第13章基因工程和基因组学
基因组学杨金水电子版 基因工程 电子版
基因组学杨金水电子版基因工程电子版导读：就爱阅读网友为您分享以下“基因工程电子版”的资讯，希望对您有所帮助，感谢您对的支持! 作者：吴乃虎出版社：高等教育出版社第一章基因工程概述第一节基因操作与基因工程一、基因操作与基因工程的关系二、基因工程的诞生与发展第二节基因工程是生物科学发展的必然产物一、基因是基因重组的物质基础二、DNA的结构和功能三、基因操作技术的发展促进基因工程的诞生和发展四、基因工程的内容第三节基因的结构——基因操作的理论基础一、基因的结构组成对基因操作的影响二、基因克隆的通用策略第一篇基因操作原理第二章分子克隆工具酶第一节限制性内切酶一、限制与修饰二、限制酶识别的序列三、限制酶产生的末端四、DNA末端长度对限制酶切割的影响五、位点偏爱六、酶切反应条件七、星星活性八、单链DNA的切割九、酶切位点的引入十、影响酶活性的因素十一、酶切位点在基因组中分布的不均一性第二节甲基化酶一、甲基化酶的种类二、依赖于甲基化的限制系统三、甲基化对限制酶切的影响第三节DNA聚合酶一、大肠杆菌DNA聚合酶二、KIenow DNA聚合酶三、T4噬菌体DNA聚合酶四、T7噬菌体DNA聚合酶五、耐热DNA聚合酶六、反转录酶七、末端转移酶第四节其他分子克隆工具酶一、依赖于DNA的RNA聚合酶二、连接酶三、T4多核苷酸激酶四、碱性磷酸酶五、核酸酶六、核酸酶抑制剂七、琼脂糖酶八、DNA结合蛋白九、其他酶第三章分子克隆载体第一节质粒载体一、质粒的基本特性二、标记基因三、质粒载体的种类第二节λ噬菌体载体一、λ噬菌体的分子生物学二、λ噬菌体载体的选择标记……第四章人工染色体载体第五章表达载体第六章基因操作中大分子的分离和分析第七章基因芯片技术第八章PCR技术及其应用第九章DNA序列分析第十章DNA诱变第十一章DNA文库的构建和目的基因的筛选第十二章基因组研究技术第二篇基因工程应用第十三章植物基因工程第十四章动物基因工程第十五章酵母基因工程第十六章细菌基因工程第十七章病毒基因工程第十八章医药基因工程第十九章基因工程产品的安全及其管理第一章基因工程概述第一节基因操作与基因工程一、基因操作与基因工程的关系基因操作（gene manipulation）：指对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。
13基因工程导论
…3‘ …3’ C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C
… 5’
DNA连接酶
DNA连接酶的基本性质
连接多个平头双链DNA分子：
5‘ … G-C-T-C-A-G-OH
P-C-T-G-G-A-G
…3‘ …3’ C-G-A-G-T-C-P
OH-G-A-C-C-T-C
… 5’
T4-DNA连接 酶
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G
… 5’
同裂酶：来源不同，识别顺序相同: HpaII和MspI 识别顺序为：CCGG，常为CCGG， C：
甲基化 甲基化碱基的敏感性差异： HpaII 敏感，
不能切割 MspI 反应中性，甲基化与否均切割 动物甲基化程度比较高。
同尾酶：来源不同，识别顺序不同，粘性末端相同
BamHI G↓GATCC
20 - 100 ml
酶
37 ℃ 1 - 1.5 hr
1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 小时
，水完解全1 mg 标准DNA所需的酶
量
限制性核酸内切
II 型限制性核酸内酶切酶酶解反应的操作
II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：
