NADP-分析方法
生命大分子常用测定方法
生命大分子常用测定方法生物大分子常用测定方法二、常用的测定方法1.光谱法2.电化学法3.生物活性检测法4.免疫分析法5.生物传感器1 光谱法(1)吸收光谱法[①直接测定法；②比色法](2)荧光法(3)浊度法特点：测定时所需的样品量较少，但往往能产生比较高的消光值；且操作简单，反应迅速、灵敏；结果也较准确，(1)吸收光谱法直接测定法、比色法①直接测定法将待测物(如核酸、蛋白质)配制成一定浓度的溶液后，移至相应波长的分光光度计中，即可从测定的消光值换算出待测物的含量。
A.测定核酸含量构成核酸的碱基组分是分光光度计测定核酸含量的依据。
在测定过程中，DNA或RNA溶液浓度的增加或降低，会使其在波长260nm的消光值(A260) 随之增加或降低，二者之间成正比关系。
通常1个A260值分别相当于双链DNA 50μg／ml单链DNA 37μg／ml单链RNA 40μg／ml用A260／A280比值可确定DNA和RNA的纯度：纯DNA比值为1.8纯RNA的比值为2.0当此比值分别小于1.8和2.0时，表明样品中已污染了蛋白质或酚类等物质。
B.测定蛋白质的含量及纯度蛋白质(包括酶和肽)溶液的A280值主要是由构成蛋白质组分的色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)的消光值决定的，胱氨酸的贡献很小。
②比色法将待测物(如蛋白质、核酸、糖类)与相关试剂(见表1-2)或酶的底物作用后，根据呈现的颜色或形成的产物特性，移至相应波长的分光光计中，即可从测定的消光值换算出待测物的含量。
例如：邻苯二酚(在275nm有吸收峰)+ 邻苯二酚-2,3-双加氧酶黄色的α- 羟基粘康酸半醛(在375nm有吸收峰)通过检测375nm消光值的升高即可换算出所用酶的活力。
还可用不同消光值之间的比值鉴定某些物质的纯度例如纯细胞色素c还原型A550／氧化型A280比值为1.25~ 1.28。
假如比值过高或过低，就表明细胞色素C中污染了杂质。
(2)荧光法特点：荧光法的精确性、重复性和灵敏度比吸收光谱法好。
细胞代谢组学中的定量分析与生化组分分析研究
细胞代谢组学中的定量分析与生化组分分析研究细胞代谢组学是研究细胞的代谢物质组成和代谢通路的一门学科。
其中，定量分析和生化组分分析是非常重要的研究方法。
本文将结合实际案例，介绍这两种方法在细胞代谢组学领域的应用和意义。
一、定量分析定量分析是指测定样品中某种物质的含量。
在细胞代谢组学中，我们可以利用这种方法来研究细胞中代谢物质的变化情况。
例如，在一项研究中，研究人员利用定量分析的方法，测定了小麦根尖细胞中ATP/ADP和NADPH/NADP+比值的变化情况。
结果显示，小麦根尖细胞在发芽早期，ATP/ADP和NADPH/NADP+比值都有明显的升高。
这表明这时期小麦根尖细胞的代谢物质的生产活跃度较高，也为后续的生长提供了足够的能量和还原力。
定量分析的方法有很多，其中最常用的便是色谱法和质谱法。
色谱法可以将样品中的混合物分离成各种组分，并可测定各组分的浓度或含量。
质谱法则可以测量样品中不同化合物的分子量。
这两种方法的优点在于，它们可以同时解决复杂的样品，且具有高灵敏度和高精确度。
二、生化组分分析生化组分分析是指通过测定组成物质的各种物理和化学性质来确定其组成成分的方法。
在细胞代谢组学中，我们可以使用生化组分分析的方法，进一步研究代谢物质的组成和含量。
例如，利用气相色谱-质谱联用技术，我们可以分析出细胞中葡萄糖、丙酮酸、乳酸等小分子代谢产物的组成比例。
这种方法可以帮助我们更全面地了解细胞的代谢情况，为进一步深入探究代谢通路提供数据支持。
