微生物活菌计数方法
微生物总数检测方法(真菌)
微生物总数检测方法（真菌）一、检测用培养基配方与培养条件1.培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA培养基）配制：以北京路桥PDA培养基为例，按说明上配制需称取培养基4克，加水100毫升。
2. 培养条件：25℃-30℃；时间：72-96小时。
二、检测与计数方法1. 梯度稀释称取适量的样品，加入带玻璃珠的三角瓶中，加入100mL的无菌水（无菌水中事先加入了分散剂3—5滴，分散剂可以是吐温，OP—80，用来分散菌团），用玻璃棒搅拌使之溶解吸水均匀后，上旋转式摇床200 r/min充分振荡60 min，,即成母液菌悬液（基础液）。
2. 用10mL无菌移液管分别吸取10mL上述母液菌悬液加入90 mL无菌水中，按1:10进行系列稀释，分别得到1:1×101，1:1×102，1:1×103，1:1×104……1:k稀释的菌悬液（每个稀释度应更换无菌移液管，每一个稀释度瓶种应放有适量的玻璃珠，以保证菌液分布均匀）。
3. 加样及培养取1个适宜的稀释度，用移液枪吸取菌悬液0.1 mL，加至预先制备好的固体培养基平板上，用无菌玻璃涂布棒将菌悬液均匀地涂于琼脂表面。
此稀释度重复3次，同时以空白作对照，于适宜的条件下培养。
4. 菌落识别根据所检测菌种的技术资料，每个稀释度取不同类型的代表菌落通过涂片、染色、镜检等技术手段确认有效菌。
当空白对照培养皿出现菌落数时，检测结果无效，应重做。
5. 菌落计数以出现20—70个菌落数的稀释度的平板为计数标准，分别统计有效活菌数目和杂菌数目。
有效活菌数按式（1）计算，同时计算杂菌数：nm = x kv1/(m0v2) ×10-8或 nv = x kv1/(v0v2) ×10-8（1）式中：nm —质量有效活菌数，亿/gnv —体积有效活菌数，亿/mLx—有效菌落平均数，个k —稀释倍数v1—基础液体积， mLv2—菌悬液加入量， mLv0—样品量，mLm0—样品量， g重点需要注意的部分在菌悬液的制备及震荡过程上，因为固态发酵的的产品大部分为聚集状态不容易分散开来，这点与液态发酵产品不同。
细菌计数简述
细菌计数【目的要求】1、掌握倾注培养法、活菌计数法和光电比浊计数法。
2、熟悉菌落形成单位（cfu）含义。
【器材和试剂】1、器材无菌平皿（直径90mm）、孵育箱、水浴箱、菌落计数仪、无菌刻度吸管、灭菌空试管、坐标纸。
2、培养基普通营养琼脂（每支15ml）、液体培养基。
3、其他待检样品，如饮用水、饮料、食品、药品、化妆品等。
【步骤和方法】1、倾注培养和活菌计数（1）按食品微生物学检验和医药化妆品检验国家标准（GB）的要求处理样品，如固体标本用无菌研钵研碎制成匀浆、油脂类物品用分散剂Tween-80、医药标本宜加入消除药物作用的中和剂等。
所有操作过程必须严格无菌，防止污染。
（2）将标本用无菌生理盐水按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5梯度稀释。
（3）取不同稀释度液体1ml注于直径90mm的无菌平皿，迅速加入已熔化并冷却至50℃的营养琼脂15ml，立即在平面上向同一方向平稳转动，使之混匀，待凝固后翻转平板。
一个稀释度接种两个平板。
（4）置35℃孵育18~24h，计数菌落形成单位（colony forming unit，cfu），求出每毫升或每克标本中所含活菌数。
1ml标本中活菌数=全平板cfu×稀释倍数（5）菌落计数方法：1）平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要使用放大镜检查，以防遗漏。
记下各平板上的菌落数后，应求出同一稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。
2）在求同一稀释度的平均数时，若其中一个平板有较大片状菌落时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。
3）若片状菌落不足平板一半，而其余一半中菌落数分布均匀，则计数后乘2代表全平板菌落数，然后再求该稀释度的平均菌落数。
（6）不同稀释度平均菌落数的确认：1）平均菌落数在30~300之间：①若两个稀释度的比值＜2，报告两个稀释度的平均菌落数，如表1-3-1例2；若比值≥2，应报告两个稀释度中较大菌落数者，如表1-3-1例3、例4.②当只有一个稀释度的平均菌落数在30~300之间时，即以该平均菌落数乘以稀释倍数报告之，如表1-3-1例1。
微生物计数方法
1．操作方法：以无菌操作取检样25g（或25ml)，放于225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨制成1：10的均匀稀释液。
固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。
用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液。
另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管。
2．无菌操作：操作中必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的，不得残留有细菌或抑菌物质。
所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。
样品如果有包装，应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。
操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。
琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。
3．采样的代表性：如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。
固体样品必须经过均质或研磨，液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。