对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应
注意：
BamHI SmaI
1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 ℃反应 1 小完时全，连接 1 mg l-DNA（Hind III片段）所需
的酶量
DNA连接酶
平头双链DNA片段的连接操作（T4-DNA连接酶
）
从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的
粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接
则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多
基因工程和基因组
针对特定基因突变或表达异常，开发相应的靶向药物或治疗方法，实现精准治疗。
基因组学在临床试验中的应用
利用基因组学技术，对患者进行分层和精准治疗，提高临床试验的成功率和患者的生存率 。
基因组学在农业领域
05
应用
植物抗逆性改良及新品种选育
利用基因编辑技术改良作物抗逆性
通过CRISPR-Cas9等基因编辑技术，对作物抗逆性相关基因进行定点突变或敲除，提高作物对干 旱、高温、盐碱等逆境的抵抗能力。
转基因技术
基因枪法
将外源基因包裹在金属微粒中，通过高压气体加 速将微粒射入受体细胞或组织。
显微注射法
在显微镜下将外源基因直接注入受体细胞的细胞 核内。
农杆菌转化法
利用农杆菌感染植物细胞，将外源基因导入植物 基因组中。
基因编辑技术
01 02
CRISPR-Cas9技术
利用CRISPR-Cas9系统对目标基因进行定点切割，通过非同源末端连接 或同源重组方式修复DNA双链断裂，实现基因敲除、插入或替换等编 辑操作。
尽管基因工程和基因组学已经 取得了很大的进展，但仍存在 一些技术瓶颈，如基因编辑的 效率和安全性、基因测序的准 确性和灵敏度等，需要进一步 研究和突破。
基因工程和基因组学的发展需 要跨学科的合作和交流，包括 生物学、医学、化学、物理学 、计算机科学等，以推动技术 的创新和应用。
加强跨学科合作，推动创新发展
THANKS.
比较基因组学
比较不同物种或个体基因组的差异和相似 性，揭示物种进化、基因功能等生物学问 题。
基因工程核心技术
03
DNA重组技术
010203Fra bibliotek限制性内切酶
识别并切割DNA特定序列， 产生黏性末端或平末端。
基因工程和基因组学
探秘基因工程和基因组学
基因工程和基因组学是当今最先进的生物学科学领域之一，其应用涵盖医疗、 农业、工业和环境等各个领域。本次演讲将为您揭开真相。
基因工程的应用领域
医疗
基因工程技术可以用于开发新药、制备疫苗、诊 断遗传性疾病。
工业
基因工程技术可以用于生产制造业中，如生产高 纯度的发酵酶、生物柴油等。
基因工程的基本原理
分离选择
找到想要的基因。
切割粘贴
精准操作基因。
转化
把修改后的基因引入到目标生 物体中。
基因组学的研究方法和技术
1
基因组测序
分析和揭示生物体各种基因的位置、数
基因表达谱分析
2
量和结构信息，是研究基因组学的重要 手段。
通过大规模分析细胞或组织中的基因表
达水平，揭示基因在不同生理状态下的
活性表达。
3
蛋白质组学
通过研究蛋白质的组成、构象、功能等， 揭示蛋白质与生物体生命活动的关系。
基因工程和基因组学的现状和发展趋 势
1 技术发展日新月异
新的技术手段已经大大提高了操作的效率和精度。
2 应用领域扩展不断
新的应用领域不断涌现，如人工合成生物体、微生物代谢工程等。
3 伦理和社会问题关注加深
农业
