黑龙骨化学成分研究
黑龙骨化学成分研究作者：李勇刘云宝庾石山来源：《中国中药杂志》2013年第10期[摘要]该文对有毒药用植物黑龙骨的化学成分进行了研究。
利用大孔吸附树脂、正相和反相硅胶柱和制备型HPLC等色谱技术从中分离得到9个化合物，分别为：东莨菪内酯（1），trans-3，4，methylenedioxycinnamyl alcohol（2），syringaresinol（3），syringaresinol 4-O，β，D-glucopyranoside（4），6′-O-（E），feruloylsucrose（5），loliolide（6），4，hydroxy，3，methoxyl，benzaidehyde（7），Δ5，pregnene，3β，17α，20α-triol（8），Δ5，pregnene，3β，17α，20α-triol，20-O，β，D-canaropyranoside（9）。
并运用质谱、核磁等波谱技术对分离得到的化合物进行了结构鉴定。
化合物1，2，5～7为首次从该属植物中分离得到已知化合物。
[关键词]黑龙骨；杠柳属；化学成分黑龙骨Periploca forrestii Schltr.，又名滇杠柳，为杠柳属植物，有小毒，具有舒筋活血、祛风除湿、清热解毒等功效，长期以来被作为苗族民间传统草药用于治疗风湿等疾病[1]。
作者在对黑龙骨的化学成分研究过程中，分离得到了9个化合物，经鉴定分别为东莨菪内酯（1），trans-3，4，methylenedioxycinnamyl alcohol（2），syringaresinol（3），syringaresinol 4-O，β，D-glucopyranoside（4），6′-O-（E），feruloylsucrose（5），loliolide（6），4，hydroxy，3，methoxyl，benzaidehyde（7），Δ5，pregnene，3β，17α，20α-triol（8），Δ5，pregnene，3β，17α，20α-triol，20-O，β，D-canaropyranoside（9）。
其中化合物1，2，5～7均为首次从该属植物中分离得到已知化合物。
1 材料Mercury，400，Inova 500M及SX，600型核磁共振仪；Agilent 1100 Series LC，MSD，Trap，SL型质谱仪；液相色谱仪，Shimadazu LC，6AD，SPD，6A紫外检测器；YMC，Pack ODS，A制备型反相色谱柱（20 mm×250 mm，10 μm）；硅胶（160～200，200～300目），青岛海洋化工厂生产；大孔树脂，D101型，天津南开大学化工厂；反相硅胶，Rp，C18（40～75 μm），日本Fuji Silysia 公司生产。
黑龙骨药材于2005年采自中国广西，经广西中医学院韦松基教授鉴定为黑龙骨P. forrestii，标本现存于中国医学科学院药物研究所植物标本室，标本号ID，s，2360。
2 提取与分离取干燥生药黑龙骨全株10 kg，粉碎，用95%乙醇加热提取3次，每次2 h，提取液减压浓缩得到流浸膏。
将其悬浮于水中，用石油醚萃取。
减压浓缩，得到石油醚萃取物122 g。
水层部分经过滤，滤液上D101大孔吸附树脂，依次以水，30%，60%，95%乙醇洗脱，分别得到W1（110 g），W2（70 g），W3和W4部位，经TLC及HPLC检测60%乙醇（W3）和95%乙醇（W4）洗脱部位成分相似合并为W3（30 g）。
取W3部位27 g，经硅胶柱G（200～300目）柱色谱，以氯仿，甲醇（15∶1，10∶1，5∶1，1∶1，0∶100）进行梯度洗脱，得到16个组分，经TLC检识合并，得到9个组分（Fr. 1～Fr. 9）。
组分Fr. 1经硅胶柱和制备型HPLC 分离得到化合物1（18 mg），2（17 mg），3（29 mg）；Fr.2经分离得到化合物6（11 mg），7（11 mg）；Fr.3经分离得到化合物8（11 mg）；Fr.5经分离得到化合物4（113 mg），9（24 mg）；Fr.9经分离得到化合物5（36 mg）。
3 结构鉴定化合物1 白色无定形粉末，紫外光下显蓝色荧光。
1H，NMR（C5D5N，600 MHz）δ：3.75（3H，s，6，OCH3），6.30（1H，d，J=9.6 Hz，H，3），7.03（1H，s，H，8），7.11（1H，s，H，5），7.67（1H，d，J=9.6 Hz，H，4），4.01（1H，s，7，OH）；13C，NMR（C5D5N，150 MHz）δ：161.5（C，2），112.6（C，3），144.1（C，4），109.5（C，5），146.3（C，6），153.1（C，7），104.2（C，8），151.1（C，9），111.1（C，10），56.2（6，OCH3）。
以上数据与文献[2]对照一致，鉴定化合物1为东莨菪内酯。
化合物2 白色无定形粉末。
1H，NMR（C5D5N，600 MHz）δ：7.18（1H，s，H，2），6.83（1H，d，J=7.8 Hz，H，5），6.92（1H，d，J=7.8 Hz，H，6），6.84（1H，d，J=16.2 Hz，H，7），6.52（1H，dt，J=16.2，4.2 Hz，H，8），5.93（2H，s，，OCH2O，），4.53（2H，d，J=4.2 Hz，H，9）；13C，NMR（C5D5N，150 MHz）δ：132.5（C，1），106.2（C，2），148.7（C，3），147.5（C，4），108.7（C，5），121.3（C，6），129.2（C，7），129.9（C，8），62.9（C，9），101.6（，OCH2O，）。
以上数据与文献[3]对照一致，鉴定化合物2为trans-3，4，methylenedioxycinnamyl alcohol。
化合物3 白色无定形粉末。
1H，NMR（DMSO-d2，500 MHz）δ：3.74（12H，s，3，5，3′，5′，OCH3），4.60（2H，d，J=3.0 Hz，H，7，7′），4.15（2H，dd，J=15.0，8.0 Hz，H，9a，9′a），3.81（2H，dd，J= 15.0，8.0 Hz，H，9b，9′b），3.03（2H，m，H，8，8′），6.59（4H，s，H，2，2′，6，6′）。
以上数据与文献[4]对照，鉴定化合物3为syringaresinol。
化合物4 白色无定形粉末。
