双荧光素酶报告基因检测试剂盒
双荧光素酶报告基因实验步骤
双荧光素酶报告基因实验步骤实验目的：本实验采用双荧光素酶（Dual-Luciferase）报告系统，探究基因调控机制。
通过构建表达报告基因的质粒，研究不同因素对基因转录的影响。
实验材料：1. 双荧光素酶检测试剂盒（Promega）2. 293T细胞系3. Lipofectamine 2000转染试剂4. 培养基（DMEM + 10% FBS）实验步骤：1. 构建表达报告基因的质粒。
选择含有目标基因启动子区域的DNA片段，与质粒载体pGL3-基因报告载体连接，形成表达质粒pGL3-目标启动子-火萤酶（Luciferase）。
2. 细胞培养。
将293T细胞接种于6孔板中，培养至70-80%的稳定生长。
注意，细胞仅用到2×105个，否则检测结果会受内源性酶的影响。
3. 细胞转染。
将转染试剂与质粒混合，加入到细胞培养皿中。
注意，Lipofectamine 2000转染试剂与质粒的比例应按照转染试剂说明书进行调整。
4. 点亮荧光素酶（Luciferase）。
在细胞转染后48小时，加入荧光素酶检测试剂和积木酶抑制剂，使细胞产生发光，并通过微量板阅读器记录荧光值。
5. 关闭荧光素酶（Luciferase）。
在荧光素酶检测试剂作用后加入积木酶检测剂，称为“阻滞液”，使细胞发出的光信号被阻断。
加入Renilla荧光素酶检测试剂，使细胞重新产生新的发光信号，并通过微量板阅读器记录荧光值。
6. 数据统计。
按照公式计算相邻荧光信号的比值（荧光素酶/Renilla荧光素酶），以此作为表达目标启动子的相对活性。
（注意，双荧光素酶检测试剂盒中已包含此项标准）实验结果：通过双荧光素酶报告系统，研究了不同生物因素对基因转录的影响。
在细胞实验中，通过记录不同重复单元（replicate）的相对活性，为科研人员提供基因调控机制的新思路。
（数据统计请参照附表）结论：本实验采用双荧光素酶报告系统，通过构建表达报告基因的质粒，检测对基因转录的影响。
双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明
双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明一、测定原理：双荧光素酶报告基因检测试剂盒的原理基于双荧光素酶系统。
该系统由两个互补性的荧光素酶组成：荧光素酶1（Fluc）和荧光素酶2（Rluc）。
荧光素酶1通过氧化反应使荧光素发出蓝色荧光，而荧光素酶2通过氧化反应使荧光素发出绿色荧光。
同时，两个荧光素酶都能够自催化反应，从而有效降低假阳性结果的发生。
二、实验步骤：1.取适量细胞或组织，使用含有测试物的培养基或缓冲液进行处理。
2.将细胞或组织溶解，并离心收集上清液。
3.加入测试试剂盒提供的荧光素底物混合液，共孵育一段时间。
4.使用荧光分析仪测量反应混合物中蓝色和绿色荧光的强度。
5.根据荧光信号的强度计算得出相应的基因表达水平。
三、注意事项：1.本试剂盒需要严格按照说明书操作，避免操作失误导致结果错误。
2.在每一步操作前，请先将试剂保持在合适的温度下，以确保试剂的活性。
3.细胞或组织样本的采集、溶解和上清液的收集需要严格按照操作规范进行，避免样本的损失和污染。
4.在孵育过程中，避免剧烈振荡或震动，以免影响荧光素酶反应的进行。
5.在测量荧光强度时，确保荧光分析仪的参数设置正确，并注意避光操作，以免干扰荧光信号的测量。
四、结果解读：根据测量得到的蓝色和绿色荧光强度，可以计算得到相应的基因表达水平。
一般来说，荧光素酶1的荧光强度与被检测基因的表达水平成正比，而荧光素酶2的荧光强度则用作内参对照。
通过计算荧光素酶1与荧光素酶2的比值，可以更准确地反映被检测基因的表达水平。
结果解读时需要注意的是，双荧光素酶报告基因检测试剂盒只能提供相对量化的结果，无法给出绝对的基因表达水平。
因此，在结果解读时需要结合其他实验数据和相关文献进行综合分析。
总结：双荧光素酶报告基因检测试剂盒是一种常用的基因表达水平检测工具，该试剂盒通过双荧光素酶系统实现对基因表达水平的测定。
在使用时需严格按照说明书操作，注意操作规范和注意事项。
结果解读时应综合考虑其他实验数据和相关文献，以得到准确可靠的结论。
双荧光素酶报告基因检测系统——更亮、更快、更准