基因工程技术可以用于培育抗病虫害、耐旱抗寒、 高产优质的农作物。
环境
基因工程技术可以用于生物修复，如污染泥土中 的重金属，清洁污染的水源。
基因组学的意义和目标
1
认知世界
了解基因组组成可以增加我们对生命活动和生命起源的认识。
2
促进发展
研究人员可以借助基因组学开展与生物遗传相关的诸多领域的探索和研究，推动社会进步。
基因工程技术在微生物基因组学研究中的应用
基因工程技术在微生物基因组学研究中的应用简介：微生物基因组学是研究微生物基因组的结构、功能和进化的学科领域。
随着基因工程技术的不断发展与创新，微生物基因组学研究获得了巨大的进展。
基因工程技术为微生物基因组学研究提供了强大的工具和方法，包括基因工程、DNA测序、基因组编辑和表达调控等。
本文将介绍基因工程技术在微生物基因组学研究中的主要应用。
1. 基因工程技术在微生物基因组测序中的应用微生物基因组测序是了解微生物基因组结构与功能的重要手段。
基因工程技术为微生物基因组测序提供了高效、快速和准确的方法，包括第二代测序技术和单分子测序技术等。
这些技术能够快速测序大量微生物基因组，帮助我们更好地了解微生物的遗传信息和进化历史。
2. 基因工程技术在微生物基因组编辑中的应用基因组编辑是指通过基因工程技术对微生物基因组进行精确的编辑和改造。
例如，CRISPR-Cas9技术是一项常用的基因组编辑技术，它能够精确地剪切特定的基因序列，并引入所需的基因突变或修饰。
这种技术可以帮助研究人员揭示微生物基因功能和基因调控机制。
3. 基因工程技术在微生物基因组表达调控中的应用微生物基因组表达调控是研究微生物基因表达及其调控网络的过程。
基因工程技术可以被用于设计和构建调控元件，以达到精确控制微生物基因表达的目的。
例如，研究人员可以设计和构建特定的启动子或调控子序列，来实现对某个目标基因的高效表达或抑制。
这种技术在工业微生物生产中有重要应用价值。
4. 基因工程技术在微生物基因组功能解析中的应用功能解析是研究微生物基因组中基因功能和基因调控机制的过程。
基因工程技术可以帮助研究人员将外源基因导入微生物中，以研究其在微生物中的功能和作用机制。
例如，研究人员可以通过基因工程技术将外源基因导入大肠杆菌，然后观察该基因在细菌中的表达及其对细菌生长和代谢的影响，从而揭示该基因的功能和作用机制。
结论：基因工程技术在微生物基因组学研究中发挥了重要作用。
基因工程、分子生物学和分子遗传学重要名词解释
基因工程、分子生物学和分子遗传学重要名词解释基因工程、分子生物学和分子遗传学重要名词解释5’Cap 5’-末端帽：有时简称帽，是在许多真核生物mRNA5`-末端发现的一种由7-甲基-鸟嘌呤核苷-5`-ppp –末端核苷构成的特殊构成的特殊结构。
它是在转录后不久经酶催反应加入到TATA （Hogness）序列的附近，具有保护mRNA稳定性的功能。
在原核生物的mRNA分子中不存在5`-末端帽结构。
A protein A蛋白：他参与λDNA插入噬菌体头部和在粘性末端（cos）位点上裂解多联体DNA的过程。
abortive lysgeny 流产溶原性：温和噬菌体感染敏感的宿主菌后，既不整合进宿主染色体中，也不进行复制，从而使每一个带有噬菌体的宿主菌分裂产生的两个细胞中，只有一个是溶原性的。
abortive transduction 流产转导：这是得到不稳定转导子的一类转导，区别于得到稳定转导子的完全转导。
在流产转导中，转导子分裂产生两个细胞时，只有其中的一个获得供体基因，另一个细胞则仍属受体基因型。
Abundance of an mRNA mRNA丰度：是指每个细胞平均拥有的某一种特定mRNA的分子数,跟据丰度的差异可将分为两种不同的等级：其一是富裕型的，每个细胞拥有的平均考贝数为1000——10000，属于此型的mRNA约有100种；其二是稀少型的，每个细胞拥有平均考贝数仅有1——10个上下，属于这一类行的mRNA达10000多种。
