波法1.引言自从20世纪60年代研究发现酵母细胞壁多糖(zymosan)具有免疫增强以及抗肿瘤作用以来，人们对多糖的研究产生了极大的兴趣，尤其是其生物活性方面的研究。
茯苓多糖到底是什么呢？它有什么作用呢？茯苓多糖是近年来研究较多的一种真菌多糖，来源于多孔菌科真菌茯苓的菌核，约占整个茯苓菌核干重的70%～90%［1］，其化学组成为（1→3）-β-D- 葡聚糖［2］。
茯Poria cocos (Schw.) Wolf又称茯菟、茯灵、松薯等, 为多孔菌科(Polyporaceae) 真菌茯苓的干燥菌核，在我国资源丰富，全国各地均自从20世纪60年代研究发现酵母细胞壁多糖具有免疫增强以及抗肿瘤作用以有栽培，主产于云南、安徽、湖南等省。
茯苓是一味使用历史悠久的中药，在《神农本草经》中被列为上品，谓其“主胸胁逆气，利小便，久服安魂宁神，不饥延年。
”《本草纲目》也记载：茯苓“治头风虚眩，暖腰膝，主五劳七伤。
”历代医家均肯定茯苓既有滋补强身作用，又有渗湿利水、益脾和胃、宁心安神之功。
茯苓药性缓和，补而不峻，利而不猛，既能扶正，又可祛邪，能治疗脾胃虚弱、遗精早泄、心悸失眠、健忘多梦、小便不利、呕吐腹泻等症。
其主要有效成分茯苓多糖是一种非特异性免疫促进剂，其不仅能够提高机体的抗病能力，还有较强的抗癌作用。
其性味甘、淡、平，归脾胃肺肾经，有利水渗湿、益脾宁心之功效。
主治气虚劳伤、水肿、痰饮、呕吐、腹泻、热淋、遗精、惊悸、健忘等证。
茯苓多糖是茯苓的有效部位之一，为灰白色粉末，味微咸，无臭，略有吸湿性。
茯苓多糖的含量测定分析
乙型链球菌
(1) - + + + + + (2) - - + + + + -
白喉杆菌
(1) - - - - - + (2) - - - - + + -
福氏痢疾杆菌
(1) (2) -
+
+ +
+ +
+ ++ +-
3 讨论 血竭在云南省几家药厂生产 。广西也有一二家
药厂生产 , 他们的原料取自云南或云南境外 。国产 血竭供应全国 , 在云南临床应用 20 多年 , 疗效确 切 。已证实该中药具有止血 、活血 、化瘀 、收敛 、 止痛 、生肌等功能 。通过动物等试验证实具有抗炎 作用 ; 对血小板聚集 , 血栓形成具有抑制作用 ; 有 止血和抑菌作用 。此外血竭毒性极小 , 按卫生部规 定 , 测定最大耐受量〔6〕, 小鼠 1d 内以最大溶量 ig3 次 , 日剂量 24g/ kg 体重 , 无任何毒性反应 。长期 毒性 3 个月没有任何毒性反应 。
1999 年第 20 卷第 1 期 云 南 中 医 中 药 杂 志
·33 ·
(100mg/ ml) 受试液 , 混匀后取出 2ml , 放入第 2 管
中 , 依次类推 , 直到第 5 管 , 取出 210ml 弃去 , 使
成 1∶2 , 1∶4 , 1∶8 , 1∶16 等各种浓度 , 第 6 管不加
致谢 : 熊郁良 、王琬瑜 、高菊珍 、薛音欢参与小部 分工作 。
参考文献 1 徐叔云 、卞如濂 、陈修主编 1 药理实验方法学 1 北京 :
人民卫生出版社 , 第 2 版 , 19911723～724 2 李仪奎 、王钦茂 1 中药药理实验方法学 1 上海 : 上海
茯苓多糖的提取方法优选
茯苓多糖的提取方法优选茯苓是一种重要的中药材，其所含的多糖具有很高的药用价值。
茯苓多糖具有调节免疫功能、抗肿瘤、保护心血管系统等多种作用。
因此，如何高效、纯净地提取茯苓多糖成为了研究人员关注的重点。
本文将介绍几种茯苓多糖的提取方法，并对它们进行综合评价，从而得出最优化的提取方案。
1. 酸水提法酸水提法是较为传统的提取方法。
其基本步骤是将茯苓粉末放入酸性水中煮沸，再用乙醇沉淀及洗涤。
该方法操作简单，成本较低，但提取效率和糖含量不够理想。
2. 红外辐射提取法红外辐射提取法是近年来发展起来的一种快速、高效的提取方法。
该方法是通过在茯苓多糖晶体内部的红外线作用下进行振荡，并趁机将茯苓多糖提取出来。
该方法提取速度快，不需要反应条件，也不需要施加压力。
但目前针对茯苓多糖的红外辐射提取效果并不理想，有待进一步研究。
3. 超声波提取法超声波提取法是一种非常常见的物理提取方法，应用于茯苓多糖的提取也十分有效。
该方法是通过超声波机将高频声波发送至茯苓样品，产生的声波震动会使茯苓多糖分子振动并脱离固体基质，从而获得茯苓多糖。
该方法具有操作简便、提取效率高、环境友好等优点，但高能量超声波可能会使多糖分子断裂，降低提取效率。