双荧光素酶报告基因检测系统——更亮、更快、更准产品背景双荧光素酶报告基因常用于启动子对基因表达影响的研究。
将所研究目的基因的调控序列克隆到含有报告基因的表达质粒中，然后将重组质粒导入适当的细胞系，通过测定报告基因表达的水平来间接评价在调控序列指导下启动子对基因表达的诱导作用。
荧光素酶是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性荧光素酶，转录后无需修饰即具有报告基因的功能。
产品原理萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）大小为61KDa，单亚基蛋白，能够催化荧光素（luciferin）氧化，生成氧化荧光素oxyluciferin；海肾荧光素酶（Renilla luciferase）为36 KDa的单亚基蛋白，能够催化腔肠素（coelenterazine）氧化形成coelenteramide。
二者在翻译后均无需修饰即可发挥作用。
通常情况下，海肾荧光素酶作为内肾，用以减少内在因素的某些变化对实验所造成的影响。
该试剂盒先对转染后的细胞进行裂解，然后以荧光素为底物检测萤火虫荧光素酶的活性，之后在淬灭该荧光反应的同时，以腔肠素为底物检测海肾荧光素酶报告基因的活性；具有检测信号强、线性范围广、无内源活性干扰等特点。
产品特点裂解能力更强：能够彻底裂解绝大部分种类细胞。
信号更强：能够精准检测弱启动子的表达。
灵敏度更高：可检测低至10‐20摩尔荧光素酶分子。
线性范围更广：线性检测范围超过酶浓度的8个数量级。
操作流程加入海肾荧光素酶反应液的作用1：淬灭萤火虫荧光素酶的发光 2：加入海肾荧光素酶的底物腔肠素产品数据检测试剂和荧光素酶相互作用，可获得最佳的发光强度，加入海肾荧光素酶底物后，萤火虫荧光素发光淬灭情况：基本能够完全淬灭。
产品价格产品订购FAQQ1：双荧光素酶报告基因最适反应温度？A：室温（20-22℃）。
反应时各个组分（细胞裂解产物，底物工作液等）都需要调整到室温。
此两种荧光素酶的反应速率是受温度影响的，为了保证实验的一致性，我们推荐此两种工作液在检测时都孵育至室温。
双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明
使用说明：
1. 裂解细胞：将报告基因细胞裂解液充分混匀，按如下方式加入报告基因细胞裂解液，充分裂解细胞。
对于贴壁细胞：吸尽细胞培养液后可以直接加入报告基因细胞裂解液；
对于悬浮细胞：离心去上清后加入报告基因细胞裂解液。充分裂解后，10,000-15,000g离心3-5分钟，取上清用于测定。 注：细胞裂解后可以立即测定荧光素酶，也可以先冻存，待以后再测定。冻存样品需融解，并达到室温后再进行测定。
得到的比值来比较不同样品间目的报告基因的激活程度。
对照。
6. 在完成上述测定萤火虫荧光素酶步骤后，加入100微升Renilla荧光素酶检测工作液，用枪打匀或用其它适当方式混匀后测
定RLU(relative light unit)。 7. 在以Renilla荧光素酶为内参的情况下，用萤火虫荧光素酶测定得到的RLU值除以Renilla荧光素酶测定得到的RLU值。根据
来说，如果不分装使用三次(期间冻融三次)，对测定结果无明显影响。 ¾ 样品和测定试剂混合后，必须等待1-2秒，再进行测定。测定时间通常为10秒，根据情ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ也可以测定更长或更短时间，但
是同一批样品最好使用相同的测定时间。 ¾ 特别注意：Renilla荧光素酶检测工作液后需配制后立即使用，不可配制成工作液后长期保存。Renilla荧光素酶检测
双荧光素酶报告基因实验的一些影响因素及注意事项
双荧光素酶报告基因实验的一些影响因素及注意事项双荧光素酶报告基因实验的一些影响因素及注意事项1．报告基因检测受多种因素影响（载体状态、细胞状态、转染量、转染效率、裂解效率、加样精度、检测过程等），因此同批次样品检测值也可能出现浮动。
所以实验一般需要做3个或3个以上复孔，并且引入另一个报告基因作为内参。
2．细胞培养时间不宜过长，12-36h内最好；长时间培养后，细胞难裂解。
3．双荧光素酶报告基因的载体选择：a)萤火虫荧光素酶建议选取pGL-3或pGL-4的载体或自己构建相应的载体；b)海肾荧光素酶建议选取phRL-TK或pGL-4代载体或自己构建相应的载体。