与定量分析类似，生化组分分析的方法也有很多，例如核磁共振法、毛细管电泳法等。
不同的方法适用于不同的样品和目的。
三、典型案例一个有趣的案例是研究人员利用定量分析和生化组分分析，研究酵母细胞代谢的变化。
他们将酵母进行了不同的处理，然后在不同时间点（1、2、4、6、8小时）进行了样品采集和分析。
定量分析的结果显示，在胁迫条件下，酵母细胞中葡萄糖的含量减少，而丙酮酸和乳酸的含量增加。
生化分析仪常用分析方法共有三大类,分别为终点法、固定时间法和动力学法
生化分析仪常用分析方法共有三大类，分不为终点法、固定时刻法和动力学法。
终点法：指通过一段时刻的反响，反响到达平衡，由于反响的平衡常数特别大，可认为全部底物(被测物)转变成产物，反响液的吸光度不再变化，只与被测物的浓度有关。
这类方法通常称为“终点〞法，更确切地讲应称“平衡〞法。
单试剂单波长终点法：t1时刻参加试剂〔体积为V〕，t2刻参加样本〔体积为S〕，然后搅拌并反响，之后开始测量反响液的吸光度，在t3时刻反响到达终点，t3－t2为测定时刻。
反响度R＝At3－At2-1×V/(V＋S)，或R＝At3－ARBLK。
其中：Ati为i时刻的吸光度，ARBLK为试剂空白吸光度。
单试剂双波长终点法：全然上同“单试剂单波长终点法〞，只是关于每一个测定周期，事实上际吸光度等于Aλ1－Aλ2。
双试剂单波长终点法：t1时刻参加第一试剂(体积为V1)，t2时刻参加样本(体积为S)之后立即搅拌，t3时刻参加第二试剂(体积为V2)并立即搅拌，t4时刻反响到达终点。
t3-t2为孵育时刻,t4-t3为测定时刻。
在工程参数中，要是反响起始时刻设为0，那么反响度R=A时刻吸光度-双试剂空白吸光度。
要是反响起始时刻小于0，那么反响度R=At4-双试剂空白吸光度-t3到t2间设定点的吸光度×〔V1＋S〕/(V1＋S＋V2)。
双试剂双波长终点法：全然上同“双试剂单波长终点法〞，只是关于每一个测定周期，事实上际吸光度等于Aλ1－Aλ2。
固定时刻法：又称为一级动力学法、二点动力学法等，指在一定的反响时刻内，反响速度与底物浓度的一次方成正比，即v=k[S]。
由于底物在不断的消耗，因此整个反响速度在不断的减小，表现为吸光度的变化越来越小。
这类反响到达平衡的时刻特别长，理论上能够在任意时刻段进行监测，但由于血清成份复杂，反响刚启动时反响较复杂，杂反响较多，必需通过一段延迟时刻才能进进稳定反响期。
t1时刻参加试剂(体积为V)，之后测量试剂空白的吸光度，t2时刻参加样本(体积为S)，t3时刻反响稳定，t4时刻停止对反响进行监测；t2－t3为延迟时刻，t3－t4为测定时刻。
还原酶实验报告
一、实验目的1. 了解还原酶的催化作用原理。
2. 掌握测定还原酶活性的实验方法。
3. 通过实验验证还原酶在不同条件下的活性变化。
二、实验原理还原酶是一类能够催化氧化还原反应的酶，在生物体内具有重要作用。
本实验以葡萄糖-6-磷酸为底物，在还原酶的催化下，葡萄糖-6-磷酸被还原成葡萄糖-6-磷酸还原物，同时产生NADPH。
NADPH在氧化还原反应中起到传递电子的作用。
通过测定NADPH的生成量，可以反映还原酶的活性。
三、实验材料与仪器1. 材料：新鲜叶片、0.1M磷酸缓冲液、0.2M葡萄糖-6-磷酸、0.2M NADP+、0.1M NADP+、蒸馏水、无水乙醇、3,5-二硝基水杨酸、NaOH、硫酸铜、碘化钾、淀粉溶液。
2. 仪器：恒温水浴锅、分光光度计、移液枪、烧杯、试管、容量瓶、剪刀、电子天平、研钵、滤纸等。
四、实验步骤1. 样品制备：取新鲜叶片，用剪刀剪成小片，称取0.5g，放入研钵中，加入少量蒸馏水，研磨成匀浆。
将匀浆过滤，收集滤液。
2. 样品处理：取一定量的滤液，加入等体积的95%乙醇，混匀，静置10min，离心分离。