4. 预处理与微波提取法利用微波辅助提取天然产物，可以提取出相对高含量的有效成分。
预处理与微波提取法是一种改进的物理化学提取方法。
在该方法中，茯苓多糖的样品首先进行钝化处理，然后与溶剂混合，利用微波辅助提取并沉淀茯苓多糖，最后采用离子交换树脂富集。
该方法获得了较为显著的提取效果，但实验操作较为繁琐，并且设备成本较高。
5. 纳滤膜提取法纳滤膜技术是一种新兴的现代分离技术。
在该方法中，利用纳滤膜的差异分离特性，可以筛选出茯苓多糖含量相对较高的成分。
该方法不需要加热或加压，提取物中的纯度较高，但需要较长的提取时间。
6. 综合评价与优选通过上述几种提取方法的介绍，我们可以看到每种方法都有其优点和局限性。
为了得到优化的提取方法，我们需要根据需要进行综合评价。
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茯苓多糖的提取及其抑菌研究胡朝暾, 肖 毅, 周鹏飞, 付 明, 胡 兴(怀化学院11生命科学系; 21民族药用植物研究与利用湖南省重点实验室,湖南怀化 418008)摘 要:对茯苓多糖的提取方法和抑菌试验进行了初步的探索1设计了两种不同提取茯苓多糖的方法,分别为:稀碱浸提法和水提醇沉法1通过比较上述两种不同方法的多糖提取率,发现稀碱浸提法的提取率较高,是一种较好的茯苓多糖的提取方法1另外采用纸片扩散法(K-B 法)对两种方法所提茯苓多糖进行抑菌试验,实验结果表明:茯苓多糖对革兰氏阳性菌和阴性菌都有一定的抑制效果,特别对大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌效果明显1关键词:茯苓; 茯苓多糖; 多糖提取; 抑菌试验中图分类号:Q949195 文献标识码:A 文章编号:1671-9743(2012)08-0015-04收稿日期:2012-07-28基金项目:湖南教育厅一般项目(09C756);怀化学院青年基金项目(HHUQ2009-12);民族药用植物研究与利用湖南省重点实验室委托项目(HHUW2011-53)1作者简介:胡朝暾(1977-),男,湖南安化人,怀化学院讲师,博士生,主要研究蜘蛛生理学、生态学和蜘蛛毒素1茯苓(poria cocos (Schw 1)Wolf)为多孔菌科卧孔菌属真菌茯苓的干燥菌核,多依附松树根生长1茯苓主要分布在我国的云南、贵州、湖北和湖南等地[1]1是我国传统的中药材和历史悠久的食品,也是湖南靖州重要的生物资源1在中国传统医学中,茯苓的药用已有二千多年的历史了15神农本草经6中,把茯苓列为上品,有/久服安魂养神,不饥延年0的作用1此外,茯苓也是我国一种历史悠久的食品1早在唐朝集市食摊上就有用茯苓、糯米、白术磨粉制成的茯苓糕,后来先后又出现了茯苓包子、茯苓粥1因此,茯苓也是国家卫生部、国家中药管理局颁布的/既是食品又是药品的品种名单0的一种1药理实验表明茯苓具有渗湿利尿、合胃健脾、宁心安神、抑菌、增强机体抗病能力及降低血糖的功效[2-5]1其中主要功能体现者为茯苓多糖1茯苓多糖(pachy man)是近年来研究较多的一种真菌多糖,约占整个茯苓菌核干重的70%-90%[6]1茯苓多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、增强机体免疫力、保肝、催眠、抗炎等作用[7],可广泛应用于医疗保健、食品等领域1茯苓多糖可用于抗肿瘤药物的研发,从而为肿瘤、癌症的治疗提供新的方法,还可作为免疫增强剂,用于保健品的开发与研制1因此,茯苓多糖的提取及开发意义重大1故对茯苓多糖的提取进行探索,并对其抑菌效果进行初步的检测12 材料与方法211 材料茯苓:购自湖南怀化市靖县茯苓大市场1带回实验室后切成小块后用粉碎机粉成粉末,放入30e 的烘箱中干燥后备用1枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌来自怀化学院生命科学系微生物学实验室1212 试剂与溶液的配置21211 基本培养基:牛肉膏3克,蛋白胨10克,NaCl 5克,琼脂5克,水1000ml 、pH 710~712、121e 灭菌20min 121212 5%苯酚试剂的配制:称取苯酚5g,加水100ml 使溶解,至棕色瓶中,得浓度为5%苯酚试液121213 标准葡萄糖溶液的配制:精密称取105e 干燥恒重的葡萄糖50mg,加水溶解并定容至1000ml 