建议海肾载体不使用强启动子（如SV40、CMV），而选用中等强度的启动子（如TK）。
4．双荧光素酶报告基因的载体比例：根据实验具体情况调整。
建议作一个预实验来调整（萤火虫载体与海肾载体比例分别用1：10、1：20、1：50、1：100），萤火虫荧光素酶检测发光值大于海肾荧光素酶发光值的比例较好。
5．最适反应温度：室温（20-22℃）。
各个组分（细胞裂解产物，底物工作液等）都需要调整到室温。
6．双荧光素酶反应体积：20ul（细胞裂解产物）-100ul（萤火虫荧光素酶底物）-100ul（海肾荧光素酶底物），底物量可根据实际情况调整，但一定要保证底物过量，不然会造成检测结果出现大的偏差7．细胞裂解产物存放：常温不超过6小时；-20℃一个月；-80℃半年8．裂解产物与底物混合（手动加样）：要求混合快速、混合时间一致，避免荧光素酶衰变的影响。
9．发光半衰期：a)单荧光素酶检测试剂盒（E1500），萤火虫荧光素酶的`发光半衰期约12minb)双荧光素酶检测试剂盒（E1910），萤火虫荧光素酶的发光半衰期约9min，海肾荧光素酶的发光半衰期约2min10．检测结果检测前应检测孔板或空管的发光值，作为仪器发光背景值，Modulus多功能检测仪的仪器背景值应小于100；样品检测发光值应该远大于仪器背景值，例如10000。
双荧光素酶报告基因实验步骤
生物试剂双荧光素酶报告基因实验详解
如果要研究特定基因在体内的表达情况，常常采用转染法将双荧
光素酶报告基因植入目标细胞，在其表达后添加荧光素底物观察样品
中的荧光反应。
以下是使用该方法的实验步骤。
1. 构建双荧光素酶报告基因
首先需要构建双荧光素酶报告基因质粒，一般包括荧光素酶基因
和双荧光素酶基因，常用的是pGL3系列荧光素酶报告质粒和pRL-TK
双荧光素酶报告质粒，它们均是双质粒，具有耐药性和多克隆位点。
为了使荧光素底物反应在细胞中时产生荧光信号较强，需要在LUC和RLUC序列之前插入适当的顺式依赖启动子和增强子。
2. 细胞系的选择及转染
可以根据实验需要选择最适合的细胞系，例如HEK293、HeLa等。
将转染载体和搭配的化学试剂（如Lipofectamine 2000）按照实验方
案设定的比例混合，加入到无血清培养基中和细胞悬液混合，然后在
适当的时间内（如26-30小时）取样观察表达情况和筛选。
3. 荧光素底物检测
荧光素底物可以通过公司购买，也可以自制。
将荧光素底物溶解
在试剂液中，加入细胞中，等待几分钟可以看到发出荧光的细胞。
注意：在观察荧光之前，需在处理样品之前过滤荧光素底物以去除杂质。
另外，使用荧光计或流式细胞检测仪记录荧光信号，荧光信号强度与细胞内琥珀酸盐浓度成比例，可用于定量分析。
总之，双荧光素酶报告基因实验是一种重要的分子生物学技术，可以用于基因表达、基因调节和蛋白质交互作用研究等方面，具有广泛的应用前景。
双荧光素酶报告基因检测试剂盒
双荧光素酶报告基因检测试剂盒双荧光素酶报告基因检测试剂盒是一种用于检测报告基因表达水平的试剂盒。
报告基因是在转染实验中用来评估转染效率和细胞活性的基因，常见的报告基因包括荧光素酶、β-半乳糖苷酶等。
双荧光素酶报告基因检测试剂盒通过测定转染细胞中荧光素酶的活性，从而反映报告基因的表达水平，是科研实验室中常用的实验技术之一。
双荧光素酶报告基因检测试剂盒的原理是利用荧光素酶底物来测定细胞中荧光素酶的活性。
荧光素酶底物在荧光素酶的作用下发生化学反应，产生发光信号，通过测定发光信号的强度来间接反映报告基因的表达水平。
双荧光素酶报告基因检测试剂盒具有灵敏度高、操作简便、结果稳定可靠等特点，广泛应用于基因表达调控、信号转导、药物筛选等领域。
使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒进行实验时，首先需要将转染后的细胞加入培养基中，然后加入荧光素酶底物，经过适当的反应时间后，用微量板阅读器或活体成像系统测定发光信号的强度。
根据发光信号的强度可以判断报告基因的表达水平，进而评估转染效果和细胞活性。
双荧光素酶报告基因检测试剂盒的应用范围非常广泛，不仅可以用于体外细胞实验，还可以应用于体内动物实验。
在基因敲除、基因过表达、siRNA干扰等实验中，双荧光素酶报告基因检测试剂盒都可以发挥重要作用。
