pCambia35s-ECFP植物表达载体
转基因植物常见外源基因及内参基因
NPTⅡ：（大肠杆菌，Escherichia coli，strain K12）新霉素-3’-磷酸转移酶。[neomycin-3’-phosphotransferase]
PAT：草丁膦乙酰转移酶。[phosphinothricin acetyltransferase]
李德安转基因植物常见外源基因及内参基因内参基因
转基因植物常见外源基因及内参基因
内参基因：
Gos：（大米，Oryza sativa）
Ivr：（玉米，Zea mays）转化酶1。[invertase 1]
Lectin：（大豆，Glycine max）植物血凝素。
Patatin：（马铃薯，Solanum tuberosum）块茎贮藏蛋白。
NOSterminator：（根瘤农杆菌，Agrobacterium tumefaciens）烟酰碱合成酶基因终止子。[nopaline synthase]
外源基因：
ACCD：1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶。[1-aminocyclopropane-1-carbox1A(b/c)：（苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种，Bacillus thuringiensissubsp. Kurstaki，strainHD-1 and HD-73）杀虫晶体蛋白b和c的融合蛋白，对鳞翅目昆虫尤其有效。
Cry3A：（苏云金芽孢杆菌拟步行甲亚种，Bacillus thuringiensissubsp. Tenebrionis，strain BⅠ256-82）杀虫晶体蛋白，对科罗拉多马铃薯甲虫（Colorado patato beetle）的幼虫尤其有效。
Pg：（蕃茄，Lycopersicon esculentum）多聚半乳糖醛酸酶[polygalacturonase]
转基因植物35S基因核酸检测试剂盒说明书
转基因植物35S基因核酸检测试剂盒说明书转基因植物35S基因核酸检测试剂盒说明书试剂盒简介货为了适应新加坡石斑鱼虹彩病毒染料法荧光定量PCR试剂盒快速检测和疫病研究的需要，本公司参照 OIE国际标准中规定的引物序列，经多次实验及系统优化，开发生产了本试剂盒。
应用本试剂盒进行检测具有快速、灵敏、特异、准确、安全操作简单、应用广泛和高通量检测等特点及优点。
试剂盒组成及试剂配制：酶联板（Assay plate）：一块（96孔）。
2.标准品（Standard）：2瓶（冻干品）。
3.样品稀释液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶4.生物su标记抗体稀释液（Biotinantibody Diluent）：1×10ml/瓶。
5.辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液（HRPavidin Diluent）：1×10ml/瓶。
6.生物su标记抗体（Biotinantibody）：1×120μl/瓶（1：100）7.辣根过氧化物酶标记亲和素（HRPavidin）：1×120μl/瓶（1：100）8.底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。
9.浓洗涤液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
10.终止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
样本处理及要求：1.血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于20℃或80℃保存，但应避免反复冻融。
2. 血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 8°C 1000g离心20分钟，或将标本放于20℃或80℃保存，但应避免反复冻融。
3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。
用于植物基因表达载体构建的质粒改造及其应用
用于植物基因表达载体构建的质粒改造及其应用安韶雅;虎娟;张虹;孙放;马霞;王晨;陈任【摘要】为克服目前常用于植物基因表达载体构建的质粒所具有的酶切位点有限,目的基因片段难于插入和连接,缺少植物基因表达所必须的启动子、终止子、筛选标记等功能元件的缺点,本研究构建了一个用于植物基因表达载体构建的质粒栽体pNULPGE200.该质粒载体引入了植物基因表达最常用的CaMV 35S启动子(cauliflowermosaic virus 35S promoter)和NOS终止子(nopaline synthase terminator),以及之间的多克隆酶切位点MCS(multiple cloning site).利用pNULPGE200构建植物基因表达栽体,经PCR等方法克隆得到的目的基因可以直接连接到35S启动子与NOS终止子之间,使目的基因能够在植物体内稳定表达;同时该质粒载体还具有独立表达的卡那霉素NPT Ⅱ (neomycinphosphotransferase Ⅱ)耐性基因和sGFP (synthetic green-fluorescent protein with S65T mutation)绿色荧光蛋白报告基因,可用于基因转化时的筛选.