1H，NMR（CD3OD，500 MHz）δ：3.80（6H，s，，OCH3×2），3.78（6H，s，，OCH3×2），4.71（1H，d，J=4.0 Hz，H，7′），4.66（1H，d，J=3.5 Hz，H，7），4.22（1H，dd，J=15.5，8.5 Hz，H，9a），3.84（1H，dd，J=9.0，2.5 Hz，H，9b），4.22（1H，dd，J=15.5，8.5 Hz，H，9′a），3.86（1H，dd，J=9.0，2.5 Hz，H，9′b），3.07（1H，m，H，8），3.13（1H，m，H，8′），6.65（2H，s，H，2′，6′），6.60（2H，s，H，2，6），4.97（1H，d，J=7.8 Hz，H，1″），3.70（1H，dd，J=12.0，1.5 Hz，H，4″），3.61（1H，dd，J=12.0，5.0 Hz，H，3″），3.47（1H，dd，J=7.5，1.5 Hz，H，5″），3.35（2H，dd，J=7.5，1.5 Hz，H，6″），3.25（1H，m，H，2″）；13C，NMR（CD3OD，125 MHz）δ：154.4（C，3′，5′），149.4（C，3，5），139.5（C，1′），136.2（C，4），135.6（C，4′），133.1（C，1），104.8（C，2′，6′），104.5（C，2，6），87.6（C，7），87.2（C，7′），72.9（C，9′），72.8（C，9），55.7（C，8），55.5（C，8′），105.3（C，1″），78.3（C，5″），77.8（C，3″），75.7（C，2″），71.3（C，4″），62.6（C，6″），57.1（，OCH3×2），56.8（，OCH3×2）。
以上数据与文献[4]对照一致，鉴定化合物4为syringaresinol 4-O，β，D-glucopyranoside。
化合物5 白色无定形粉末。
1H，NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：7.52（1H，d，J=15.5 Hz，H，7），7.00（2H，s，H，2，6），6.47（1H，d，J=15.5 Hz，H，8），5.21（1H，d，J=3.6 Hz，H，1′），3.25（1H，dd，J=9.5，4.5 Hz，H，1′），3.82（1H，m，H，3′），3.11（1H，t，J=9.5 Hz，H，4′），4.00（1H，m，H，5′），4.13（1H，d，J=6.0 Hz，H，6′a），4.29（1H，d，J=12.0 Hz，H，6′b），3.60（2H，d，J=2.0 Hz，H，1″），3.88（1H，d，J=8.0 Hz，H，3″），3.82（1H，t，J=7.5 Hz，H，4″），3.60（1H，m，H，5″），3.54（1H，m，H，6″a），3.52（1H，m，H，6″b）；13C，NMR（DMSO，125MHz）δ：166.7（C〖CDS2mm〗O），148.2（C，3，C，5），145.4（C，7），139.6（C，4），123.4（C，1），115.6（C，8），106.3（C，2，6），103.8（C，2′′），91.3（C，1′），82.6（C，5″），76.9（C，3″），74.5（C，4″），72.8（C，3′），71.5（C，2′），70.2（C，5′），70.0（C ，4′），63.8（C ，6′），62.6（C ，6″），62.4（C ，1″），56.0（，OCH 3×2）。
以上数据与文献[5]对照一致，鉴定化合物5为6-O-（E ），feruloylsucrose 。
化合物6 白色无定形粉末。
1H ，NMR （C 5D 5N ，500 MHz ） δ：5.82（1H ，s ，H ，7），4.34（1H ，br s ，H ，3），3.59（1H ，s ，3，OH ），2.57（1H ，br d ，J=13 Hz ，H ，4a ），2.01（1H ，br d ，J=14 Hz ，H ，2a ），1.90（3H ，s ，H ，11），1.73（1H ，br d ，J=13 Hz ，H ，4b ），1.49（3H ，s ，H ，9），1.38（1H ，br d ，J=14 Hz ，H ，2b ），1.11（3H ，s ，H ，10）；13C ，NMR （C 5D 5N ，125 MHz ） δ：36.2（C ，1），47.7（C ，2），65.9（C ，3），46.4（C ，4），87.0（C ，5），182.9（C ，6），113.1（C ，7），171.8（C ，8），26.6（C ，9），30.7（C ，10），27.3（C ，11）。
黑骨头抗炎镇痛作用的实验研究
黑骨头抗炎镇痛作用的实验研究目的：观察黑骨头乙醇提取物的抗炎镇痛作用。
方法：采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀、醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加模型观察黑骨头的抗炎作用；采用热板法、醋酸扭体法观察黑骨头的镇痛作用。
结果：黑骨头可有效提高小鼠痛阈值(P＜0.01)和抑制小鼠醋酸扭体反应率(P＜0.05)；对二甲苯所致小鼠耳肿胀有显著抑制作用(P＜0.01)；对醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增加也有抑制作用(P ＜0.05)。
结论：黑骨头具有较好的抗炎、镇痛作用。
标签：黑骨头；抗炎；镇痛；实验研究黑骨头(Periploca forrestii Schlechter)又名铁骨头、青蛇胆、达风藤、黑风藤等，常绿攀援藤本，根或全株入药；有通经络。
祛风湿，消炎，活血等功效；用于治疗风湿性关节炎，跌打损伤等。
目前国内外尚未见其抗炎、镇痛作用的报道。
本研究观察了黑骨头乙醇提取物对小鼠的抗炎、镇痛作用，现总结报告如下。
1实验材料1．1药物实验用黑骨头，采集于楚雄永仁，由大理学院生药学教研室马晓匡教授鉴定。
采后自然阴干，切碎。
称取6000g，用乙醇浸泡、浓缩得浸膏303g，即1g浸膏相当于19.80g生药，临用前取浸膏分别用水配制成低(0.175％)、中(0.350％)、高(0.700％)3个剂量组的黑骨头混悬液，依次含生药700mg，1400mg，2800mg；阿司匹林肠溶片(昆明云健制药有限公司，批号：20070140)；冰醋酸(西安化学试剂厂，批号：901209)；伊文思蓝(上海化学试剂采购供应站经销行校办厂分装，批号：82-11-02)。
1．2动物昆明种小鼠．体重18～22g，雌雄各半，由四川省动物研究所提供，动物合格号：SCXK(川)2004-50。
1．3仪器722光栅分光光度计(上海生化仪器厂生产)；电热恒温水温箱(上海医疗器械七厂；型号：HH-W21-Cu600)；电子天平[梅特勒一托利多仪器(上海)有限公司；型号：AL204-1C]；秒表(上海星钻秒表有限公司)。
药用植物黑骨藤化学成分研究初报
ｏ ｆ ｃ ｎｅＧ ｉ ｏ ｎｖｒｉ ， ｕｙｎ ｕ ｈ ｕ５０ ２ ，ｈｎ ） ｆＬ ｅ ｉ ｃ ，ｕｚ ｕＵ ｉ ｓｙ Ｇ ｉ ｇ Ｇ ｉ ｏ ５０ ５ Ｃ ｉａ ｉＳｅ ｈ ｅ ｔ ａ ｚ
Ｋｅ ｏｄ ： ｅｉｏａ ｏｒ ｔ ｃｌ ；ｈｍｉ ｌ ｏｓｔｅｔ；ｅａａｏ ｎ ｅｔ ｃｔｎ ｙｗ ｒｓ Ｐ ｒ ｌ ｒ ｓｉ ｈｔ ｃ ｅ ｃ ｎｔｕｎ ｓｐｒ ｉ ａｄｉ ｎ ｆ ａｏ Ｐ ｃ ｆ ｅ ｉＳ ｒ ａｃ ｉ ｓ ｔｎ ｄ ｉ ｉ ｉ