此外，双荧光素酶报告基因检测试剂盒还可以用于药物筛选实验，评估药物对细胞活性的影响，为药物研发提供重要参考。
总的来说，双荧光素酶报告基因检测试剂盒是一种在分子生物学实验中应用广泛的试剂盒，具有灵敏度高、操作简便、结果稳定可靠等特点，为科研人员提供了重要的实验工具。
在今后的科研工作中，双荧光素酶报告基因检测试剂盒将继续发挥重要作用，为基因表达调控、信号转导、药物筛选等领域的研究提供有力支持。
双荧光素酶报告基因检测试剂盒
双荧光素酶报告基因检测试剂盒导言近年来，基因检测技术在生物医学领域的应用越发广泛，为医生们提供了更多的疾病预防和治疗的手段。
其中，双荧光素酶报告基因检测试剂盒是一项基于PCR技术，结合双荧光素酶发光原理，经过特殊的检测报告基因分析、得出结果的高新技术产品。
本文将从介绍双荧光素酶报告基因检测试剂盒的技术原理、检测流程等方面进行详细阐述。
技术原理双荧光素酶报告基因检测试剂盒采用了双荧光素酶发光原理，基于PCR技术代替了传统的差凝法、凝胶法、S-NAT等常规检测方法，新一代的检测方法具有精准、快速、高效、灵敏度高等优点。
针对疑难杂症、高危人群的诊断与筛查，有着不可替代的作用。
检测流程首先，收集患者的生物样本，包括血液、唾液等，进行DNA 提取。
然后，应用PCR扩增技术，将关键目标序列扩增，再进行双荧光素酶与基因序列的结合，使得复合物能够显现荧光物质。
最后通过特殊的光谱仪检测荧光物质的强度，得出结果。
优势特点本产品有着以下优势：1. 高灵敏度：检测结果的灵敏度高，能够检测到非常微小的变化，进而提高检测结果的可靠性；2. 高效率：检测时间短，较传统检测方法的效率大大提高，提升患者检测效率；3. 精准度高：基于PCR技术及双荧光素酶原理，减少了人为的操作失误，提高了检测数据的精准度，有助于医生做出更加准确的诊断；4. 检测结果直观：光谱仪显示荧光值，结果直观，比传统检测结果，操作人员容易理解，减少了数据误解。
结语随着科技的发展，双荧光素酶报告基因检测试剂盒作为一种高新技术产品，应用价值得到了广泛认可。
其潜在的临床应用前景，将会在未来的医疗领域中起到越发广泛和重要的作用。
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注意事项：
1) Fassay Buffer I和Fassay Substrate I应避免反复冻熔，可分装成合适体积分次使用。 Rassay Substrate II溶液应盖严存放，避免蒸发。配制好未用完的Fassay Reagent I和 Rassay Reagent II可在-20℃保存1月左右。
自动发光测定：
配制好的Fassay Reagent I和Rassay Reagent II置于测定仪内并连接好对应管道，Fassay Reagent I接第一注射管道，Rassay Reagent II接第二注射管道。各待测样品20 μl分别加 入测定管/板孔底部，启动自动测量程序。记录Firefly luciferase和Ranilla luciferase的发光 单位(RLU)。
测定前，在室温待Fassay Buffer I、Fassay Substrate I和Rassay Buffer II溶化，混匀（注意 避光）。按20/1比例用Fassay Buffer I稀释Fassay Substrate I，按50/1比例用Rassay Buffer II 稀释Rassay Substrate II，分别配制所需体积的Fassay Reagent I和Rassay Reagent II（注意 避光）。
2) 细胞裂解液一般在当天测定。如需隔日测定，应将样品于-20℃保存。长期保存应 在-80℃。测定样品量可为10~30μl个样品的两种试剂加入时间间 隔一致。
4) Rassay Reagent II可用于直接测定样品的Ranilla luciferase。需要注意的是，Rassay Reagent II直接测量的RLU要比双荧光素酶顺序检测获得的RLU高一些（反应体积 等因素的影响）。
产品内容与储存方法：
名称
数量 保存条件
5x Universal Lysis Buffer (通用裂解液) 25 ml -20℃
Fassay Buffer I (虫酶缓冲液)
10 ml -20℃
Fassay Substrate I (虫酶底物)
0.5 ml -20℃