本研究以假单胞菌(Pseudomonas putida)携带质粒的二甲苯单加氧酶(xylene monooxygenase)编码基因为材料,分别利用本文质粒载体和常规的质粒栽体pBI121构建了植物表达栽体,验证了文中质粒栽体的实用性.%In order to overcome the defects that the commonly used plasmids have a limited number of restriction sites for target gene cloning, and lack expressing elements such as promoter, terminator and selection marker genes, a plasmid named pNULPGE200 for construction of plant gene expression vector was modified. The plasmid contains cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter, nopaline synthase (NOS) ter-minator, and a multiple cloning site between them. The target gene amplified by PCR can beinserted directly between the 35S promoter and the NOS terminator, and can be expressed in plants stably. pNULPGE200 also contains two independent expression marker genes, encoding neomycin phosphotransferase Ⅱ(NPT Ⅱ) and synthetic green-fluorescent protein with S65T mutation (sGFP), which can be used for mutual selection in plant transformation. The practicability of the plasmid was confirmed by comparing with a conventional plas-mid pBI121 in the construction of the gene encoding xylene monooxygenase from Pseudomonas putida to create a plant gene expression vector.【期刊名称】《生命科学研究》【年(卷),期】2018(022)002【总页数】8页(P114-121)【关键词】质粒改造;植物基因表达载体;载体构建;二甲苯单加氧酶基因【作者】安韶雅;虎娟;张虹;孙放;马霞;王晨;陈任【作者单位】宁夏大学宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室,中国宁夏银川750021;宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室,中国宁夏银川750021;宁夏大学生命科学学院,中国宁夏银川 750021;宁夏大学宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学生命科学学院,中国宁夏银川 750021;宁夏大学宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学生命科学学院,中国宁夏银川 750021;宁夏大学宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学生命科学学院,中国宁夏银川 750021;宁夏大学宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学生命科学学院,中国宁夏银川 750021;宁夏大学宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学生命科学学院,中国宁夏银川 750021;宁夏大学宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室,中国宁夏银川 750021;宁夏大学生命科学学院,中国宁夏银川 750021【正文语种】中文【中图分类】Q782自1984年首次获得转基因烟草[1]以来,以转基因技术为代表的植物基因工程技术的广泛应用为植物的遗传改良开拓了广阔的前景。
小麦育种中的分子标记技术应用研究
小麦育种中的分子标记技术应用研究小麦是世界上最重要的农作物之一，也是人类最古老的粮食作物之一。
在全球范围内，小麦是最广泛栽培和消费的作物之一，也是粮食产量最高的农作物之一。
然而，小麦的育种工作一直面临着许多困难和挑战，如繁殖周期长、杂交不易、基因广泛等。
随着分子生物学和生物技术的不断发展，分子标记技术被广泛用于小麦育种中，为小麦品种的改良和优化提供了有力的支撑。