魏 生华教授 鉴定 为萝摩科 杠柳 属植 物黑 骨藤 。 将 ｌ ｇ 骨藤茎洗 净 ， ０ｋ 黑 切片 ， 日光下 晒干 ， 碎 ， 粉 然后 用 ８％ 乙醇浸 泡 ， 于常 温下 ７ ， ５ 置 ２ｈ 将浸 出液过 滤， 减压浓 缩 。反 复多 次提 取 ， 次 浸 泡 时 间 为 ２～３ｄ 滤 液 减 压 浓缩 ， 缩 物 合 并 在 一 起 。残 渣 再 用 每 ， 浓
分经反复硅胶柱色谱 ， 得化合物 Ｉ 化合物 Ⅱ和化合物Ⅲ。 、
２ 结构 鉴 定
２ １ 化合 物 Ｉ ．
无 色针状结晶（ Ｄ Ｉ ， ｐ３ １７℃， Ｉ Ｍ Ｃ Ｃ３ ｍ １５～ ３ ） Ｅ — Ｓ给出分子量 ４４ Ｍ］＋３６ ８ １ ，２ （ ． ％） １［ ９ （． ％） ３９ ９ ７ ，
山 地 农 业 生 物 学 报 ２ （ ）５ ０～ ６ ，０ ８ ７ ６ ：６ ５ ２２０
Ｊ ｕ ｎ ｌ ｏ Ｍｏ ｎ ａｎ Ａｇ ｃ ｌ ｒ ａ ｄ Ｂｉｌｇ ｏ ｒ ａ ｆ ｕ ｔｉ ｉ ｒ ｕｔ ｅ ｕ ｎ ｏｏ ｙ
药 用植 物 黑 骨藤 化 学成 分 研 究初 报 半
土 西化 ， 王富花 郁建平 郴建干
第６ 期
王富花 ， ： 等 药用植物黑骨藤化学成分研究初报
黑骨头的功效与作用
黑骨头的功效与作用黑骨头是中医医药的一种，对于许多疾病是非常有帮助的。
下面我们就对黑骨头简单的介绍一下。
【别名】铁散沙、铁骨头、牛尾蕨、山筋线（《广西药植名录》），山杨柳、青蛇胆、小青蛇、柳叶夹（《昆明民间常用草药》），黑龙骨、飞仙藤，达风藤（《云南中草药选》），小黑牛、青香藤、奶浆藤、青色丹、黑骨藤、青风藤（《云南中草药》）。
【来源】为萝藦种植物★西南杠柳的★根或★全株。
秋、冬采集，洗净切片，晒干。
【原形态】西南杠柳，又名：滇杠柳。
【生境分布】生于山野疏林中。
分布西藏、云南、贵州、广西等地。
【化学成份】滇杠柳新鲜茎皮中提出的滇杠柳甙（粗甙）具有强心作用，其特点类似毒毛旋花子甙G。
滇杠柳甙之鸽平均致死量为5.9±1.0毫克/公斤，较毒毛旋花子甙G低。
【性味】《昆明民间常用草药》："苦，凉，有小毒。
"【功能主治】通经络，祛风湿，活血，消炎。
治跌打损伤，风湿关节痛，月经不调，口腔炎，乳腺炎。
【用法用量】内服：煎汤，1～2钱；或浸酒。
外用：煎水洗或研末调敷。
【注意】《云南中草药》："肝炎，消化道溃疡患者忌服。
一日量不宜超过三钱，服过量出现抽搐，甚至死亡。
"【摘录】《*辞典》【出处】出自《昆明民间常用草药》经过本文的介绍我们可以从中了解到关于黑骨头的相关知识。
不管是从食物保健还是中医的角度，黑骨头的作用都是不可小觑的。
民族药黑骨头药材杠柳毒苷含量测定的方法研究
民族药黑骨头药材杠柳毒苷含量测定的方法研究作者：杨勇帮李健田白玥来源：《中国民族民间医药·下半月》2021年第09期【摘要】目的：建立系統、科学的黑骨头中杠柳毒苷的提取和含量测定的方法，为黑骨头的质量控制提供方法。
方法：采用高效液相色谱法，色谱柱为Agilent Venusil PLOW-C18柱（4.6mm×150mm，5μm）;流动相为水-乙腈;流速为1.0mL/min;检测波长为220nm;柱温为25℃。
结果：黑骨头中杠柳毒苷的峰得到有效的分离，HPLC检测条件、方法的专属性、线性、重复性、精密度、稳定性、回收率良好，该方法可以用于杠柳毒苷的含量测定。
结论：该方法为黑骨头的质量控制和评价提供了参考依据。
【关键词】黑骨头;杠柳毒苷;高效液相色谱法;含量测定【中图分类号】R29【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2021）18-0031-04Study on the Standard Content Determination of Chinese Herbal Medicine Periploca CalophyllaYANG Yongbang1LI Jiantian1BAI Yue21.Yuxi Institute for food and drug control，Yuxi 653100，China;2.Puer college，Puer 665000，ChinaAbstract：Objective To establish a systematic and scientific method for the extractionand determination of periplocin in Periploca calophylla，and to provide a reliable method for scientific evaluation and effective control of the quality of Periploca calophylla.Methods HPLC was used. The column was Agilent venusil plot-c18 （4.6mm×150mm，5 μm）; the mobile phase was water acetonitrile; the flow rate was 1.0mL/min; the detection wavelength was 220nm; the column temperature was 25℃.Results the HPLC detection conditions，specificity，linearity，repeatability，precision，stability and recovery rate were good. The method can be used for the content determination of Periplocoside.Conclusion this method provides a reference for the quality control and scientific evaluation of Periploca calophylla.Keywords：Periploca calophylla; Periplocin; HPLC; Content Determination民族民间用药是中华传统医药的重要组成部分，其历史悠久并具很强的地域性。
苗药黑骨藤化学成分及药理作用研究进展
苗药黑骨藤化学成分及药理作用研究进展
李雪峰;刘育辰;刘刚;金文渊;袁思文;郝杰
【期刊名称】《中成药》
【年(卷),期】2018(040)004
【摘要】黑骨藤为民间常用草药,主要分布于贵州、云南、四川、西藏等地,目前发现黑骨藤中主要含有黄酮类、三萜类、甾体类和挥发油等化学成分.现代药理研究表明,黑骨藤具有抗炎、镇痛、抗类风湿性关节炎、抗肿瘤等作用,但具体药效成分尚不明确.本文对黑骨藤的本草考证及民间用药化学成分及药理作用进行了归纳总结,以期为黑骨藤的研究及开发利用提供参考.