取上清液作为还原酶样品。
3. 还原酶活性测定：（1）取6支试管，编号为1-6，分别加入0.1M磷酸缓冲液、0.2M葡萄糖-6-磷酸、0.2M NADP+、还原酶样品、蒸馏水。
（2）将试管置于恒温水浴锅中，保温5min。
（3）加入0.1M NADP+，立即启动计时器，每隔30s取出一支试管，加入3,5-二硝基水杨酸和NaOH溶液，混匀，于540nm波长下测定吸光度。
4. 数据处理：以吸光度为纵坐标，时间为横坐标，绘制还原酶活性曲线。
五、实验结果与分析1. 还原酶活性曲线：根据实验数据绘制还原酶活性曲线，观察还原酶在不同时间下的活性变化。
2. 还原酶活性影响因素：通过改变实验条件，如温度、pH值等，观察还原酶活性变化，分析还原酶活性的影响因素。
六、实验结论1. 本实验成功测定了还原酶的活性，验证了还原酶的催化作用原理。
18 光合作用2(过程及探索历程) 课件--2022届高考生物大一轮复习
（15）1931年，微生物学家尼尔（C.B.Van Niel） 将细菌光合作用与绿色植物的光合作用加以比较， 提出了以下光合作用的通式∶CO2 +2H2A→（CH2O）+ 2A +H2O，
光合细菌在光下同化CO2而没有O2的释放，O2不是来自二氧化碳而 是水。因此他第一次提出光在光合作用中的作用是将水光解。
（16）1937年，英国植物学家希尔(R.Hill)发现，在离体叶绿体的
悬浮液中加入铁盐或其他氧化剂(悬浮液中有H2O，没有CO2)，在 光照下可以释放出氧气。
希尔 反应
H2O
铁盐(或其他氧化剂) 离体叶绿体 光照
水的 2H+ + O2 光解
希尔反应是否说明植物光合作用产生的氧气中的氧元素全部都来
3.光合作用的过程
(1)定义
指绿色植物通过 叶绿体 ，利用光能，把 二氧化碳和水转化成储存着能量的有机物，并且释放 出 氧气 的过程。
实质 合成有机物，储存能量（将无机物合成有机 物，光能转换为有机物中稳定的化学能）
(2)过程 NADP+2e-+H+→NADPH NADPH的合成：
光反应 暗反应
学 能
储存在什么 物质中？
(11)1864年,萨克斯的实验
光照
一在 半暗 曝处 光放 ，置
一几 暗处理
半小 遮的 光叶 片
碘蒸汽处理
酒精 脱色
结论:绿色叶片在光的作用下产生了淀粉
①萨克斯：自身对照， 自变量： 是否照光
(一半曝光与另一半遮光)，
因变量：叶片是否制造出淀粉。
（或颜色变化）
NAD代谢相关物质分析
NAD代谢相关物质分析BTP-NAD代谢相关物质分析NAD代谢相关小分子主要包括氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+），还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+），还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），烟酰胺单核苷酸（NMN），烟酰胺（NAM），烟酰胺核糖（NaR），腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）。
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，简称NAD+），也被称为辅酶I，是氧化还原过程中的必需辅酶，参与DNA修复、细胞物质代谢、能量合成等多种生理活动。
百泰派克公司以GC/MS（Agilent 7890A/5975C）和ACQUITY UPLC/TripleQuad5500（Waters/AB Sciex）联用为基础的NAD代谢相关小分子检测平台，从而实现对多类NAD代谢相关小分子进行定量及定性分析，其中涉及到的95%的物质均使用标准品和同位素标准品定量。