一、分子标记技术在小麦育种中的应用分子标记技术是指对DNA分子上的一些特定区段进行检测和分析，以识别和区分不同品种或个体之间的遗传差异。
分子标记技术可以根据不同的检测方法分为PCR技术、RFLP技术、SSR 技术、AFLP技术、SNP技术等。
小麦育种中，分子标记技术主要应用在以下几个方面：1. 分子鉴定：通过对小麦中特定基因的片段进行PCR扩增，并用特定酶切方法对PCR产物进行测序和比对，从而快速鉴定小麦中的病原体、杂交种、杂交后代等。
这在小麦种质资源保护和繁殖中具有重要意义。
2. 密度图谱构建：通过对小麦不同基因座位的特定序列进行扩增和分子检测，可以构建小麦品种间的遗传连锁图谱，从而为小麦的基因组测序、基因图谱构建、群体遗传学研究等提供了必要的技术支撑。
3. 基因定位：通过对检测到的分子标记和相关表型性状进行关联分析，可以在小麦物理和遗传连锁图谱上精确定位相应的基因，进而揭示小麦重要性状的遗传机理，为小麦品种改良提供精确的分子标记和命中率高的候选基因。
4. FISH karyotyping：通过使用荧光原位杂交技术(FISH)，以小麦染色体的比较序列为探针，在活体细胞的染色体上进行显微分析，从而揭示小麦的染色体组成与结构，为小麦遗传变异和组合育种提供必要的基础支撑。
二、小麦育种中分子标记技术面临的问题和挑战虽然分子标记技术在小麦育种中具有重要意义，但也面临着一些问题和挑战。
1. 技术标准化问题：不同地区、不同实验室对分子标记技术的操作标准和质控要求存在差异，导致相同小麦品种的分子标记结果不一致，限制了小麦育种研究的进展。
DNA分子诊断技术在中药鉴定中应用
究,以阐明防治肝纤维化的现代作用机理中药复方抗肝纤维化的现代药理学研究包括药效学和药动力学,其中药效学研究开展的较早相对容易,但多数研究局限于药物效应方面,真正涉及到作用机制方面的研究还不广泛和深入。
而药动学的研究尚处在起步阶段,更深层次的研究较为少见,故中药复方药效学和药代动力学的研究应是今后重点研究方向之一。
由于中药复方对器官或组织的选择性不明显,药物活性不强烈,药效作用温和,往往长期服用才显现药效,所以应用中药复方进行抗肝纤维化的防治研究时应注意时效和量效关系的研究,但由于复方药物成分复杂,各药配合后药性、药效的变异,给复方抗肝纤维化的药动学研究增加了很多困难,所以目前从时效和量效关系方面着手的抗肝纤维化复方研究并不很多。
杜以兰等[3]提出采用由量—效关系和时—效关系求效量半衰期的方法研究其药动学。
还有人提出证治药动学伪说,根据证候与治疗的关系探讨方剂的效应,并相继提出“效应成分动力学”“中药复方活性成分群”等概念,代表了复方药理学研究的新思路。
中药复方抗肝纤维化的药效学和药动学研究是研究中药的药理效应及引起这种效应的有效成份在体内吸收、分布、代谢和排泄等量变规律的科学,可为临床抗肝纤维化时合理用药,优选用药方案及精选复方中的药味提供重要的理论依据,所以应是中药复方抗肝纤维化现代研究中新的研究思路和研究方向。
综上所述,若能立足于中药复方抗肝纤维化多靶点、多环节、多层次的整体优势,把握肝纤维化复杂的病理变化,建立起方证相符的病理学模型,有效开展中药复方的药理学研究,以中医理论为指导,筛选出疗效确定、临床与实验结果一致、经得起重复的复方制剂,那么,相信中药复方抗肝纤维化的防治研究和临床疗效将会跨上一个新的台阶。
参考文献:[1]王宝恩.中药复方861冲剂治疗肝纤维化远期疗效的观察[J ].中西医结合肝病杂志,1993,1(2):69.[2]董筠.乙肝抗纤方治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的临床与实验研究[J ].南京中医药大学学报,1998,14(6):335-338.[3]李成韶,杜以兰.以药效为指标进行中药药动学研究的思路和体会[J ].中药药理与临床,1998,4(1).(收稿日期:2004-03-16)DNA 分子诊断技术在中药鉴定中应用刘雯霞1 雷国莲2(1.陕西中医学院研究生,陕西咸阳712046;2.陕西中医学院药学系生药教研室,陕西咸阳712083)摘 要:综述DNA 分子诊断技术在中药鉴定中的应用研究,重点论述分子诊断技术的分类及常用RAPD 技术,AFL P 技术及基因片段序列研究状况。
利用凝胶扩散法测定刺萼龙葵种子中β-甘露聚糖酶的活性
利用凝胶扩散法测定刺萼龙葵种子中β-甘露聚糖酶的活性β-甘露聚糖酶是一种重要的水解酶，广泛存在于植物、微生物和动物组织中，是一种能够水解β-甘露聚糖的酶类。
β-甘露聚糖酶在许多生物学过程中起着重要作用，比如在植物的生长发育、细胞壁代谢、应激响应等方面都发挥着重要的作用。
研究β-甘露聚糖酶的活性对于理解植物生长发育和抗逆性有着重要的意义。
刺萼龙葵（Solanum aculeatissimum Jacq.）是茄科植物中的一种，广泛分布于南美洲和亚洲热带地区，又名刺浆果茄，具有较高的经济价值和药用价值。
刺萼龙葵的种子中富含β-甘露聚糖酶，因此利用凝胶扩散法测定刺萼龙葵种子中β-甘露聚糖酶的活性，可以为深入研究刺萼龙葵的生物学特性提供重要依据。
本文将介绍利用凝胶扩散法测定刺萼龙葵种子中β-甘露聚糖酶活性的方法和步骤，并对测定结果进行初步分析和讨论，旨在为该领域的研究工作提供理论和实验基础。
一、实验材料与方法1. 实验材料（1）刺萼龙葵种子：新鲜采集的刺萼龙葵种子；（2）β-甘露聚糖酶提取液：含有一定浓度的β-甘露聚糖酶的提取液；（3）琼脂：用于制备凝胶；（4）碘液：用于染色检测。
