siRNA干扰常见问题
sirna干扰原理
sirna干扰原理
sirna干扰原理是一种利用小分子rna来抑制目标基因表达的方法。
sirna是一种由21-23个核苷酸组成的双链rna分子，它能
与目标基因的mRNA相互作用，导致mRNA降解或抑制转录，从而阻止目标基因的表达。
sirna干扰的过程可以分为三个主要步骤：选择合适的sirna序列、转染sirna到细胞中以及sirna与目标基因mRNA的相互
作用。
首先，为了选择合适的sirna序列，需要找到目标基因mRNA
上的特定区域，该区域的序列将与sirna形成互补配对。
这样，sirna可以与目标基因mRNA结合并形成稳定的双链结构。
其次，将设计好的sirna序列通过转染等方法引入细胞内。
一
般来说，sirna通常会与转染试剂结合形成复合物，以提高
sirna进入细胞的效率。
最后，一旦sirna进入细胞内，它会与目标基因mRNA发生互
补配对，形成sirna/mRNA复合物。
这个复合物会被RNA内
切酶识别并降解，或者阻止目标基因mRNA进行翻译和转录
过程，从而最终抑制目标基因的表达。
总的来说，sirna干扰原理是通过将特定的小分子rna序列引入细胞内，与目标基因mRNA相互作用，从而抑制目标基因的
表达。
这种方法在基因功能研究、治疗疾病以及生物技术等领域都有广泛的应用潜力。
siRNA干扰EGFR表达对食管鳞癌和腺癌细胞放射敏感性影响重点
ＯＥ－１９
Ｌ／Ｊｉａｎｃｈｅｎｇ，Ｑｉｕ
Ｚｉｄａｎ，Ｐａｎ Ｄｉｎｇｌｏｎｇ，Ｚｈｕａｎｇ Ｌｉｚｈｅｎ，Ｃａｉ
Ｌｙｕｊｕａｎ，Ｓｕ
Ｙｉｎｇ，Ｚｏｕ Ｃｈａｎｇｙａｎ
ｏｆ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｆｕｊｉａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｔｕｍｏｒ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｕｊｉａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｆｕｊｉａｎ ３５００１４，Ｃｈｉｎａ
至ＰＶＤＦ膜上．用３％ＢＳＡ封闭蛋白１ ｈ。一抗４℃
摇床孵育过夜，二抗室温摇床孵育１ ｈ。使用ＥＣＬ 化学发光试剂于暗室中曝光显影８
ｍｉｎ。
６．ＣＣＫ８法检测转染对细胞增殖影响：取指数生 １．细胞系和主要试剂：Ｅｃａｌ０９、ＯＥ．１９细胞购自 中国科学院上海细胞研究所。常规培养于３７℃、 ５％ＣＯ，浓度的恒湿培养箱中。ＲＴ．ＰＣＲ试剂盒购于
【摘要】
目的探讨ｓｉＲＮＡ干扰ＥＧＦＲ表达对食管鳞癌和腺癌放射敏感性的影响。方法
以
食管鳞癌、腺癌细胞系ＥＣａ．１０９、ＯＥ一１９作为研究对象。脂质体转染化学合成的不同ＥＧＦＲ—ｓｉＲＮＡ和 阴性一ｓｉＲＮＡ，通过ＲＴ—ＰＣＲ及蛋白印迹法检测转染前后ＥＧＦＲ表达情况，ＣＣＫ８法分析转染对细胞增 殖活性影响。设ＥＣａ．１０９、ＯＥ．１９细胞空白对照组（Ｏｌ、０２组）、单纯照射组（Ｒｌ、Ｒ２组）及ＥＧＦＲ． ｓｉＲＮＡ照射组（Ｅ．Ｒ１、Ｅ．Ｒ２组），单次照射０、２、４、６、８ Ｇｙ。克隆形成实验计算细胞存活分数及放射增 敏比（ＳＥＲ肿僖比），流式细胞仪检测ＥＧＦＲ．ｓｉＲＮＡ联合放射对细胞周期分布和细胞凋亡率影响，单次照 射６ Ｇｙ。结果ＥＧＦＲ—ｓｉＲＮＡ可明显下调两种细胞ＥＧＦＲ表达，且转染对细胞增殖抑制率＜５％ （４．９％、４．５％）。克隆形成实验结果显示Ｅ—Ｒ１、Ｅ—Ｒ２组细胞ｓＦ值低于０１、０２组，ＳＥＲ。）ｆ直比分别为 １．４０、１．０ｌ。流式细胞术结果显示Ｅ．Ｒ１组比Ｅ．Ｒ２组照后Ｇ，＋Ｍ期比例增加、ｓ期比例下降（Ｐ＝ ０．０１６、０．０２８），细胞凋亡率也增高（Ｐ＝０．００７）。结论与食管腺癌细胞相比，干扰ＥＧＦＲ表达显著提 高了食管鳞癌细胞的放射敏感性。
RNA干扰技术的实验技巧与常见问题解答
RNA干扰技术的实验技巧与常见问题解答RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）是一种重要的分子生物学研究技术，广泛应用于基因功能分析、疾病治疗等领域。