BTP可检测NAD代谢相关小分子BTP可检测NAD代谢相关小分子。
关于样品血清、血浆、尿液、胆汁、胆酸；细胞、肝脏、脑组织等动物组织及粪便等；植物、酵母、微生物等。
样本需求量：血样、胆汁等：10微升。
各种组织：10毫克。
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其它样本类型及用量请与百泰派克销售联系。
样品运输：以3-4公斤干冰挥发一天计算，请使用足量的干冰运输（建议尽量选用较大块的干冰，大块的干冰挥发较慢），并用泡沫盒封闭。
并且尽量选用较快的邮递方式，以降低运输过程中样品降解的可能性。
中/英文项目报告在技术报告中，百泰派克会为您提供详细的中英文双语版技术报告，报告包括：1.实验步骤（中英文）。
2.相关的质谱参数（中英文）。
3.鉴定物质的定量或定量信息。
4.质谱图片。
5.原始数据。
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第10讲 光合作用-2021年高考生物一轮复习名师精讲练(新高考地区专用)
第10讲 光合作用【基础梳理】一、 捕获光能的色素和结构1. 捕获光能的色素1．捕获光能的色素及色素的吸收光谱由图可以看出：(1)叶绿体中的色素只吸收可见光，而对红外光和紫外光等不吸收。
(2)叶绿素主要吸收红光和蓝紫光，类胡萝卜素主要吸收蓝紫光，类胡萝卜素和叶绿素吸收绿光最少2．叶绿体的结构与功能 (1)结构模式图(2)结构⎩⎪⎨⎪⎧外表：①双层膜内部⎩⎨⎧ ②基质：含有与暗反应有关的酶③基粒：由类囊体堆叠而成，分布有色素和与光反应有关的酶↓决定(3)功能：进行光合作用的场所。
3．探究光合作用经典实验中的对照和变量及实验结论例1：下列有关光合作用探究历程的叙述，正确的是()A. 英格豪斯认为密闭玻璃罩中蜡烛熄灭的根本原因是缺乏足够的O2B. 萨克斯的实验中叶片曝光的一半变蓝，说明叶绿体在光下产生了淀粉C. 鲁宾和卡门只用18O标记H2O，证明了光合作用释放的O2都来自水D. 恩格尔曼的水绵实验利用了好氧细菌的生理特点作为因变量观测指标例2：如图是在电子显微镜下观察到的高等植物叶绿体结构模式图，下列有关叙述错误的是()A．①和②均为选择透过性膜B．③上分布有与光反应有关的色素和酶，这些色素对绿光吸收最少C．③上所含色素均含Mg2＋，故缺Mg2＋时这些色素都无法合成D．在③上形成的产物[H]和A TP进入④中为暗反应提供物质和能量二、光合作用的基本过程1.概念光合作用指绿色植物通过叶绿体，利用光能，把二氧化碳和水转化成储存着能量的有机物，并且释放出氧气的过程。
光合作用分为光反应阶段和暗反应阶段，二者密切相关。
2．过程3．反应式(1)产物为(CH 2O)：CO 2＋H 2O――→光能叶绿体(CH 2O)＋O 2。
(2)产物为C 6H 12O 6：6CO 2＋12H 2O――→光能叶绿体C 6H 12O 6＋6O 2＋6H 2O 。
4．光反应和暗反应的比较光反应为暗反应提供两种重要物质：ATP 和[H](NADPH)。
酶法分析(生科院2015)
•
在能满足这些条件的情况下，最好是采用单一酶 反应就能进行定量检测。
使用终点法应注意的问题
1．酶的底物专一性： • 绝对专一性 • 相对专一性 • 立体异构专一性
对于酶法分析来说，最理想的酶是具 有绝对专一性的酶。
指示酶反应 指示酶反应
1. 以脱氢酶为指示剂 1. 以脱氢酶为指示剂
测定酶反应：S P1 测定酶反应的产物P1作为以NAD或NADP为 辅酶的某一脱氢酶的底物，将两个酶促反应 相偶联。 指示酶反应： P1 P2 NAD NADH NADP NADPH E