4．样品稀释误差：为减少样品稀释误差，在连续递次稀释时，每一稀释液应充分振摇，使其均匀，同时每一稀释度应更换一支吸管。
在进行连续稀释时，应将吸管内液体沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀释液内，以免吸管外部粘附的检液溶于其内。
为减少稀释误差，SN标准采用取10mL稀释液，注入90mL缓冲液中。
5．稀释液：样品稀释液主要是灭菌生理盐水，有的采用磷酸盐缓冲液（或0.1%蛋白胨水），后者对食品中已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。
如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。
倾注培养1．操作方法：根据标准要求或对污染情况的估计，选择2~3个适宜稀释度，分别在制10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。
几种常用的细菌计数方法
几种常用的细菌计数方法1、计数器测定法即用血细胞计数器进行计数。
取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数。
由于计数室的容积是一定的(O.1mm3)，因而根据计数器刻度内的细菌数，可计算样品中的含菌数。
本法简便易行，可立即得出结果。
本法不仅适于细菌计数，也适用于酵母菌及霉菌孢子计数。
2、电子计数器计数法电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。
该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。
因此，要求菌悬液中不含任何碎片。
3、活细胞计数法常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。
取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出培养物中的活菌数。
此法灵敏度高，是一种检测污染活菌数的方法，也是目前国际上许多国家所采用的方法。
使用该法应注意：①一般选取菌落数在30～300之间的平板进行计数，过多或过少均不准确;②为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入O.001%2，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC);③本法限用于形成菌落的微生物。
广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验，是最常用的活菌计数法。
4、比浊法比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。
细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度(OD值)表示样品菌液浓度。
此法简便快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色太深的样品，不能用此法测定。
5、测定细胞重量法此法分为湿重法和干重法。
湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重;干重法系单位体积培养物经离心后，以清水洗净放人干燥器加热烘干，使之失去水分然后称重。
此法适于菌体浓度较高的样品，是测定丝状真菌生长量的一种常用方法。
微生物生长繁殖的测定方法.doc
微生物生长繁殖的测定方法1. 内容1.计数法：通常用来测定样品中所含细菌、孢子、酵母菌等单细胞微生物的数量。
（1）直接计数：利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。
缺点：不分死活菌。
（2）间接计数（活菌计数法）：其原理是每个活细胞在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落。
2.重量法：以细胞的生长量作为细菌生长测定的指标。
（1）湿重法：将一定体积的样品通过离心或过滤将菌体分离出来，经洗涤，再离心后直接称重，求出湿重，如果是丝状体微生物，过滤后用滤纸吸去菌丝之间的自由水，再称重求出湿重。
（2）干重法：不论是细菌样品还是丝状菌样品，可以将它们放在已知重量的平皿或烧杯内，于105℃烘干至恒重，取出放入干燥器内冷却，再称量，求出微生物干重。
3.生理指标法：（1）含氮测定法：一般微生物细胞的含量比较稳定，故可用凯氏定氮法等测其总氮量，再乘以系数6.25即为粗蛋白含量。
蛋白含量越高，说明菌体数和细胞物质量越高。
（2）DNA含量测定法：微生物细胞的DNA含量较稳定，故可采用适当的荧光指示剂或染色剂与菌体DNA作用，荧光比色或分光光度法测得DNA含量。
2. 练习一、选择1. 测微生物活菌数通常采用：（）A.稀释平板法B.滤膜培养法C.稀释培养法答案：A二、简答1.试述涂片计数的基本方法。
答案：取载玻片一块，用蜡笔在中央画出一平方厘米的面积。
将待测样品稀释到一定浓度后取0.01毫升菌液滴在载玻片上的一平方厘米面积上。
然后在显微镜下计数每个视野的菌数（至少数10个视野，计算平均菌数）。
将视野的面积算出来后，按下列公式计算样品中的含菌数。
1cm2每克样品中的含菌数＝----------⨯每个视野的平均菌数⨯100⨯稀释倍数视野面积3. 测验一、填空1.一般细菌的干重约为湿重的______%。
二、简答1.简述平板菌落测试法。
4. 案例5. 资源下载课程讲义资源（Word文档）、教学课件资源（PPT）、视频录像资源（视频录像）。
微生物常见检测方法大全
微生物常见检测方法大全微生物的检测，无论在理论研究还是在生产实践中都具有重要的意义。
常见的检测方法有：生长量测定法、微生物计数法、生理指标法和商业化快速微生物检测等。
微生物生长意味着原生质含量的增加，所以测定的方法也都直接或间接的以次为根据，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。
微生物生长的衡量，可以从其重量，体积，密度，浓度，做指标来进行衡量。
生长量测定法1、体积测量法：又称测菌丝浓度法。