【总页数】9页(P904-912)
【作者】李雪峰;刘育辰;刘刚;金文渊;袁思文;郝杰
【作者单位】贵阳中医学院,贵州贵阳550002;贵阳中医学院,贵州贵阳550002;贵阳中医学院,贵州贵阳550002;贵阳中医学院,贵州贵阳550002;贵阳中医学院,贵州贵阳550002;贵阳中医学院,贵州贵阳550002
【正文语种】中文
【中图分类】R287
【相关文献】
1.苗药六月雪化学成分及药理作用研究进展 [J], 鲁利民;陆锦锐;韩忠耀
2.黑骨藤化学成分及药理作用研究进展 [J], 甘秀海;周欣;赵超;陈华国
3.苗药蓝布正的化学成分、质量控制及药理作用研究进展 [J], 赵茹茹;张建永;周旭
美
4.UPLC-Q-TOF-MS法分析苗药黑骨藤提取物中的化学成分 [J], 覃小丽;陈浩;李奎;黄勇;巩仔鹏;李月婷;李勇军;郑林
5.苗药囊拜破化学成分及药理作用研究进展 [J], 王喻雪;毛效贤;张敬杰;何康;邹娟;潘炉台
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
中药材龙骨的化学成分与药理作用研究
中药材龙骨的化学成分与药理作用研究龙骨，又称龙骨骨，是中药中常见的一种宝贵药材。
它是从已死去的龙类（通常为大蜥蜴）骨骼上取得的，具有滋补强壮、镇静安神、止血、退热等特效功效。
在传统中医学中，龙骨的应用已有悠久历史，而近年来，随着现代科技水平的进步，对龙骨的成分和作用机制的研究也逐渐深入。
一、龙骨的药理作用1. 镇静安神龙骨具有镇静安神的功效，可以消除紧张、焦虑、恐惧等不良情绪。
研究表明，龙骨可以通过调节脑内抑制性神经递质γ-氨基丁酸（GABA）的含量，从而发挥镇静安神的作用。
此外，龙骨还能够减轻醒后的疲劳感，使身体感到轻松和舒适。
2. 抗惊厥龙骨具有抗惊厥的作用，可以减少惊厥发作的次数和持续时间。
研究表明，龙骨的这种作用可能与其含有的钙、磷、镁等微量元素有关。
这些微量元素可以调节神经肌肉的兴奋性，使得神经肌肉的传导顺畅，从而达到抗惊厥的效果。
3. 止血散瘀龙骨具有止血散瘀的作用，可以减轻外伤或手术后的出血情况，同时还能够促进软组织的修复。
研究表明，龙骨中含有的成分可以调节凝血酶原时间和活化部分凝血酶原时间，从而发挥止血散瘀的作用。
此外，龙骨的成分还能够促进内皮细胞的生长，并增加皮下组织的血流量，从而促进软组织的修复。
4. 退热解毒龙骨具有退热解毒的作用，可以降低体温，缓解热性疾病的症状。
研究表明，龙骨中含有的成分可以通过影响体温调节中枢和提高体内抗氧化能力来发挥退热解毒的作用。
二、龙骨的化学成分龙骨中含有多种化学成分，其中主要成分包括有机酸、骨胶原、蛋白质、氨基酸、钙、磷、镁、锶、锆等微量元素。
1. 有机酸龙骨中含有多种有机酸，如琥珀酸、吡咯烷酮、丁酸、草酸、酒石酸等。
这些有机酸具有多种生理活性，如抗炎、抗氧化、抗菌等。
2. 骨胶原龙骨中含有大量的骨胶原，这是一种结构多样和功能丰富的蛋白质，在组织修复和再生过程中起着重要作用。
骨胶原可以促进软组织的修复和增强骨骼的强度。
3. 氨基酸龙骨中含有丰富的氨基酸，如L-赖氨酸、L-组氨酸、L-精氨酸等。
黑骨藤的化学成分和药效研究进展
凯里学院学报 Journal of Kaili Univen. 2021
黑骨藤的化学成分和药效研究进展
孙文娟 1，龙春芳 2，龙 毅 1*
（1. 贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025；2. 凯里学院，贵州 凯里 556011）
·56·
2.3 治疗皮肤系统疾病的作用 通过使用二硝基氯苯所诱发的小鼠迟发性超敏反应，发现了黑骨藤的醇沉部位的小鼠灌胃
给药对于抑制二硝基氯苯诱发的超敏反应具有明显的抑制作用 . 研究数据表明，黑骨藤醇沉部位 的剂量在 50 mg/kg 的时候抑制二硝基氯苯诱发的超敏反应作用非常明显，且剂量在 50 mg/kg 和 100 mg/kg 的黑骨藤醇沉部位还能明显地抑制增强脾细胞增殖反应 . 由此可知，黑骨藤醇沉部位 具有一定的免疫抑制活性，并且可考虑将其应用于过敏性疾病治疗当中［21］.
特应性皮炎作为一种人体免疫调节作用异常的瘙痒疾病而存在 . 针对该病症，鲍春梅等［22］通 过研究黑骨藤皂苷对特应性皮炎小鼠的治疗作用，发现黑骨藤皂苷可以治疗特应性皮炎 . 目前虽 然黑骨藤皂苷治疗特应性皮炎的免疫调节机理还没完全清楚，但为深入研究治疗特应性皮炎提 供了一定的理论依据 . 2.4 治疗肿瘤的作用
各项研究中分离的化合物主要集中在极性较大部位，尤以水提部位为多，这些化合物又通常 具有细胞增殖抑制、抗氧化和抗肿瘤的活性 . 由此可以推测黑骨藤水溶性提取部位是抗类风湿性 关节炎的主要活性部位，这或许是民间和临床治疗风湿性关节炎和类风湿关节炎等疾病时通常 会采用水煎煮的方式进行服用的原因 .
收稿日期：2020 - 12 - 07 基金项目：国家自然科学基金资助项目（81660710） 作者简介：孙文娟（1987 - ），女，山东招远人，贵州中医药大学硕士研究生，研究方向为天然药物化学及活性成分 . *通讯作者：龙毅，E - mail：longyi621@.