Abzymes 抗体酶: 应用单克隆抗体技术生产的兼具抗体及酶催活性的工程蛋白质。
也就是说，其行为如同蛋白酶一样，能够催化化学反应的一类新型的抗体。
Acceptor splicing site 受体拼接位点: 间隔子的右端和与其相连的表达子的左端之间的接合点。
Acquired immunodeficiency syndrome, AIDS 获得性免疫缺损综合征: 由人类免疫缺损病毒（HIV）引起的一种疾病，他最早于1980年在美国洛杉叽发现。
基因工程和基因组学
基因工程和基因组学遗传工程一般可分为广义和狭义的两种，广义的遗传工程包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程等。
狭义的遗传工程即使通常将的基因工程。
遗传工程也称为生物工程，利用工程技术的方法改造和修饰生物体，使其产生新的形状或产品，从而改良生物体的一种遗传学手段。
其核心是利用重组DNA技术，在分子水平上操作修饰改变生物体遗传结构。
基因工程则是利用人工的方法把生物遗传物质在体外进行切割、拼接和重组，获得重组DNA分子，然后导入宿主细胞或个体，使受体的遗传特性得到修饰或改变的过程。
基因工程的工具酶包括内切核酸酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、反转录酶。
其中最重要的工具酶是限制性核酸内切酶，也称为限制性酶，能识别双链DNA分子中一段特异的核苷酸序列，并在特定的位置将双链DNA分子切断。
另外基因工程需要的另一个工具是载体，载体是将外源DNA片段运送进宿主细胞进行扩增或表达的运载工具。
而且载体也是DNA分子，常见的载体有细菌质粒、噬菌体、病毒等。
载体的基本条件是有独立的复制原点，而且能独立地自我复制，能带动外源DNA一起复制，具有多种限制性酶切位点，并且该限制酶酶切位点对于任何一种限制酶来说只能有一个，还要具有一个选择标记基因。
遗传工程是将分子遗传学的理论与技术相结合，用来改造、创建动物和植物新品种、工业化生产生物产品、诊断和治疗人类遗传疾病的一个新领域。
遗传工程中的DNA重组主要是创造自然界中没有的DNA分子的新组合，这种重组不同于精典遗传学中经过遗传交换产生的重组。
遗传工程技术的建立，使所有实验生物学领域产生巨大的变革。
在工厂化生产药品、疫苗和食品；诊断和治疗遗传疾病；培养转基因动植物等方面都有非常重大的意义，即基因工程技术已广泛用于工业、农业、畜牧业、医学、法学等领域，为人类创造了巨大的财富。
基因工程是生物科学基础研究的重要手段，利用转基因技术改良植物已经取得很大进展并在生产上应用。
利用基因工程获得大量重组的蛋白、疫苗药物，利用基因工程进行不同种之间的基因传递提供了可能、疾病诊断与基因治疗，环境保护。
基因工程与基因编辑
基因工程与基因编辑基因工程和基因编辑是两个在生命科学领域广受关注的领域。
这两个领域的发展为人类带来了许多潜在的益处，也引发了一系列的争议。
本文将对基因工程和基因编辑进行探讨，并分析其应用和伦理问题。
一、基因工程基因工程是一种通过改变生物体的基因组来获得特定性状或功能的技术。
在基因工程中，科学家可以通过删除、替换或插入基因来改变生物体的遗传性状。
这种技术可以用于农业、医学和工业等领域。
农业方面，基因工程可以用来改善作物的产量、耐虫性和抗病性。
科学家们通过转入具有特定功能的基因，使得作物可以更好地适应恶劣环境或抵御病虫害的侵袭。
这样的技术可以有效地提高农作物的产量和质量，缓解粮食短缺问题。
医学方面，基因工程可以用于治疗基因缺陷引起的遗传性疾病。
科学家们可以通过基因治疗技术，将正常的基因导入到患者体内，修复或替换受损基因，从而达到治疗的目的。