在RNA干扰实验中，研究人员可以通过引入特定的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）或微小核糖核酸（microRNA，miRNA）来抑制或沉默目标基因的表达。
本文将介绍RNA干扰实验的一些关键技巧，并回答一些常见问题，旨在帮助读者更好地开展RNA干扰实验。
一、实验技巧1. 选择合适的靶基因和控制组在进行RNA干扰实验之前，首先需要确定要研究的靶基因。
该靶基因最好具有研究价值，并且对其功能了解较少。
同时，为了验证RNA干扰的特异性和效果，还需要设计合适的阴性对照组和阳性对照组。
阴性对照组可选择与靶基因序列无关的小干扰RNA或一个无关的基因作为靶点；阳性对照组则可选择确切知道RNA干扰会对其表达产生影响的基因。
2. 合理设计siRNA或miRNA序列在设计干扰序列时，可使用在线生物信息学工具或商业公司提供的设计工具，遵循以下原则：a）长度通常为19-23个核苷酸，一般选择21个核苷酸长度；b）确保序列中包含稳定的核苷酸序列，以提高干扰效果；c）避免序列与其他基因有任何类似区域，以确保干扰的特异性。
3. 选择适当的转染试剂与条件RNA干扰实验中常用的转染试剂包括化学法、电转法和病毒载体转染法。
在选择转染试剂时，需根据实验的需求和细胞类型进行选择。
另外，转染条件的优化也很关键，如浓度、时间和转染温度等，可对不同细胞类型进行优化。
4. 时间点和干扰效果的监测RNA干扰的效果通常在转染后24-72小时达到峰值，但不同细胞类型和靶基因可能有所不同。
因此，在进行RNA干扰实验时，需对不同时间点进行监测，以确定最佳时间点。
常用方法包括荧光显微镜观察siRNA或miRNA的共转染效率、Western blot或RT-qPCR检测蛋白质或基因的表达水平。
sirna干扰原理
sirna干扰原理Sirna（small interfering RNA）是一种干扰RNA，它可以通过靶向特定的mRNA分子来抑制基因表达。
Sirna干扰技术在基因沉默和功能研究中具有重要的应用价值。
本文将介绍Sirna干扰的原理及其在生物学研究中的应用。
Sirna干扰的原理主要包括三个步骤，合成、靶向和介导。
首先，Sirna分子由双链RNA组成，可以通过化学合成的方法获得。
其次，Sirna通过其特定的序列可以与靶向的mRNA分子形成互补配对，从而导致mRNA的降解或翻译的抑制。
最后，Sirna需要介导蛋白来帮助其与靶向mRNA结合，并将其导入RNA诱导靶向基因沉默复合物（RISC）中，从而实现对基因表达的干扰。
在生物学研究中，Sirna干扰技术被广泛应用于基因功能研究、药物靶标筛选和疾病治疗等领域。
首先，通过设计特定的Sirna序列，研究人员可以选择性地抑制目标基因的表达，从而揭示其在细胞生物学过程中的功能。
其次，Sirna干扰技术可以用于筛选潜在的药物靶标，通过观察靶向基因的沉默对细胞表型的影响，来评估潜在药物的疗效和副作用。
此外，Sirna还可以作为一种治疗手段，用于治疗一些基因相关的疾病，如癌症和遗传性疾病。
总的来说，Sirna干扰技术具有高度的选择性和特异性，可以有效地抑制目标基因的表达，为基因功能研究和药物开发提供了有力的工具。
随着技术的不断发展，Sirna干扰技术在生物学研究和临床应用中的作用将会更加突出，为人类健康和疾病治疗带来新的希望。
在实际应用中，研究人员需要根据具体的研究目的和样本特点来设计合适的Sirna序列，并选择合适的转染方法将其导入到细胞内。
此外，还需要对靶向基因的沉默效果进行验证，以确保实验结果的可靠性。
在临床应用中，研究人员需要克服Sirna的稳定性和递送效率等方面的挑战，以实现其在治疗疾病中的应用。
综上所述，Sirna干扰技术作为一种强大的基因沉默工具，在生物学研究和临床应用中具有重要的意义。
siRNA干扰载体构建与引物设计的一些小建议
siRNA干扰载体构建与引物设计的一些小建议siRNA干扰载体构建过程中，针对siRNA设计的引物是怎么设计的?