UPLC—Q—TOF—MS法分析苗药黑骨藤提取物中的化学成分
UPLC—Q—TOF—MS法分析苗药黑骨藤提取物中的化学成分目的：建立黑骨藤提取物中化學成分的分析方法，为进一步阐明黑骨藤药效物质基础提供参考。
方法：以70%乙醇为溶剂制备黑骨藤提取物。
采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用技术（UPLC-Q-TOF-MS）对提取物进行成分分析，色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18，流动相为0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈（梯度洗脱），流速为0.25 mL/min；采用电喷雾离子源，在负离子扫描模式下检测。
通过碎片离子信息、相关文献以及对照品比对，确定黑骨藤提取物中的化学成分。
结果：在黑骨藤提取物中共分离出了23个化合物，并确定了9个化合物。
其中，5、8、9、16、17、18、22、23号峰通过与对照品比对分别确定为5-O-咖啡酰基奎宁酸、3-O-咖啡酰基奎宁酸、4-O-咖啡酰基奎宁酸、3，4-O-二咖啡酰基奎宁酸、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸、4，5-O-二咖啡酰基奎宁酸、杠柳毒苷、杠柳苷元；13号峰通过碎片离子和文献比对推断为（1S，3R，4R，5R）-3-{[（2E）-3-（3，4-dihydroxyphenyl）-2-propenoyl]oxy}-1，5-dihydroxy-4-{[（2E）-3-（4-hydroxy-3，5-dimethoxyphenyl）-2-propenoyl]oxy}cyclohexanecarboxylic acid。
结论：建立的UPLC-Q-TOF- MS法可以快速、高效、准确地分析黑骨藤提取物中的化学成分。
ABSTRACT OBJECTIVE：To establish a method for the analysis of chemical compositions in Periploca forrestii extract，and to provide reference for further elucidating the chemical basis of the P. forrestii. METHODS：70% ethanol was used to prepare P. forrestii extract. UPLC-Q-TOF-MS was adopted to analyze the chemical compositions of the extract. The determination was performed on an Agilent Eclipse Plus C18 column with mobile phase consisted of 0.1% formic acid water-0.1% formic acid acetonitrile （gradient eludtion）at the flow rate of 0.25 mL/min. ESI source was applied to analyze the chemical composition of P. forrestii extract in negative scanning ion mode. The chemical constituents of P. forrestii extract were confirmed by the fragment ion information，related literature and standard control comparison. RESULTS：Totally 23 compounds were separated from P. forrestii extract，and 9 compounds were indentified. The peaks of 5，8，9，16，17，18，22 and 23 were identified as 5-O-caffeoylquinic acid，3-O-caffeoylquinic acid，4-O-caffeoylquinic acid，3，4-O-dicaffeoylquinic acid，3，5-O-dicaffeoylquinic acid，4，5-O- dicaffeoylquinic acid，glucoperiplocymarin and periplogenin by comparison with standard control. The peak of 13 was deduced as （1S，3R，4R，5R）-3-{[（2E）-3-（3，4-dihydroxyphenyl）-2-propenoyl]oxy}-1，5-dihydroxy-4-{[（2E）-3-（4-hydroxy-3，5-dimethoxyphenyl）- 2-propenoyl]oxy}cyclohexanecarboxylic acid by comparison with fragment ion information and related literature. CONCLUSIONS：The established UPLC-Q-TOF-MS method can be used for the rapid，efficient and accurate analysis of the chemical constituents in P. forrestii extract.KEYWORDS Miao medicine；Periploca forrestii；UPLC- Q-TOF-MS；Chemical composition黑骨藤为萝藦科杠柳属植物黑龙骨（Periploca forrestiiSchltr.）的干燥根或全株，收载于《贵州省中药材、民族药材质量标准》（2003年版）中[1]，是贵苗族常用药，具有通经、活血和祛风等功效，并且对风湿、类风湿疾病所引起的软组织无菌性炎症亦有较强的消肿止痛作用[2-3]。
黑骨藤中总黄酮含量的测定
黑骨藤中总黄酮含量的测定景小楠;钟菡;张宏;于树华【摘要】对采自不同产地,不同年份黑骨藤的总黄酮含量进行了测定.以芦丁为对照品,检测波长510 nm,绘制标准曲线,采用紫外分光光度法测定总黄酮的相对百分含量.芦丁对照品在2.065～103.250 mg·L~(-1)范围内有良好的线性关系(r=0.999 90),平均回收率为98.03%,RSD值为1.40%.采用分光光度法测定黑骨藤的总黄酮含量操作简便,结果可靠,为评价黑骨藤的质量提供了依据.【期刊名称】《四川师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(033)001【总页数】4页(P89-92)【关键词】黑骨藤;总黄酮;紫外分光光度法【作者】景小楠;钟菡;张宏;于树华【作者单位】四川师范大学,生命科学学院,四川,成都,610066;四川师范大学,生命科学学院,四川,成都,610066;四川师范大学,生命科学学院,四川,成都,610066;四川师范大学,植物资源应用与开发研究所,四川,成都,610066;四川师范大学,生命科学学院,四川,成都,610066;四川师范大学,植物资源应用与开发研究所,四川,成都,610066【正文语种】中文【中图分类】R917;S816.17黑骨藤(Periploca forrestii Schltr)属于萝摩科(Asclepiadaceae)杠柳亚科(Subfam.Periplocoideaek. Schum)植物,是被贵州省药材标准收载的一种苗药,具有祛风除湿、活血通络、消痹止痛的功能,可舒筋活络、祛风除湿;主治风湿性关节炎、跌打损伤、胃痛、消化不良、闭经、痢疾等[1-3].目前对于黑骨藤的研究主要涉及化学成分及抗风湿、抗炎等药理作用的研究.已知的化学成分有熊果酸等三萜类化合物[4-7],杠柳苷元、杠柳苷等强心苷类化合物[8-10],未见对其总黄酮化合物的相关研究报道.近年来,黄酮类化合物因具有抑菌、止咳抗炎、抗心率失常、降血脂、抗氧化、雌性激素样作用、抗肿瘤、消除机体内自由基抗衰老、增强机体免疫力[6-7]等多项药理活性且毒性低而备受关注.本课题组在前期研究中发现黑骨藤中含有黄酮类化合物,在此研究基础上本文就对采自于不同地域、不同时间的黑骨藤植物中的总黄酮含量进行分析比较,为黑骨藤药用资源的综合利用提供科学依据.日本岛津UV-1700型紫外可见扫描分光光度计,KQ-300DE型数控超声波清洗器,德国SAR2 TOR I US BP211D型电子天平.芦丁对照品由中国药品生物制品检定所提供.其他试剂均为分析纯.