[例1] 葡萄糖-1-磷酸（G-1-P）定量 G-6-P 脱氢酶 6 P GA 指示酶反应：G-6-P NADP+ NADPH+H+ 方法：Buff＋NADP＋样品（G-1-P）＋脱氢酶 放5分钟 340nm测A1（清除试剂及样品中混入的G-6-P） 向混合液中加变位酶 放4分钟 340nm测A2 A2－ A1 代表了 A2-A1 代表了 G-1-P 的量 G -1-P 的量 测定酶反应：G-1-P 变位酶
2．反应的平衡
对于终点法来说，要求反应接近进行完全，故对不 同的酶反应须采取不同的措施使反应进行到接近完全。
• 若酶反应平衡十分偏向进行方向，则可方便的用终点法进行检测， 不需进行任何处理。 • 若反应的平衡并不十分偏向进行方向，或偏向逆方向，那么由于 反应不能完全，因而也就不能正常定量。为了解决这一问题，通 常采取以下一些措施：
羟基丙酮酸定量
羟基丙酮酸定量
可用两种酶：甘油酸脱氢酶（专一性强）
可用两种酶：甘油酸脱氢酶（专一性强）
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精密称取50 mg NADP样品，放入卡尔费休水分滴定仪中（操作见卡尔费休水分滴定仪SOP），记录结果。
起草人：审核人：批准人：
分子量：787.37
二、质量指标
项 目
指 标
外观
pH(0.5mg/mL）
纯度%
含量%
水分%
三、Hale Waihona Puke 测项目3.1含量(HPLC)
仪器
岛津20AT HPLC
试剂
1.甲醇HPLC级
li-Q水
3.三氟乙酸HPLC级
5.NADP对照品
色谱条件
色谱柱：Agilent SB-C18 5µm 4.6＊250mm
洗脱程序：梯度
流速：0.8 mL/min
分析时间：21 min
检测波长：260 nm
进样体积：5uL
柱温：25℃
保留时间：7.9min
梯度程序
时间（mins）
A相（%v/v）
B相（%v/v）
流速（mL/min）
0
100
0
0.8
6.7
96
4
0.8
13
92
18
1.0
14.2
92
18
15.0
100
0
1.2
进样程序
序号
样品名称
进样针数
1
空白（稀释液）
2
2
对照1
3
3
对照2
2
4
样品1
2
5
样品2
1
数据处理
Cstd:：对照品浓度
Astd：对照品峰面积
A样：样品峰面积
n：稀释倍数
m样：样品称样量
图谱
3.2pH值测定
精密称取50 mg NADP样品于100 mL容量瓶中，用去离子水溶解并定容至刻度，利用pHS-3C型pH计测定pH值（操作见pHS-3C型pH计SOP）。
NADP分析方法
一、范围
本标准规定了β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐的质量指标及检验方法。
结构式：
中文名：β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐
英文名称：β-Triphosphopyridine nucleotide disodium salt
CAS号：24292-60-2
分子式：C21H26N7Na2O17P3
21
100
0
1.2
流动相A
0.1%三氟乙酸：准确量取1 mL三氟乙酸溶于1L去离子水中，抽滤并超声脱气15 min后做为流动相A。
流动相B
HPLC级甲醇
对照溶液
精密称取50 mg NADP标准品于100 mL容量瓶中，用去离子水溶解并定容至刻度。
样品溶液
精密称取50 mg NADP样品于100 mL容量瓶中，用去离子水溶解并定容至刻度。