2. 实验方法（1）β-甘露聚糖酶提取将刺萼龙葵种子磨碎并加入适量的缓冲液进行提取，通过离心等操作获得β-甘露聚糖酶提取液。
（2）制备琼脂凝胶将琼脂按照说明书中的方法配制成适当浓度的琼脂溶液，并倒入培养皿中，待凝固后在表面钻孔。
（3）凝胶扩散反应在琼脂凝胶上均匀涂布一定浓度的β-甘露聚糖酶提取液，再在固定位置上钻孔注入碘液，观察并测定孔周围的清晰圈和直径。
二、实验结果与分析通过上述实验方法，我们成功利用凝胶扩散法测定了刺萼龙葵种子中β-甘露聚糖酶的活性。
观察结果显示，在琼脂凝胶表面形成了一定大小的清晰圈，且直径随着β-甘露聚糖酶提取液中酶活性的增加而增大。
这表明刺萼龙葵种子中存在一定浓度的β-甘露聚糖酶，并且具有一定的活性。
从实验结果可以初步推断，刺萼龙葵种子中β-甘露聚糖酶的活性较高，这与刺萼龙葵种子中富含β-甘露聚糖酶的特点相吻合。
各种表达载体
表达载体一、原核细胞表达载体1. pBAD载体:特点; 该表达质粒含有araBAD(arabinose)操纵子的P BAD启动子和编码该启动子的正负调控子基因araC，具有紧密调控功能和高水平表达外源蛋白质的原核细胞表达载体。
请注意:1. 当要扦入其他信号肽片段，改建此载体时，请不要利用该载体上的Nde1 EcoR1 BamH1 Kpn1和Pst1位点，以免造成重组困难，因为前述内切酶在此载体上均有二个位点，最好使用只有一个酶切位点的Sac1和Hind111位点。
同时记住，如在不含任何信号肽的P BAD表达质粒扦入信号肽，其非编码N-末端要包含核糖体结合位点(RBS)核苷酸序列。
2在使用含Omp A分泌信号肽的P BAD表达质粒时，请应用Omp A分泌信号肽上的Sac1以及载体Hind111酶切位点，这些在载体序列上都是单个酶切位点。
本公司目前有含Omp A分泌信号肽和不含任何信号肽的二种P BAD表达质粒，其多克隆位点区域图谱如下:(a)、含Omp A分泌信号肽的P BAD表达质粒多克隆区域SDP BAD….TACCCGTTTTTTTCC….GCTAGCAGGAGGAAACG ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGTA M ATTC GCT ACC GTA GCC ATG GCC GAG CTC GGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTTNco1 Pst1 Hind111 (b)、不含分泌信号肽的P BAD表达质粒多克隆区域EcoR1 Kpn1 BamH1 Pst1P BAD….TACCCGTTTTTTTGG.GCTAGCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTTNde1 Sac1 Smal 1 Hind111下图显示本公司应用pBAD表达载体完成的实验结果:pBAD载体驱动大分子蛋白质在原核细胞Origami(DE3)内高效表达2. pCAl-n & pCAl-pelB载体特点: 该原核细胞表达载体是来源于以T7 RNA聚合酶为基础的pET载体，含有T7/LacO启动子、编码钙调素结合多肽标鉴和凝血酶切点的核苷酸序列。
质粒测序引物（DOC）
p B42ADF p BMN_5' BAC1 p BAD-F p BAD-5' T3/M 13rev p BD-GAL4-F 35S GAL4-Bdfor M 13F/T7 T3/M 13rev T3/M 13rev T3/M 13rev T3/M 13rev PBRforBam p BRforEco PBRforBam PBRforBam GAL4-Bdfor not available T3/M 13rev T7 T3 CM V-Profor,T7 EF-1α Fwd CM V-Profor,T7 p BV220F T7/Tac-Profor
p DSRED-N-R T7/ M 13R T7/ M 13R（距离插入位点合适， 优先安排） M 13R（距离插入位点合适，优 先安排）
p EASY-T 1 p EASY-T 3 p ECFP-N(C) p EF/my c/cyt o/ER/mit o/nuc p EF1(4,6/my c-His) p EF1(4,6/V5-His) p EF1(4;6/His_A;_B;_C) p EF5/FRT /V5-D(-T OPO) p EGFP p EGFP-1 p EGFP-C p EGFP-C1 p EGFP-C2 p EGFP-C3 p EGFP-F p EGFP-N p EGFP-N1 p EGFP-N2 p EGFP-N3 p ENT R p ET -11(-a,-b,-c,-d) p ET -12(-a,-b,-c) p ET -14b p ET -15b p ET -16b p ET -17b p ET -17xb p ET -19b p ET -20b(+) p ET -21(-a,-b,-c,-d)(+) p ET -22b(+) p ET -23(-a,-b,-c,-d)(+) p ET -24(-a,-b,-c,-d)(+) p ET -25b(+) p ET -26b(+) p ET -27b(+) p ET -28a(-b,-c)(+) p ET -29a(-b,-c)(+) p ET -3(-a,-b,-c,-d) p ET -30_Ek/LIC p ET -30_Xa/LIC p ET -30a(-b,-c)(+) p ET -31b(+)