Rassay Buffer II (海酶缓冲液)
本试剂盒提供了一体化形式的双荧光素酶检测系统。采用通用裂解缓冲液，适合于 两种荧光素酶活性的保持，且与其他类型的报告基因检测和蛋白含量检测兼容；优 化的两种酶反应体系，使每种发光反应持续数十分钟，以便于手工操作多个样品； 并保证Firefly luciferase发光及时淬灭，不影响后续Ranilla luciferase的测定；优化的 反应体系还使两种荧光素酶活性比值趋于合理的敏感范围，更有利于后续数据的比 较。
电子邮件：runon@
1xULB，混匀。1xULB可在4℃存放数周。 2) 细胞清洗：倾去培养板/皿中的培养液，加入足量PBS，轻轻洗涤细胞。完全倾去
洗涤液。 3) 细胞裂解：推荐按照表中的体积，在孔/皿中加入1xULB，混匀。培养板可在微型
振荡器上震荡5~10 min；培养皿可直接用细胞刮刀刮下细胞，将细胞悬液移入1.5 ml
威格拉斯生物技术（北京）有限公司
双荧光素酶报告基因检测试剂盒
(Dual-Lucy Assay Kit)
产品说明：
报告基因检测，是真核基因表达调控研究的常用方法。由于检测光量子的方法非常 敏感，采用生物发光(bioluminescent)法，是报告基因检测最常用的有效手段。荧光 素酶(luciferase) 催化底物荧光素的转化，发射出光子。萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)和海肾荧光素酶(Ranilla luciferase)催化的发光反应，具有相似的光学特征 和很好的浓度线性范围(7~8个数量级的线性范围)，酶的检测灵敏度达10-18mol到 10-20mol，但两者催化的化学反应底物和最适反应条件完全不同。这两种荧光素酶配 合形成了十分有效的双荧光素酶报告基因系统，其中Ranilla luciferase通常作为内参 照。
10 ml -20℃
Rassay Substrate II (海酶底物)
0.2 ml -20℃
可作100次双荧光素酶检测。低温运输，-20℃或-80℃避光保存。有效期6个月。
所需其它试剂：
使用者需准备PBS 、双蒸水等。
操作方法：
裂解细胞： 1) 新鲜配制裂解液：临用前，取适量5xUniversal Lysis Buffer (ULB)，用双蒸水稀释至
测定仪器的设置：
按仪器操作说明开启发光测定仪。手动操作型仪器，将测读时间设为10~20秒。自动操 作型仪器，一般将测定延迟设为2秒，将测读时间设为10~20秒，Fassay Reagent I和Rassay Reagent II的注入体积设定为100 μl。 手动发光测定：
取待测样品20 μl加入测量管底部，取Fassay Reagent I 100 μl加入管底部，轻轻敲击管壁 3~5次混匀，放入仪器中立即测定，记录发光值为Firefly luciferase的发光单位(RLU)； 取Rassay Reagent II 100 μl加入管底部，轻轻敲击管壁3~5次混匀，放入仪器中立即测定 ，记录发光值为Ranilla luciferase的发光单位(RLU)。如用多孔板同时手动测定多个样品 ，则将各待测样品20 μl分别加入连续的各孔底部，用多道加样器于各孔底加入Fassay Reagent I 100 μl，轻轻敲击板侧3~5次混匀，放入仪器中立即测定，记录发光值为Firefly luciferase的发光单位(RLU)；取Rassay Reagent II 100 μl立即加入管底部，轻轻敲击板壁 3~5次混匀，放入仪器中立即测定，记录发光值为Ranilla luciferase的发光单位(RLU)。
表：不同容器细胞所需1xULB的体积。
96孔板
48孔板
24孔板
12孔板
6孔板 35 mm平皿 60 mm平皿
30µl
60µl
120µl
250µl
500µl
500µl
1000µl
电话：（010）58941231, （010）58941232 传真：（010）58941232
网址：
电话：（010）58941231, （010）58941232 传真：（010）58941232
网址：
电子邮件：runon@
威格拉斯生物技术（北京）有限公司
离心管，在涡旋振荡器上充分混悬震荡30秒。裂解细胞悬液可直接用于发光测定 ，也可离心30秒，取上清做发光测定。 配制发光反应液：