容量瓶中121214 茯苓多糖溶液的配制:精密称取茯苓多糖50mg,加水溶解并定容至500ml 容量瓶中,过滤,滤液备用121215 015麦氏比浊管的配制01048mol P L 的Bacl 2015ml 和0118mol P L 的H 2SO 4第31卷第8期怀化学院学报 Vol 1311No 182012年8月JOURN AL OF HUAIHUA U NIVERSITYAug 1,20129915ml充分混匀121216其他的试剂:乙醇,丙酮、乙醚、氢氧化钠、稀醋酸、二甲基亚砜、鞣酸、活性炭等试剂为国产分析纯1213实验仪器德国进口SI GMA3-18K高速冷冻离心机;美国进口的D U-800紫外可见分光光度计;上海大普仪器有限公司P HS-3C高精度酸度计;余姚市东方电工仪器厂202-3A电热恒温干燥机;上海之信仪器有限公司JY99-IID超声波细胞粉碎机;佛山顺德格兰仕微波炉电器有限公司WP800TL微波炉214茯苓多糖的提取方法21411稀碱浸提法准确称取茯苓粉末10g溶于4e0115mol P L NaO H 2000ml液中,搅拌至粉末溶解,此时溶液呈粘稠状态;4e以下冷藏,过夜,抽渣弃去,滤液以10%的醋酸液中和至pH610,再加入等体积95%乙醇,于4e 放置过夜;8000r P min离心取沉淀,流水透析两天1再依次用蒸馏水、无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤后,减压抽干,冷冻干燥,即得茯苓多糖粗品,呈淡黄色细颗状结晶1准确称取茯苓多糖粗品5g,溶于500ml二甲基亚砜中,在室温下用磁力搅拌器搅拌15h后,加入500 ml蒸馏水,继续搅拌20min,放置2h,8000r P min离心得沉淀1沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤,冷冻干燥,即可得茯苓多糖纯品121412水提醇沉法准确称取茯苓2g,切成碎片,加入200ml的水,重复提取3次,每隔2h提取一次1合并3次提取液过滤,除去不溶性杂质,得滤液1取上述所得滤液,减压蒸馏浓缩,在搅拌下加入乙醇,使含醇量达到80%,静置12h,8000r P min离心得沉淀,收集沉淀1溶解煮沸加蒸馏水60ml,趁热滤除不溶物,滤液在搅拌下再加入乙醇,使含醇量达到80%,放置,析出褐色沉淀后,冷冻干燥,即得茯苓多糖粗品1将粗品溶于150ml蒸馏水中,煮沸,在搅拌下加入1%鞣酸溶液,煮沸,8000r P min离心1取上清液加入鞣酸溶液不混浊为止1加入2%的活性炭,搅拌10 min,趁热用布氏漏斗滤过,滤液放冷,加入乙醇使含醇量达到70%,静置24h,滤取析出物1用70%乙醇100ml,反复洗涤沉淀,检查不含鞣酸为止(也就是当上清液中不出现混浊为止)1将湿品溶于一定量的20%热乙醇中,置于布氏漏斗中过滤,减压后,再加入60e热蒸馏水连续洗脱,流出液减压浓缩,加入乙醇使含醇量达到70%,放置,滤取沉淀冷冻干燥,即得茯苓多糖纯品1215多糖含量的测定茯苓多糖的测定主要采用Dubois等提出的苯酚-硫酸比色法[8]1该方法的原理为[9]:糖在浓硫酸作用下,水解生成单糖,并迅速脱水生成糠醛衍生物,然后与苯酚缩合成橙黄色化合物,且颜色稳定,在波长490nm处和一定的浓度范围内,其吸光度与多糖含量呈线性关系正比,从而可以利用分光度计测定其吸光度,并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量,本方法可用于多糖、单糖含量的测定1216茯苓多糖抑菌实验抑菌试验采用K)B纸片扩散法进行,具体过程如下:先用普通培养基对枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌进行活化1活化好之后,将枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌,以浓度约为5@107 cfu P ml的菌量分别接种到普通营养培养基表面1将两种方法所提茯苓多糖配置为1mg P ml的溶液,以无菌操作将在两种茯苓多糖溶液中和无菌水中浸泡1h的直径为014c m的滤纸片分别贴到培养基上,37e培养24h1每个试验做3个平板重复1最后观察抑菌效果13结果与分析311茯苓中多糖的含量31111标准曲线的制作按照标准曲线的制作方法配制溶液,充分混匀,静置20min于490nm处比色,记录A490值,记录在表1中1表1标准葡萄糖溶液的A490值管号123456789 