一般是合成一对引物，然后退火，再与线性化的载体做连接。
由于引物比较长，所以合成
时一般都会有比较多的碱基突变，因此，做shRNA表达载体构建的主要难度，在于筛选出正确
的克隆，有时候可能要选很多个克隆测序才能筛到想要的。
具体的序列组成，一般是sense-
loop-antisense。
不同的公司会有不同的设计原则的。
经验：我们一般不去考虑构建载体来得到siRNA！载体表达siRNA方法主要存在以下缺
点： 1、外源导入shRNA的表达会干扰细胞本身miRNA的正常表达，而miRNA在基因的精确表
达调控方面有着至关重要的作用，目前已经证实很多疾病的产生通miRNA的表达异常存在确切
关系，已有很多文献报道和证实； 2、载体构建的周期长，操作较为复杂，试验重复性不好，
做过的人应该大多都知道； 3、载体用于体内试验的毒性非常大，容易激发机体强烈的免疫应
答反应，副作用大，已有多篇文献证实； 4、通量低，影响因素更多，体内试验的效果很差，
存在安全性的问题； 5、shRNA的表达在时间和表达量上都较难控制等。
这也是为什么现在
10多种进入临床试验的RNAi药物几乎都是用化学合成的siRNA来做的原因！。
siRNA转染常见问题及解决方案
siRNA转染常见问题及解决方案1. RNA与转染试剂比例不佳由于RNA序列差异、合成条件不同以及是否带有荧光等标记，决定了RNA和转染试剂在不同情况下会有不同的最佳条件，建议先进行预实验优化。
RNA浓度和转染试剂量的优化(24well)1 2 3 4RNA工作25nM 50nM 100nM 150nM浓度每孔RNA0.17μg(12.5pmol)0.33μg(25pmol)0.67μg(50pmol)1μg(75pmol)的量(pmol)每孔转0.25μl0.5μl1μl 1.5μl染试剂量2. 细胞密度不佳调整细胞密度到转染时汇合度为20-40%。
成功转染siRNA的细胞会产生目标基因表达下调，但未成功转染的细胞却不受影响，这时转染效率和总的细胞数量就很重要，一般细胞数量较少时转染效率高。
由于siRNA沉默时效性的影响，转染后48小时才能进行进行qRT-PCR检测，转染后48-72小时才能进行蛋白检测。
如果转染时铺板密度较高，细胞一方面转染效果不理想，直接影响沉默效果和数据可靠性，另一方面，48小时甚至更长时间后，沉默检测最佳点时，过于密集的细胞将影响细胞状态，从而影响实验结果。
3. RNA效率不高选择最优RNA，并采用已知高效的RNA做对照。
siRNA的合成需要注意的是一定要选用高纯度的siRNA，siRNA的纯度直接关系到转染效率和沉默效率。
siRNA的工作浓度和siRNA的设计、细胞种类、目标基因有关。
建议一定进行相关的预实验优化各条件。
4. RNA酶污染建议无RNA酶和内毒素的吸头、离心管和溶液等材料和实验器具。
5. 转染后培养时间不够在mRNA水平可以到48小时以后验证结果，在蛋白水平可以到72小时后验证结果。
siRNA的沉默效果是有时效性的，在最佳的时间点观察，会得到更加明显的沉默效果，这个时间点的确定不能以同一株细胞转染DNA的经验确定，因为一个是消耗mRNA，一个是产生mRNA。
sirna干扰原理
sirna干扰原理
sirna是small interfering RNA的缩写，是一种功能性RNA分子，通过降解或抑制特定基因的表达来干扰基因功能。
sirna
干扰的原理主要包括三个步骤：
1. 制备sirna：sirna是由21-23个核苷酸组成的小分子RNA，
可以由体内或体外合成。
通常使用合成的单链RNA，并使用
特定酶进行降解，获得双链sirna分子。
2. 靶向特异性基因：为了使sirna能够特异性地干扰目标基因，需要对目标基因进行序列特异性设计。
sirna的两个链，即导
引链和非导引链，会与靶基因的mRNA序列互补配对。
3. RNA干扰效应：当sirna与靶基因的mRNA配对后，可以
通过两种方式干扰目标基因的功能。
- 解旋和降解：sirna可以与RNA诱导的靶基因降解酶（RISC）结合，形成RNA酶复合体。
该复合体能够通过降解
靶基因的mRNA分子，从而阻止靶基因的翻译和表达。
- 抑制翻译：sirna也可以通过与靶基因的mRNA配对，阻止
其翻译为蛋白质。
sirna结合到mRNA上后，可以阻断转录过
程中的酶或蛋白质结合，从而抑制翻译的进行。