黑骨藤样品由本课题组于2005～2007年在贵州省贵阳市、四川省凉山州西昌市和都江堰市青城山采集,经四川成都中医药大学生药教研室鉴定为萝摩科(Asclepiadaceae)杠柳属(Periploca Linn)黑骨藤(Periploca forrestil Schltr).2.1 标准曲线的制作精密称取芦丁标准品0.020 65 g,用质量分数为50%乙醇配制成206.5 mg ·L-1的储备液.精密移取上述储备液0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL容量瓶中,分别加入0.3 mL质量分数为5%亚硝酸钠溶液,摇匀,放置6 min后加入0.3 mL质量分数为10%硝酸铝溶液,摇匀,放置6 min后加入4 mL质量分数为4%的NaOH溶液,用质量分数为50%的乙醇定容至刻度,摇匀,静置20 min[11].在200～600 nm波长范围进行吸收光谱扫描.,以不加标准品同法制备空白对照.在510 nm处测定吸光度,以芦丁浓度为横坐标,吸光度为纵坐标进行拟合,得出回归方程.2.2 精密度的测定精密吸取一定量标准品溶液,按2.1项下同法操作,测定低、中、高3个质量浓度分别为2.474、37.110、86.600 mg·L-1的吸光度值,分别测定日内精密度和日间精密度.2.3 稳定性的测定精密吸取一定量标准品溶液,按2.1项下同法操作,在室温下放置15、30、45、60、90、150 min,测定吸光度,计算稳定性.2.4 重现性的测定精密称取一定量的西昌黑骨藤(采自2007年)的茎,粉碎过30目筛,按1∶20的固液比用质量分数为50%乙醇浸泡超声提取.提取条件:时间30 min,温度70℃,超声频率40 kHz.提取液过滤、浓缩、定容得样品溶液.取一定量溶液充分摇匀后用定量滤纸过滤,移取滤液,按2.1项下同法操作,定容,在510 nm测定吸光度值,根据回归方程得出样品的黄酮含量.2.5 加标回收率精密称取一定量的西昌黑骨藤(采自2007年)的茎,再精确加入适量的芦丁对照品溶液(浓度为486.19 mg·L-1)3 mL,按2.4项下同法操作,测定含量,计算加标回收率.2.6 样品溶液的制备及含量测定精确称取一定量过30目筛的样品,按2.4项下同法操作,根据回归方程得出样品的黄酮含量.3.1 标准曲线根据光谱扫描结果,确定波长为510 nm.得到的回归方程为:y=0.011 72x-0.004 65,相关系数r=0.999 90.表明在2.065～103.250 mg· L-1之间芦丁标准品呈良好的线性关系.3.2 精密度精密度结果见表1,RSD值均低于5%,该方法精密度较好,符合含量分析要求.3.3 稳定性在15、30、45、60、90、150 min的吸光值为0.443、0.443、0.435、0.421、0.415、0.413,RSD值为3.20%,较小.从吸光值数据来看,前30 min吸光值更为稳定,说明在前30 min样品有更好的稳定性.3.4 重现性样品含量分别为7.44%、7.72%、7.45%、7.50%、7.31%、7.28%,其RSD值为2.11%,较小,符合含量分析要求.3.5 加标回收率加标回收率在96.98%～99.59%,结果见表2.3.6 样品制备条件的选择3.6.1 提取方法的选择用甲醇作溶剂,常规回流法(粒度30目,80℃水浴,料液比1∶8,提取3次,每次2 h),测得相对百分含量为5.59%(RSD值为2.00%,n=3);超声波提取(粒度30目,80℃水浴,料液比1∶8,提取3次,每次30 min),测得相对百分含量为6.76%(RSD值为2.15%,n=3).结果表明,超声提取法测得含量更高,故选择用超声提取方式,实验数据见表3.3.6.2 提取溶剂的选择考察水,质量分数分别为50%、75%和95%的乙醇、甲醇、乙酸乙酯6种溶剂对提取率的影响(30目黑骨藤药材,料液比1∶20,温度50℃,时间30 min,超声提取两次),结果表明黄酮含量在质量分数为50%乙醇中最高,平均值为7.37% (RSD值为2.47%,n=3),实验数据见表4.3.6.3 提取温度的选择考察在30～70℃不同温度下对提取率的影响(30目黑骨藤药材,质量分数为50%乙醇提取,料液比1∶20,时间30 min,超声提取两次),结果表明温度曲线的总体趋势是:温度越高,总黄酮提取率越高.但由于温度太高,溶剂易挥发,所以没有进行更高温度的考察,选择70℃为提取温度,见图1所示.3.6.4 提取时间的选择考察提取时间在5～45 min之间对提取率的影响(30目黑骨藤药材,质量分数为50%乙醇提取,料液比1∶20,温度70℃,超声提取两次),结果表明总黄酮提取率在30 min达到最大值,故选择30 min为最佳提取时间,结果见图2.3.7 样品含量测定结果3.7.1 黑骨藤不同部位的总黄酮含量比较分别精确称取一定量采自2006年西昌黑骨藤的根、茎、叶,按步骤2.4进行测定,结果见表5.结果显示茎的含量最高,而民间用药部位一般都用其茎.3.7.2 黑骨藤茎不同年份以及不同产地总黄酮含量比较对2005～2007年采自不同产地的黑骨藤植物的茎进行总黄酮含量测定,按步骤2.4进行测定,结果见表6.含量测定结果表明,青城山的含量最高,分别与贵阳和西昌的差异呈极显著水平,而贵阳与西昌之间差异不显著.不同产地样品的总黄酮含量随着放置时间的增长都呈逐渐降低的趋势.黑骨藤主要分布于我国的东北、华北、西北、西南等地区[9],在四川的资源十分丰富.本文对贵州贵阳、四川西昌、四川成都青城山3地不同年份的样品分别进行了黄酮含量的测定.从结果来看,对于不同部位黄酮含量在黑骨藤的茎中含量较高,对于不同产地四川青城山的含量最高,而且随着贮存年份的增加,黄酮含量在逐渐降低.四川青城山与贵阳和西昌的黄酮含量的差异分别呈极显著水平.同时证明本法良好的稳定性、重现性,具有高精密度、高回收率,可用于本药材的质量控制.本课题组也对黑骨藤的小鼠抗炎作用进行了相关的研究,相关研究结果另文发表.结果表明药效与黄酮含量在一定的范围内呈量效关系,黄酮含量越高,抗炎作用越明显.以上研究可以为这种中药材资源的综合应用提供一定的理论依据.【相关文献】[1]Toki wa T,Harada K,Matsumura T.Orientalmedicinal herb,Periploca sepium,extract inhibits growth and I L-6 production of human synovial fibroblast-like cells[J].Biol Pharm Bull,2004,27(10):1691-1693.[2]陈庆,靳凤云,陈华国,等.苗族黑骨藤有效部位的筛选研究[J].中国民族民间医药志,2005,74:163-165.[3]王和鸣,葛继荣,陈治英.黑骨藤追风活络胶囊治疗痹病的临床研究[J].中国中医骨伤科杂志,1999,7(2):12-14.[4]KjerJ,W rayV,Edrada-EbelR,et al.XanaltericAcids Iand IIand Related Phenolic Compounds from an EndophyticA lternar2 iasp.Isolated from theMangrove PlantSonneratia alba[J].J Nat Prod,2009,72(11):2049-2052.[5]LiWei,Fu Hong-wei,Bai Hong,et al.Triterpenoid saponins fromRubusellipticusvar.obcordatus[J].J Nat Prod,2009, 72(10):1755-1760.[6]Lemma-Gray P,Valusova E,Carroll C A.Subunit analysis of bovine heart complex I byreversed-phase high-perfor mance liquid chromatography,electrospray ionization-tandem mass spectrometry,and matrix-assisted laser desorption/ionizationtime-of-flightmass spectrometry[J].AnalBiochem,2008,382(2):116-121.[7]Bajad S,ShulaevV.Highly-parallelmetabolomics approaches usingLC-MS2 for pharmaceutical and environmental analysis[J]. TrendsAnalyt Chem,2007,26(6):625-636.[8]张援虎,陈东林,王锋鹏.黑龙骨中两个新强心苷的结构鉴定[J].有机化学,2006,26(3):329-332.[9]张援虎,杨亚婷,陈东林等.黑龙骨化学成分成分的研究[J].中草药,2006,37(3):345-347.[10]Wang Tian-song,Zhang Yi,ChenWei-bin,et al.Reconstructed protein arrays from 3D HPLC/tandem mass spectrometry and 2D gels:complementary approaches toPorphyromonas gingivalisprotein expression[J].The Analyst,2002,127(11):1450-1456. [11]田新玲,晏佩霞,仝殿荣.分光光度法测定天然植物中黄酮含量[J].仪器仪表与分析监测,2003(3):25-26.[12]Sakuma S,Kawanishi S,Shoji J.Con-stituents of Chinese crude drug“wujiapi”[J].Chem Phar m 7BullⅨ,1980,28(1):163.[13]王立为,刘新民,余世春,等.枇杷叶抗炎和止咳作用研究[J].中草药,2004,35(2):174-176.。