这种技术还可以用于癌症治疗、免疫疗法和器官移植等领域。
工业方面，基因工程可以用于生物制造。
科学家们可以通过改变微生物的基因，使其产生高效、可持续和环境友好的化学品和燃料。
这种技术可以减少对传统化石能源的依赖，降低碳排放，有助于解决能源和环境问题。
尽管基因工程在许多领域都有潜在的应用，但是也伴随着一些争议。
其中一个主要的争议是关于食品安全性的问题。
人们担心转基因作物可能对人类健康产生负面影响，或者对生态系统造成不可逆的影响。
此外，基因工程还涉及到知识产权和道德伦理等问题，需要进行全面的讨论和监管。
二、基因编辑基因编辑是一种通过定向修改基因组中的特定位点来实现基因组精确编辑的技术。
相比于传统的基因工程技术，基因编辑技术更加精准和高效。
其中一种常用的基因编辑技术是CRISPR-Cas9系统。
CRISPR-Cas9系统可以通过指导RNA的序列将Cas9蛋白导向到特定基因组中的目标位点，然后Cas9蛋白将目标位点上的DNA切割掉。
随后，细胞会利用自身修复机制修复这一切割点，从而实现对基因组的编辑。
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17
2、质粒载体的构建
用于基因克隆的质粒载体应具有操作方便、易于 检测、插入后能够稳定不丢失的优点。 质粒构建的几个原则：
（1）质粒载体具有能自我复制的元件，这也是所有克隆 载体必需的。 （2）质粒载体上具有允许外源基因插入的多克隆位点， 实际上在实际运用的载体上具有的多克隆位点数为一 个。 （3）质粒载体上同时必须有可供筛选的抗生素标记：已 经在质粒载体上使用的抗生素标记基因包括 Ampr,Terr,Kanr等。 （4）构建的质粒载体应该足够小：由于质粒载体在进行 遗传转化时，转化的效率与载体的大小有关。
20
不同类型载体的克隆外源片段能力比较
载体类型
质粒载体 噬菌体载体 Cosmid载体 Phagemid载体 YAC BAC TAC
克隆的外源片段长度/kb
﹤5 ﹤15 15~45 15~45 ﹥2Mb ﹥300kb ﹥100kb
宿主细胞
大肠杆菌 λ 噬菌体 大肠杆菌 大肠杆菌 酵母 细菌 细菌/农杆菌
15
一、基因工程载体种类
通常包括质粒载体、噬菌体载体（包括噬 菌体和质粒为基础构建的Cosmid载 体），人工染色体载体（YAC、BAC、 PAC、TAC）等。
16
二、质粒载体：
质粒是存在于宿主细胞染色体外的一种裸露的双链 DNA分子（或者RNA分子），在宿主细胞体内通 常以共价闭合环状的超螺旋形式存在。 基因工程中通常使用5kb以下的质粒。商业化的质 粒载体一般有如下的生物学特性：
EcoB：
识别序列 T-G-A-（N）8-T-G-C-T；甲基化的位点 第 3或第9腺嘌呤
Ecozk：识别序列 A-A-C-（N）6-G-T-G-C；甲基化 的位点 目前还不清楚
特点：
1kb左右距离进行随机切割，70个左右的核苷酸，基 因工程中运用极为有限
5
3、Ⅱ型限制性内切核酸酶
2300多种，可识别230多种不同的DNA序列，基因工程 中运用十分广泛。
目前还发现了一些识别特殊碱基序列的限制性内切核 酸酶，如在大肠杆菌中发现识别羟甲基胞嘧啶、5-甲 基胞嘧啶和4-甲基胞嘧啶DNA分子的限制性内切 酶,McrBC。
9
6、限制性内切核酸酶的命名和分类
几条基本原则：
（1）：利用属名的第一个字母和种名的前2个字母代表内切 酶的来源。
Escherichia coli,Eco;Haemophilus influenzae,Hin;
7、影响限制性内切核酸酶的一些因素 和实际工作中采用的方案。
限制性内切核酸酶试剂盒，都提供了酶切优化配方。 （1）DNA的浓度和质量是影响酶切的最为关键的因素。 （2）酶切消化的缓冲液。