总结来说，sirna干扰的原理是通过合成特异性的小分子RNA，与靶基因的mRNA相互作用，从而降解或抑制目标基因的表
达。
这一技术在基因功能研究和治疗疾病中具有广泛应用的潜力。
siRNA干扰Rac1表达对人晶状体上皮细胞增殖和迁移能力的影响
siRNA干扰Rac1表达对人晶状体上皮细胞增殖和迁移能力的影响目的研究Rac1对人晶状体上皮细胞SRA01/04增殖和迁移能力的影响，探究Rac1在后囊下混浊及囊袋皱缩综合征发生、发展过程中的作用。
方法将SRA01/04细胞分为Mock组和siRac1组，构建Rac1相关siRNA并瞬时转染于siRac1组细胞中，Western blot检测Rac1蛋白表达的变化，CCK检测细胞生长周期的变化，流式细胞术检测细胞周期、细胞凋亡变化，Transwell检测Rac1对细胞迁移能力的影响。
结果两组72 h时吸光度值均高于24 h（P < 0.05），siRac1组48、72 h时吸光度值均低于Mock组（P < 0.05）；与Mock组比较，siRac1组mRNA和蛋白相对表达量明显降低，G1期细胞所占百分率明显增高，S期细胞所占百分率明显降低，穿越基质膜的细胞数明显减少，差异均有统计学意义（P < 0.05）。
F-actin染色结果显示，siRac1组细胞的伪足形成能力较Mock组减弱。
结论Rac1可能通过调节晶状体上皮细胞的增殖能力和迁移能力，影响后囊下混浊及囊袋皱缩综合征的发生、发展。
[Abstract] Objective To study the effect of Rac1 on the proliferation and migration of human lens epithelial cells SRA01/04，and to explore the role of Rac1 in the development and progression of posterior capsular opacities and capsular contraction syndrome. Methods SRA01/04 cells were divided into mock group and siRac1 group. Rac1-related siRNA was constructed and transiently transfected in siRac1 group cells. Western blot was used to detect the changes of Rac1 protein expression，CCK was used to detect the changes of cell growth cycle，flow cytometry was used to detect the cell cycle and apoptosis，Transwell was used to detect the effect of Rac1 on cell migration ability. Results The absorbance values of the two groups at 72 hours were higher than those at 24 hours （P < 0.05），the absorbance values of siRac1 group at 48，72 hours were lower than those of mock group （P < 0.05）. Compared with mock group，the relative expression of mRNA and protein in siRac1 group decreased significantly，the percentage of G1 phase cells increased significantly，while the percentage of S phase cells decreased significantly，the number of cells passing through the membrane reduced significantly，the differences were statistically significant （P < 0.05）. F-actin staining showed that the forming ability of pseudopodium in siRac1 group was significantly weaker than that of mock group. Conclusion Rac1 may affect the occurrence and development of posterior capsular opacities and capsular contraction syndrome through adjusting the proliferation and migration of lens epithelial cells.[Key words] Posterior capsular opacities；Capsular contraction syndrome；Rac1；Lens；Epithelial cells后囊下混濁（posterior capsular opacities，PCO）和囊袋皱缩综合征（capsular contraction syndrome，CCS）是白内障超声乳化术后常见并发症，其发生与发展均与白内障术后残留晶状体上皮细胞的增殖与迁移有关[1-2]。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
siRNA干扰常见问题
Q:如何选择转染方法和转染试剂？
A:我们的siRNA适用于各种转染方法。
转染方法和转染试剂的选择，需要根据细胞来选择，对于容易转染的细胞，常用的转染方法是脂质体转染。
Q:对于难转染的细胞，应该如何提高其转染效率？转染效率又该如何确定？
A:1)对于贴壁细胞，推荐采用转染试剂转染即可；2)对于难转染的细胞的转染，如何提高转染效率的问题也是目前研究的技术难题。
一般建议使用电转的方法，但是由于电转的方法对细胞损伤比较大，该方法也未必是最佳的。
转染效率的确定，常用的是使用荧光标记的siRNA，通过荧光显微镜，共聚焦显微镜，流式细胞仪检测的方法。
具体可以参考我们的产品说明书。
Q:细胞的转染效率是否与siRNA序列相关？
A:转染效率的高低取决于与细胞自身及转染方法，而于siRNA的序列并没有直接关系。
因此，siRNA在不同的细胞转染效率可能不一样。
Q:转染siRNA时候的细胞密度多少为宜？
A:依不同的转染方法或转染试剂而定。
如使用lipofectamine 2000作为转染试剂，单独转染siRNA，30%～50%密度较佳；而siRNA与质粒共转染，密度可以到80%-90%。
Q:siRNA转染时的培养基要求，可否含血清？
A:不同的转染试剂可能有不同的要求，对于lipofectamine 2000，在配制siRNA和lipofectamine 2000混合物时不能含有血清，但细胞培养基可以含有血清，但不能含有抗生素。
Q:siRNA的储存液体浓度和工作浓度有何区别？
A:siRNA的贮存浓度就是保存的最佳浓度，锐博推荐的贮存液浓度为20 μM；而siRNA的工作浓度就是使siRNA能够达到最佳沉默效果的转染浓度，一般10～100 nM范围内，锐博生物推荐的转染浓度是50nM。
Q:转染时该如何分组？分组的目的是什么？
Q:为什么说阳性对照在RNA干扰实验中很重要？
A:阳性对照作为一个实验系统检查是很重要的。
也就是说，当您看到siRNA阳性对照的预期实验结果时，您能确保在您的实验方法中您的转染、RNA提取物和检测方法是可靠的。
Q:阳性对照及其阴性对照在RNAi实验中的作用？如何选择？
A:阳性对照指的是已经验证的针对看家基因或报告基因有效的siRNA，用于监测实验体系和实验方法的可行性。
我们可以提供的阳性对照siRNA有针对GAPDH，ACTB，GFP/EGFP有效的siRNA作为阳性对照，客户可以根据具体的实验需要选择。
阴性对照往往是非特异的siRNA，主要用于说明siRNA作用的特异性。
阴性对照的选
择可以是通用的序列（universal）或是随机打乱的序列（scramble），客户可以根据实验要求选择。
Q:用荧光对照siRNA如何检测转染效率？是不是每次实验都必须做？
A:我们提供的转染对照siRNA带有Cy3或Cy5荧光标记，可以通过荧光显微镜，共聚焦显微镜，流式细胞仪等荧光检测仪器检测。