A49000104601109011370119701242012890134201405用标准葡萄糖含量(mg)为横坐标,用吸光度值A490为纵坐标,用标准曲线计算程序软件作图,即得到一条标准曲线,见图11#16#怀化学院学报2012年8月图1葡萄糖标准曲线图31112水提醇沉法的多糖含量取1、2、3三支试管分别加入2ml的已定容100ml 的茯苓多糖提取液,再加入2ml苯酚、6ml浓硫酸充分混匀,静置20min于490nm处比色,记录A490值,记录在表2中1表2水提醇沉法的多糖溶液的A490值管号123A490012820125801261由表2可知水提醇沉法的多糖的A490的平均值为012671则把01267代入上述方程得样品浓度为010434 mg1由公式样品含量w=(C@V总@D)P(W@V测@ 106)@100%1其中:C)))在标准曲线上查出的糖含量(毫克); V总)))提取液总体积(毫升)V测)))测定时取用体积(毫升);D)))稀释倍数;W)))样品重量可知w=(010434@103@200@100)P(2@2@106) @100%=2117%1所以水提醇沉法提的多糖的含量为:2117%1 31113稀碱浸提法的多糖含量称茯苓10g用稀碱浸提法所得茯苓粗多糖为7160 g1称5g茯苓粗多糖精制后得茯苓纯多糖4178g1由上可知稀碱浸提法的多糖含量为:w%=716P10 @4178P5@100%=721656%综上可知,两种方法即稀碱浸提法和水提醇沉法所提多糖的含量以稀碱浸提法的得率较高为721656%1 312茯苓多糖的抑菌实验为了探讨茯苓多糖的抑菌效果,使用枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、苏云金芽孢图2茯苓多糖对大肠杆菌(Escherichia coli)抑菌圈图A:碱性多糖B:水性多糖C:无菌水图3茯苓多糖对苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)抑菌圈图A:水性多糖B:碱性多糖C:无菌水#17#第31卷第8期胡朝暾,等:茯苓多糖的提取及其抑菌研究杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌进行试验1将细菌接种于平板培养基上,于37e 培养24h 后从培养箱中取出,观测抑菌效果,并拍照1结果发现茯苓多糖对大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌抑制较效果较明显1结果如下:以上结果表明:碱溶性多糖和水溶性多糖对大肠杆菌、苏云金芽孢杆菌都有一定的抑菌作用,但是碱溶性多糖的抑菌效果比水溶性多糖抑菌效果要好1苏云金芽孢杆菌为革兰氏阳性菌,大肠杆菌为革兰氏阴性菌1因此茯苓多糖对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有一定的抑菌效果14 讨论作者通过查阅文献资料,搜索到在真菌多糖的提取过程中常应用的两种不同的提取方法,通过相关提取实验后进行含量测定1多糖含量的测定是利用当前普遍应用的苯酚-硫酸法,但是标准曲线有轻微的非线性,而且随着时间的延长,非线性越明显,所以多糖测定时间控制在10min-30min 内最好1通过多糖含量测定可知两种提取方法所提取的多糖总量有比较明显的差别1稀碱浸提法所提多糖含量高于水提醇沉法1并且水提醇沉法含有水溶性的杂蛋白等物质1用浓碱浸提,虽然收率比水提醇沉法高,但因其溶液稠度较大,难以过滤,操作周期较长1二甲基亚砜可使蛋白质裂解为小分子的易溶于水的肽类物质,因此可用它来除去杂蛋白1综上所述,采用稀碱提取方法,用二甲基亚砜进行精制法较为合理,操作周期短,工艺简单易行1在做细菌的抑菌试验中发现茯苓多糖无论是对革兰氏阳性还是阴性都有较好的抑菌效果,然而在临床上用的抑菌药抗生素对自身都有很大的副作用,茯苓多糖的抑菌作用的发现可能对临床上抑菌用药方面起到一定的指导作用1并且在对大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌抑菌性实验中,发现碱溶性多糖的抑菌效果比水溶性多糖好,原因可能是碱溶性多糖的结构与水溶性多糖的结构不同所导致的1参考文献:[1]中国药科大学.