苗药黑骨藤中含总黄酮及总皂苷量测定
苗药黑骨藤中含总黄酮及总皂苷量测定郭江涛;刘杰;黎正旭;徐红应【摘要】建立苗药黑骨藤中含总黄酮及总皂苷量测定的方法.结果表明,芦丁标准对照品在2.230~44.600 mg/L范围内线性关系良好,回归方程为Y=11.087X-0.0125(r=0.9992);齐墩果酸在8.080~40.400 mg/L范围内线性关系良好,回归方程Y=49.13X-0.0138(r=0.9998).该方法快速简便,结果可靠,可用于黑骨藤中含总黄酮及总皂苷的量测定,为黑骨藤的质量标准研究提供依据.%To establish a method for determination of total flavonoids and total saponin content of Periploca Forrestii Schltr.Results indicated the range linear has good relationship between 2.230~44.600 mg/L, the regression equation wasY=11.087X-0.0125 ( r=0.9992);when oleanolic acid in 8.080 ~40.400 mg/L linear regression equation , Y =49.13X -0.0138 (r=0.9998).This method was simple, reliable and can be used for the determi-nation of total flavonoids and saponin content in Periploca forrestii Schltr, provided the basis for the quality standard of Periploca Forrestii Schltr.【期刊名称】《哈尔滨商业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(034)003【总页数】4页(P277-280)【关键词】黑骨藤;紫外可见分光光度法;总黄酮;总皂苷【作者】郭江涛;刘杰;黎正旭;徐红应【作者单位】贵阳中医学院药学院,贵阳550025;贵阳中医学院药学院,贵阳550025;贵阳中医学院药学院,贵阳550025;贵阳中医学院药学院,贵阳550025【正文语种】中文【中图分类】R284通迅作者：刘杰(1985-)，女，博士，讲师，研究方向：中药创新药物研究.E-mail:****************黑骨藤是贵州十大苗药之一，为萝藦科(Asclepiadaceae)杠柳属(Periploca)植物黑龙骨(PeriplocaforrestiiSchltr.)的干燥根或全株[1].黑骨藤全株入药，具有通经、活血、解毒、祛风的功效，主治风湿关节痛[2-3]、跌打损伤、伤口愈合[4]、月经不调等症，但具有一定的肝毒性[5].是广泛应用于治疗闭合性软组织损伤、风湿与类风湿等疾病的民族药[6].主要分布于贵州、青海、广西、西藏等地.黑骨藤收载于2003年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》[7]，该标准中主要记载了黑骨藤的来源、性状、显微鉴别以及理化鉴别，缺乏黑骨藤质量控制的有效方法.目前国内外对黑骨藤质量控制方面研究也较少.黑骨藤中主要含有强心苷类、C21甾类、多糖类、黄酮类和三萜皂苷类等成分[8-12].黑骨藤抗炎作用[13]与其黄酮类[14]、皂苷类[15]及糖类成分[16]有密切联系，本试验以芦丁及齐墩果酸为对照品，运用紫外可见分光光度法，对黑骨藤中含总黄酮及总皂苷进行了测定，为其质量标准以及进一步开发利用提供了理论依据.1 仪器与试药UV-5900型分光光度计(上海元析仪器有限公司)，ME-204E型分析天平(梅特勒托利多仪器有限公司)，SK8200H型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)，SHE-Ⅲ型循环水真空泵(上海荣亚生化仪器厂)，98-1-B型单子调温电热套(天津市泰斯有限公司)，GZX-9240MBE数显恒温水浴锅(上海双捷实验设备有限公司)，DZF-6050型真空干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司).芦丁对照品(中国药品生物制品检定所，批号10080-200707)，齐墩果酸对照品(中国食品药品检定研究所，批号110709-201206)，黑骨藤药材经由贵阳中医学院孙庆文教授鉴定为萝藦科杠柳属植物黑骨藤.所用试剂为分析纯，水为超纯水.2 实验方法与结果2.1 黑骨藤总黄酮及总皂苷的测定2.1.1 对照品溶液的制备芦丁对照溶液：精密称取芦丁对照品0.002 23 g，用甲醇溶解配制为质量浓度为0.223 mg/mL的溶液.齐墩果酸对照溶液：精密称取齐墩果酸对照品0.010 10 g，用甲醇溶解配制为质量浓度为0.202 mg/mL的溶液.2.1.2 测定方法及波长选择芦丁测定方法及波长选择：精密移取上述芦丁储备液于10 mL容量瓶中，分别加入0.3 mL质量分数为5%亚硝酸钠溶液，摇匀，放置6 min后加入0.3 mL质量分数为10%硝酸铝溶液，摇匀，放置6 min后加入4 mL质量分数为4%的氢氧化钠溶液，用甲醇定容至刻度，摇匀，静置20 min.在200～600 nm波长进行吸收光谱扫描，选取最大吸收波长为510 nm，芦丁对照品扫描图谱见图1.图1 芦丁波长扫描图齐墩果酸测定方法及波长选择：精密移取上述齐墩果酸储备液于5 mL容量瓶中，水浴挥干溶剂，分别加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸溶液，75 ℃水浴中加热20 min，取出后立即用冰水冷却10 min，再加入4 mL冰醋酸定容，摇匀.以甲醇同法制备空白参比.在400～800 nm波长进行扫描，选取最大吸收波长为550 nm.齐墩果酸对照品扫描图谱见图2.图2 齐墩果酸波长扫描图2.1.3 供试品溶液的制备按L9(34)设计的实验.将10 g药材按要求进行提取，浓缩后用甲醇定容至20 mL，取0.1 mL定容到10 mL.2.1.4 芦丁标准曲线的制作精密移取上述储备液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mL于10 mL容量瓶中，按2.3.1依法操作.以甲醇同法制备空白对照，以芦丁质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标.由实验结果得出回归方程为Y=11.087X-0.012 5(r=0.999 2)，线性范围为2.230～44.600 mg/L.2.1.5 齐墩果酸标准曲线的制作精密吸取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于5 mL容量瓶中，按2.3.2依法操作.以甲醇同法制备空白对照.以齐墩果酸质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，由实验结果得出回归方程Y=49.13X-0.013 8(r=0.999 8)，线性范围为8.080～40.400 mg/L.2.1.6 精密度试验精密吸取1.0 mL芦丁对照品溶液，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度线，制成0.022 3 mg/mL对照品溶液，按“2.1.4”项方法操作，于510 nm处测定吸光度测定6次，计算对照品的RSD值为1.37%.精密吸取齐墩果酸对照品溶液0.6 mL，置5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度线，制成0.024 24 mg/mL对照品溶液，按“2.1.5”项方法操作，于550 nm处测定吸光度测定6次，计算对照品的RSD值为1.54%.2.1.7 稳定性试验取精密度项下(芦丁)的第3号样品按“2.1.4”项方法操作，于0、6、12、24、48 h测定吸光度，结果RSD为1.05%，对照品溶液在48 h内基本稳定.