原理：通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。
菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。
这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。
2、称干重法：原理：利用离心或过滤法测定。
一般干重为湿重的10-20%。
称干重发法较为烦琐，通常获取的微生物产品为菌体时，常采用这种方法，如活性干酵母（activity dry yeast, ADY）,一些以微生物菌体为活性物质的饲料和肥料。
3、比浊法：原理：微生物的生长引起培养物混浊度的增高。
通过紫外分光光度计测定一定波长下的吸光值，判断微生物的生长状况。
该法主要用于发酵工业菌体生长监测。
4、菌丝长度测量法：方法：对于丝状真菌和一些放线菌，可以在培养基上测定一定时间内菌丝生长的长度。
微生物计数法1、血球计数板法:这种方法简便，直观，快捷，但只适宜于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子进行计数，并且所得结果是包括死细胞在内的总菌数。
2、染色计数法：为了弥补一些微生物在油镜下不易观察计数，而直接用血球计数板法又无法区分死细胞和活细胞的不足，人们发明了染色计数法。
3、比例计数法：将已知颗粒（如霉菌孢子或红细胞）浓度的液体与一待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，在显微镜视野中数出各自的数目，即可得未知菌液的细胞浓度。
4、液体稀释法：对未知菌样做连续十倍系列稀释，根据估计数，从最适宜的三个连续的10倍稀释液中各取5毫升试样，接种1毫升到3组共15只装培养液的试管中，经培养后记录每个稀释度出现生长的试管数，然后查最大或然数表MPN（most probably number）得出菌样的含菌数，根据样品稀释倍数计算出活菌含量。
微生物活菌计数方法
2.1 母液（基础液）的制备
样品混合均匀：很重要 固体样品：称取10g左右样品加入到100mL无 菌水（ 500mL三角瓶）中，静置20min。 液体样品：量取10.0ml样品加入到90mL无菌 水（500mL三角瓶）中，静置20min 。 分散菌体：将三角瓶置于摇床上200r/min振荡 30min，即成母液菌悬液。
6.
彻底、操作过程是否合乎无菌要求。
2.3 平板的培养
将涂布好平板放在适宜的条件下培养
如： 温度条件 气体条件 培养时间 平板倒置培养
2.4 菌落识别和计数
1. 2. 3.
4.
通过菌落识别、涂片染色、镜检观察，确定 有效菌。（必要时做生化实验） 选择性培养基上长出的菌落并非都是有效菌， 培养基的选择性是相对的。 一种有效菌只在一种特定培养基上计数，不 同培养基上同一种有效菌不能累加。 细菌杂菌（包括放线菌）在培养细菌的培养 基上计数；霉菌和真菌杂菌在真菌培养基上 计数。但也不能重复计数。
3. 电子计数器计数法 工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小 孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔 时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在
电子记录装置上。
该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，
而不能区分是否为细菌。因此，要求菌悬液中不
含任何碎片。不适于微生物肥料产品的检测。
核酸计数法
稀释、加样和涂布注意事项
1.
整个程序应在无菌间或超净台内进行，操作人员时刻有 无菌概念 适宜稀释度：根据标准或企业提供的信息选择稀释度。 系列稀释时不同的稀释度应更换吸管（移液管），加样
微生物检测菌落总数测定方法
微生物学检验菌落总数的测定1 原理微生物活体数量的测定方法，常用平板培养计数法。
它是通过将样品制成均匀的一系列不同稀释度的稀释液，再取一定的稀释液接种，使其均匀分布于培养皿中特定的培养基内，最后根据在平板上长出的菌落数计算出每克（或mL ）样品中的活菌数量。
2 材料和仪器2.1 平皿：φ90mm 。
2.2 无菌锥形瓶：容量250mL ，500 mL 。
2.3 无菌吸管：1mL （具0.01mL 个度）,10mL （具0.1mL 刻度）或微量移液器及吸头。
2.4 灭菌锅。
2.5 恒温培养箱2.6 涂棒。
2.7 酒精灯。
2.8 超净工作台。
2.9 磁力搅拌器。
2.10 漩涡振荡器3 检验程序菌落总数的检验程序见下图。
方法①↙ ↘方法②↘ ↙4 操作步骤4.1 培养基和试剂的配制4.1.1 平板计数琼脂培养基：LB培养基（最常用）牛肉膏5g蛋白胨10g氯化钠5g琼脂20g蒸馏水1LpH 7.0～7.2将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH值，分装锥形瓶中，121℃高压灭菌30分钟。
4.1.2 无菌生理盐水的配制：称取8.5g氯化钠溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌30分钟。
4.2 样品的稀释：4.2.1 固体样品：称取10g固体样品置于盛有90mL无菌生理盐水的无菌锥形瓶中（内装数粒无菌玻璃珠），在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，制成1：10的样品均液，即10-1稀释液。
4.2.2用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品均液1mL（吸取前需要摇匀1：10稀释液），缓慢加入盛有9mL无菌生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不能触及稀释液面），用漩涡振荡器振荡，混合均匀，制成1：100的样品稀释均液。
4.2.3按照4.2.2操作程序，制备10倍系列样品稀释液，每递增稀释一次，换用一次1mL无菌吸管或吸头。
4.2.4 根据对样品活菌数量的估计，选择3~4个适宜稀释度的样品均液（比如10-6，10-7，10-8，10-9稀释液）。