（3）酶切反应的温度。
（4）其他因素。反应的时间、消化过程中能否保持恒定 的体积（在混合物上覆盖一层矿物油来防止缓冲液中的水 分散失） （5）部分消化和过消化。
基因测序→基因功能→需要大量基因→基因克隆 基因克隆方法（几十种）：归纳为5大类 以已知序列为基础的基因克隆方法、以分子标记连 锁图谱为基础的基因克隆方法、以人工突变体为 基础的基因克隆方法、以表达差异为基础的
26
一、以已知序列为基础的基因克隆方法
1、以氨基酸序列为基础的基因克隆方法 （最为经典） 通过对表达的或者差异的蛋白质分子的序列进行测定分析以后，获得该 蛋白质的一段氨基酸的序列。根据编码不同氨基酸的密码子设计出一 条简并引物，利用这条RT-PCR或者进行RACE-PCR扩增的方法克隆 基因的全长。 2、RACE-PCR与同源序列法扩增全长基因 RACE （rapid amplification of cDNA end）即快速扩增cDNA末端可分为 以下几个步骤： A：mRNA反转录为一链的cDNA B：利用5’ cDNA的帽子结构设计出的引物分别与基因的特殊引物进行 PCR嵌套扩增得一条或者几条特异的PCR带型 C：分别将这些带型克隆到质粒载体上进行PCR测序，通过分析和比较以 后可以获得待克隆基因的3’端的片段。
30
四、以经典的方法） 组织A 组织B
三、以人工突变体为基础的基因克隆方法
1、转座子标签法
含有转座子和报告基因的载体构建 遗传转化 突变体筛选 反向PCR或者TAIL-PCR获得侧翼序列 利用侧翼序列为探针分离基因
29
2、T-DNA标签法
T-DNA是存在于植物根癌农杆菌Ti质粒中的一段特殊的 DNA序列，当根癌农杆菌感染寄主植物细胞以后， TDNA 分子在Vir基因的帮助下会从细菌细胞转移到植物细 胞中，通过T-DNA 两端的25bp左右的碱基重复序列，随 机地整合到植物基因组中。如果T-DNA整合到功能基因 的内部或者功能基因的调控区域，这种整合就可能导致 功能基因的失活产生各种不同的突变。T-DNA上具有 20bp左右的特殊重复片段，可以利用该片段为引物通过 反向PCR的方法扩增获得T-DNA插入区间的相连片段。 再以该片段为探针对突变体的基因进行筛选就可以 分离含有目的基因克隆。
（1）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ、Klenow酶和T4 DNA聚合酶 （2）Taq DNA聚合酶 （3）RNA反转录酶 （4）末端转移酶 （5）DNA连接酶 （6）碱性磷酸化酶 （7）其他种类的核酸化酶类
13
第二节
基因克隆所需要的载体
14
在基因工程实验中，载体作为一种运载工具通常用于装载外 源的DNA片段或者基因，并将它转入受体细胞，使外源片 段DNA分子能够在受体的细胞中进行繁殖，这种特殊的 DNA分子称为基因克隆载体。 基因克隆载体必备的一些基本条件： （1）1个或多个克隆位点。 （2）携带外源的DNA片段（基因）进入到宿主细胞中能够 进行自我复制，或者外源的DNA片段能够整合染色体随 着染色体的DNA复制而同步进行自我的复制。 （3）载体必须具有可供选择的标记，如抗生素标记。 （4）载体必须是安全的，不含有对受体细胞有害的基因， 对于细胞的生长不会产生显著的影响。
19
2、酵母人工染色体（yeast artificial chromosome, YAC）
3 、细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome, BAC） 4 、其他类型的人工染色体 P1人工染色体（P1 artificial chromosome, PAC） 植物可转基因人工染色体（transformationcompetent artificial chromosome, TAC）