取精密度项下(齐墩果酸)的第3号样品按“2.1.5”项方法操作，于0、6、12、24、48 h测定吸光度，结果RSD为1.72%，对照品溶液在48 h内基本稳定.2.1.8 重复性实验平行吸取6份1.0 mL芦丁对照品溶液，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度线，制成0.022 3 mg/mL对照品溶液，制备供试品溶液，按“2.1.4”项方法操作，测定计算RSD为1.49%，表明重现性良好.平行吸取6份0.6 mL齐墩果酸对照品溶液，置5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度线，制成0.024 24 mg/mL对照品溶液，制备供试品溶液，按“2.1.5”项方法操作，测定计算RSD为1.68%，表明重现性良好.2.1.9 加样回收率试验精密称取已知量的同一批样品9份，按照高、中、低剂量加入芦丁对照品，按照“2.1.4”项方法操作并测定，结果平均回收率为99.70%，RSD为1.01%.精密称取已知量的同一批样品9份，按照高、中、低剂量加入齐墩果酸对照品，按照“2.1.5”项方法操作并测定，结果平均回收率为99.28%，RSD为2.03%. 2.2 正交设计2.2.1 样品含量测定采用L9(34)正交实验法设计实验，以含总黄酮和总酚酸量为考察指标，以乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取次数作为考察因素，各因素取3个水平进行考察，各因素水平见表1.表1 正交试验的因素与水平水平乙醇体积分数/%(A)料液比(B)提取时间/min(C)提取次数(D)1601∶630 12701∶860 23801∶109032.2.2 结果分析采用紫外可见分光光度法对样品中的总黄酮及总酚酸进行测定(结果见表2).验证直观分析结果，对正交试验结果进行了方差分析，见表 3.表2 正交考察表序号因素ABCD总黄酮百分含量/%总皂苷百分含量/%综合评分/%1601∶63016.284.8011.082601∶86025.295.9411.233601∶109035.055.46 10.514701∶66038.197.2015.395701∶89014.064.498.556701∶103025.725.7 111.437801∶69024.835.6810.518801∶83035.856.2312.089801∶106013.72 4.648.36k110.94012.32711.5309.330k211.79010.62011.66011.057k310.3171 0.1009.85712.660R1.4732.2271.8033.330表3 方差分析因素偏差平方和自由度F比F临界值显著性溶剂溶度3.28220.3854.460料液比8.14120.9544.460提取时间6.06920.7114.460提取次数16.64121.9504.460误差34.138注： F0.05(2, 2) =19.00; F0.01(2, 2) =99通过直观分析和方差分析，影响因素的主次顺序为:提取次数>料液比>提取时间>溶剂溶度.最佳提取条件为A2B1C2D3，即用6倍量70%乙醇回流提取3次，每次60 min.2.3 验证实验取3批样品，按照由上述实验确定的最优提取实验方案，使用紫外分光光度法测量所得3次提取物中总黄酮含量的平均值为8.071%、7.941%、7.933%，总酚酸含量的平均值为7.241%、7.200%、7.103%，表明所选最优工艺提取效果良好.3 结语L9(34)正交实验法具有科学性、准确性，本实验通过比较乙醇体积分数、料液比、提取时间和提取次数，以含总皂苷及总黄酮量为测量指标，用紫外分光光度法，优化提取工艺.黄酮类及皂苷类是黑骨藤的主要有效成分.实验结果表明，4个因素中对提取效率影响较大的因素是提取次数及料液比.在实验范围内，提取次数越多，乙醇用量越大，总黄酮及总皂苷的提取率越高.而乙醇体积分数和提取时间比较不明显，可能和乙醇挥发，提取剂质量浓度降低有关.本实验通过对黑骨藤中总黄酮及总皂苷两大类化学成分的研究，加强了对黑骨藤质量标准的控制和进一步的开发利用.参考文献：[1] 刘明, 刘刚, 刘育辰, 等. 黑骨藤镇痛抗炎作用活性部位筛选[J]. 药物评价研究, 2014, 37(4): 322.[2] BAO C, LIU Y, SUN X, et al. Periploca forrestii saponin ameliorates CIA via suppressing proinflammatory cytokines and nuclear factor kappa-B pathways[J]. PLoS One, 2017, 12(5): e0176672.[3] CHEN L, LI J, KE X, et al. The therapeutic effects of Periploca forrestii Schltr. Stem extracts on collagen-induced arthritis by inhibiting the activation of Src/NF-κB signa ling pathway in rats[J]. J Ethnopharmacol, 2017, 202: 12-19.[4] CHEN L, LI J, KE X, et al. Chemical profiling and the potential active constituents responsible for wound healing in Periploca forrestii Schltr[J]. J Ethnopharmacol, 2018, doi: 10.1016/j.jep.2018.04.023.[5] 冯剑春,王华雨,周安琪,等. 中药黑骨藤致药物性肝损伤22例临床分析[J].中华肝脏病杂志, 2016, 9: 692-695.[6] 吕苏珊, 赵超. 基于生物酶技术的黑骨藤皂苷类成分提取工艺及抗炎活性评价研究[D]. 贵阳: 贵州师范大学, 2016: 1-11.[7] 贵州省中药材、民族药材质量标准[M]. 贵阳: 贵州科技出版社, 2003. 381.[8] FENG J, ZHAO W. Complete 1H and 13C NMR assignments of four new oligosaccharides and two new glycosides from Periploca forrestii[J]. Magn Reson Chem, 2009, 47(8): 701-705.[9] 甘秀海, 周欣, 赵超, 等. 黑骨藤化学成分的研究[J]. 中草药, 2009 , 40(5): 708-710.[10] 徐冉, 张援虎, 赵延涛. 黑骨藤化学成分的研究[J]. 中国药学杂志, 2011 ,46(11): 823-825.[11] 赵珊, 张宝, 熊丹丹, 等. 苗药黑骨藤的化学成分研究[J]. 中草药, 2017, 8: 1513-1518.[12] 甘秀海, 周欣, 赵超, 等. 黑骨藤化学成分及药理作用研究进展[J]. 广东化工, 2012, 39(9): 20-21.[13] 廖作庄, 杨凤莲, 王俊利, 等. 黑骨藤药理作用研究进展[J]. 右江医学, 2014,42(3): 361-362.[14] LIANG Q, CHEN H, ZHOU X, et al. Optimized microwave-assistant extraction combined ultrasonic pretreatment of flavonoids from Periploca forrestii Schltr. and evaluation of its anti-allergic activity [J]. Electrophoresis, 2017, 38(8): 1113-1121.[15] LIU Y, LI M, HE Q, et al. Periploca forrestii saponin ameliorates murine CFA-induced arthritis by suppressing cytokine production [J]. Mediators Inflamm, 2016(1-2): 7941684.[16] FENG J, ZHANG R, ZHOU Y, et al. Immunosuppressive pregnane glycosides from Periploca sepium and Periploca forrestii [J]. Phytochemistry, 2008, 69(15): 2716-2723.。