中药辞海[M].北京:中国医药科技出版社,1996:1272-1278.[2]沈映君.中药药理学[M ].上海:上海科学技术出版社,1995:87-89.[3]徐锦堂.中国药用真菌学[M ].北京:北京医科大学P中国协和医科大学联合出版社,1997:547-573.[4]应建浙,卯晓岚,马启明,等.中国药用真菌图鉴[M].北京:科学出版社,1987:202-203.[5]杨冉,李建军,屈凌波,等.茯苓萜类的高效液相色谱指纹图谱研究[J].中草药,2004,35(3):273-275.[6]张敏,高晓红,孙晓萌,等.茯苓的药理作用及研究进展[J].北华大学学报(自然科学版),2008,9(1):63-68.[7]刘林,霍志斐,史树堂,等.茯苓多糖的药理作用概述[J].河北中医,2010,32(9):1427-1428.[8]Dubois M,Gil les KA,Hamilton JK,et al.A colorimetricmethod for the determination of sugars [J].Nature,1951,168(4265):167.[9]Saha SK,Brewer EF.Determination of the concentrations ofoligosaccharides,complex type carbohydrates and glycoproteins using the phenol -sulfuric acid method [J ].Carbohydr.Res.,1994,254B 157-167.The Studies of Pachymaran Extraction and Antibacterial TestHU Zhao-tun, XIAO Yi, Z HOU Peng-fei, FU Ming, HU Xing(11Department o f Li fe Science ; 21Key Laboratory of Research an d Utilization o f Ethnome dicina l Plant Resources of H unan Province ,Huaihua University ,H uaihua,Hunan 418008)Abstract :In this research,Preliminary e xploration of the Pac hymaran extraction method and antibacterial test had been done.It had designed two diffe rent e xtrac tion me thods of Polysaccharides,which were dilute alkali extrac tion,Water e xtraction and alc ohol precipita t ion.By comparing the two different methods of e xtrac tion rate of polysaccharides,it is found that the e xtrac tion rate of the dilute alkali extraction method is the higher,which is a better method of e xtrac ting Pachymaran.In addion the extraction Pachymaran antibacterial experiments we re designed by using the disk diffusion method (KB method).Experimental results sho w that Pachymaran has some effect on Gra m-posit ive and Gra m-ne gative bac teria,especially effec ts of E.coli and Bacillus thuringiensis.Key words :poria cocos ; pachymaran; polysaccharide extraction; antibacte rial test#18#怀化学院学报 2012年8月。