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二、以分子标记连锁图谱为基础的基因克隆方法
标记1
标记2
基因定位 染色体步移（登陆） 遗传转化 功能验证 Ti-DNAFra bibliotek功能验证
图位基因克隆法的基本步骤和原理
A：首先通过遗传分析将目的基因定位在染色体的一定区间内，或者说在目 的基因的两（基本思路是首先利用分子标记分离到 与分子标记同源的插入克隆，然后通过重叠群的分析获得候选基因克隆的 一种方法）。 28 D：对候选基因片段的功能互补分析、序列测定和基因结构鉴定。
（2）：内切酶的第4个字母表示酶来源的菌株和菌型。
EcoRI中的R就表示该内切酶来自于大肠杆菌的R菌株, 如果还 不足以说明，有些情况下还加上数字1或2来表示例如EcoR1 等。 （3）：在同一种菌株中分离获得的不同内切酶按照分离时间 的先后以罗马数字加以标注。 来自流感嗜血菌的几种不同的限制性内切核酸酶就用HindⅠ、 10 Hind Ⅱ、 Hind Ⅲ等表示。
2
第一节
基因克隆所需要的酶
3
一、限制性内切核酸酶
1、限制性内切核酸酶的发现和限制性—修饰现象
GAATTC CTTAAG EcoRⅠ MEcoRⅠ
限制作用
修饰作用
G AATTC CTTAA G
GAATTC CTTAAG
EcoRⅠ
//
4
限制性内切核酸酶EcoRⅠ和甲基化转移酶进行限制和修饰作用图解
2、Ⅰ型限制性内切核酸酶
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8、限制性内切核酸酶在生物技术中的 运用。
限制性内切核酸酶在基因克隆中就象外科医生的手 术刀。
（1）构建重组的DNA分子。
（2）探针的制备。
（3）DNA物理图谱的构建。
（4）DNA甲基化的分析
12
二、DNA聚合酶
DNA聚合酶的重要特性是将脱氧核糖核酸连续地连 接到双链DNA分子的3`-OH末端，催化核苷酸的作用， 形成长链的核酸分子。依据DNA聚合酶的作用和来 源不同，可分为）大片段DNA克隆载体的准备 （2）大分子质量的植物基因组DNA制备。 （3）大片段DNA分子的部分酶切。 （4）载体与外源片段的连接。 （5）载体的遗传转化。 （6）克隆的挑取和验证及植物基因组 的保存。24第四节
基因克隆的方法
25
模式植物：水稻、拟南芥、烟草
18
四、人工染色体载体
1、人工染色体载体的种类 构建人工染色体必须满足几个基本的条件：必须具有行使正 常染色体功能所必需的各种元件，主要是着丝粒、复制起 点和端粒。 着丝粒是在细胞进行有丝分裂中期与纺锤丝微管相结合的部 分，牵动染色体有规律地分配到子细胞中的部分。 端粒是保持染色体进行稳定性、染色体正常、精确地复制和 维持染色体长度所必需的元件。 复制起点是所有生物进行DNA复制所必需的。
1
• 1971,美国史密斯,细菌,限制酶; • 1972,伯格,限制酶分别酶切猿猴病毒DNA与λ 噬菌体 DNA,用DNA连接酶连接,新的DNA分子; • 1973,科恩将重组外源DNA片段与质粒连接起来,重组质 粒,转入大肠杆菌; • 1974,异源真核生物基因在大肠杆菌中的表达; • 1982,基因工程方法在细菌中表达生产的人体胰岛素进 入市场; • 1985,烟草花叶病毒的外壳蛋白基因导入烟草获得成功; • 1986,基因工程生物实验性地释放到环境中; • 1990~1992,头一个转基因小麦,玉米; • 1994,基因工程西红柿在美国上市; • 1996,克隆羊多利诞生. • 现在,利用基因工程技术创建新的生命形态,生产药品, 疫苗,牛奶和食品,诊断和治疗遗传疾病.