除此之外，还应该通过阳性对照实验进一步确定。
转染效率的高低主要与细胞自身相关，同等实验条件下，每次转染细胞转染效率应该是相近的，因此可以不必每次都做。
但如果每次实验都做一个荧光对照组，将会更加便于排除一些实验问题。
Q:siRNA荧光染料的最大吸收率和发射率各在哪个波段？
A:FAM在495nm处有最大吸收率，在520nm处有最大发射率。
Cy3在550nm处有最大吸收率，在565nm处有最大发射率。
Cy5在643nm处有最大吸收率，在667nm处有最大发射率。
Q:转染后出现细胞死亡是什么原因？如何优化转染条件？
Q:到了转染时间发现细胞密度太低，该如时转染还是让细胞多长一天再转染？
A:细胞生长需要一定的密度，而转染试剂对细胞有一定的毒性，如果转染时细胞密度过低，细胞可能会因此生长异常甚至死亡。
转染前要求良好的细胞状态和细胞活性，一般也不建议用生长几天的细胞做转染。
Q:siRNA的作用效果应该如何检测？
A:通常可以从三个方面来相互验证siRNA的作用效果
1) 用Realtime RT-PCR方法，从mRNA水平检测：
2) 用Western blot，ELISA等方法，从蛋白水平的检测；
3）根据目的基因的功能，从细胞表型的水平检测。
Q:siRNA在细胞内可以作用多长时间？什么时候才是最好的检测时间？
A:siRNA介导的RNAi属于瞬时现象，不能稳定传代，一般其作用时间不可能维持很长时间，通常建议在转染后3~4天内完成检测。
最佳检测时间，因细胞、目的基因而异，多在转染后24~48小时之间检测。
Q:为什么要强调mRNA水平检测？可以直接检测蛋白和功能吗？
A:siRNA直接作用于mRNA，因此mRNA水平检测是最直接在指标。
很多客户认为，mRNA的降解直接的结果应该是对应蛋白质含量的下降，因此蛋白水平的检测结果也应该可以作为有效性的检测指标。
事实上，很多情况下往往出现，mRNA下降水平与蛋白下降水平不对应的现象。
其可能原因有：
1) 与选择的检测时间有关。
可能因mRNA的下降尚未反映在蛋白量的变化上或者未达到足以检测的水平，所以一般建议蛋白和功能检测时间要稍稍推后。
2) 与蛋白在细胞中的表达情况有关。
mRNA的翻译过程非常复杂，细胞内基因的表达总要维持一个平衡，某些蛋白表达量到一定的程度之后，足以维持其细胞功能，将可能暂时“关闭”表达的功能，转录出来的部分mRNA可能不参与蛋白翻译的过程，因此，mRNA水平的下调与蛋白水平下调并非完全成正相关的关系。
3) 可能还会涉及到更加复杂的机制。
Q:干扰效率多高才是好的靶点？
A:没有明确的界定，干扰效率高低因不同的细胞类型和不同的基因而异。
不同细胞类型的转染效率也不尽相同，不同基因的表达水平也相差较大，主要看干扰效果而定。
Q:沉默效果不理想，应该如何处理？
A:最常见的影响沉默效果的两个原因是：转染效率低和siRNA序列设计的效果不理想。
如果您初次使用siRNA或采用了新的细胞系，并发现沉默效果不佳，我们建议您对转染效率进行检测，并选择优化转染条件。
如果您已经对实验转染条件进行优化但是问题依然存在，我们建议您换用另一种转染试剂或是采用其他技术，这也许能提高转染效率。
如果已经提高了转染效率但是沉默效果仍然未达到
要求，可能是因为siRNA序列设计的效果不理想。
Q:siRNA反而使得目的基因表达上调了，这是什么原因？该怎么解决？
Q:我从阴性对照实验中得到和特异性RNAi相同的结果，这说明了什么？
Q:各组阴性对照的检测结果是否应该一样？如果偏差很大该怎么办？
A:正常情况下，各组阴性对照的检测结果应该是相近的。
如果偏差
过大，只需考虑实验结果的准确性。
另外，对于一些特定的基因，比如与细胞难受压力相关的基因，又如参与细胞免疫的基因，可能会对外界压力比较敏感，使得各组对照的基因表达发生变化不一致。
Q:用100nM 的siRNA转染时只得到50%沉默效率，我可以把siRNA 的浓度增加到200nM甚至400nM吗？
A:当干扰效率不佳时，可以在一定范围内适当优化转染浓度，通常优化的范围是10~150nM，但不宜过大，高浓度的siRNA将可能增加非特异性作用的可能性并对细胞产生毒性。
Q:同样的siRNA，为什么在细胞A很有效，在细胞B则没有效果？
A:不同细胞的转染效率不一样、基因表达水平也不一样，这些都与siRNA的作用效率有关。