植物表达载体构建与遗传分析

分离获得的目的基因往往不具有 完整的基因结构，而只是表达产物的 可读框（ORF：open reading Frame）； 还需加上启动子和终止子。
如果分离到的目的基因拥有完整 的基因结构（即拥有启动子、表达产 物的开放阅读框和终止子），因基因 的表达特点不符合要求也需进行修饰 改造；有些基因例外，如C4光合代谢 途径的一些关键酶基因只能用原基因 的所有完整结构才有可能达到目的。
启动子（promoter）
启动子是位于基因的5’端外测，紧 挨转录起始位点一段非编码的核苷酸 序列，它的功能是引导RNA聚合酶同基 因的正确部位相结合；
终止子（terminator）
终止子是在基因3’端下游外测与 终止密码相邻的一段核苷酸序列，具 有转录终止信号的功能。
一）影响构建植物表达载体的 主要因素
1）限制性内切酶;
2、工具酶
2）T4 DNA连接酶; 3）RNaseA; 4）CAIP; 5) Taq DNA 聚合酶
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二、植物遗传转化研究进展
1、遗传转化效率
转化效率因转化再生体系与之相 结合的转化方法，造成许多作物的转 化植株出现嵌合体与育性问题，导致 遗传转化效率比较低。
第七章 植物表达载体构建与 遗传转化
植物基因工程
植物基因工程以植物为对象，将 从不同生物中分离到的基因，经酶切 连接构成重组DNA分子，然后转入受 体植物细胞使新基因在受体细胞内整 合、表达，获得新的植物类型，再生 植株通过无性或有性增殖将外源基因 遗传给后代。
植物基因工程的作用与意义
植物基因工程能顺利地在不同物 种间进行基因转移，因此育种学家可根 据意愿改造植物的一些性状，在较短时 间内使获得高产、优质、抗逆性强的作 物新品种成为现实。
3) pUC19:克隆载体，用于构建含2x35S启 动子和35S poly(A)载体，从华美公司购买。 4) pSCL0041植物表达载体:在左右边界 内含有hyg和带内含子的gus基因，且各自 带有35S启动子和35S poly(A)、nos poly(A)。外源基因的启动子为2x35S，终 止子为35S poly(A) 。
1)目的基因的结构特点； 2)转化受体植物类型与种类； 3)转化方法； 4)转入受体植物的表达要求； 5)植物表达载体类型； 6)选择适宜的启动子与终止子； 7)选择性标记基因及报告基因；
(二）构建植物表达载体的一些 基本知识与实验技能
从事植物表达载体构建工作主要 是进行各种质粒的提取、纯化、酶切、 相关DNA片段的回收、连接、转化与验 证等，需要一些分子生物学相关的知 识和实验技能。
植物基因工程主要研究内容 1) 目的基因的克隆与分离；
2) 3) 4) 5) 6) 7) 植物表达载体构建； 建立适宜的遗传转化再生体系； 遗传化即转基因； 转化细胞或植物的筛选； 转化植株检测； 转基因植物环境释放的安全评价。
一、植物表达载体构建
构建植物表达载体的目的
构建植物表达载体的主要目的是 将目的基因进行修饰改造，使其转入 受体植物后的表达符合目的需要。
三）植物表达载体构建实例
1、 质粒
构建含不同启动子的植物表载体， 用到pUCpepc、pSCL0041、 pUC19、 pBI121四个不同的质粒。
1）pUCpepc:为pUC19克隆载体，
经XbaI内切酶位点插入甘蔗C4Ppc基 因，抗性为Amp，由张木清研究员提 供。 2）pBI121：植物表达载体，内含gus 和nptII基因,启动子为35S,终止子为 nos poly(A)，由本所陈平华博士提 供。
2、遗传转化与安全性
转基因研究中另一个焦点是转基 因植物及产品的安全性问题，根据转 化的对象不同通过选择不同的选择标 记基因、使用Cre-lox重组系统或质体 转化等手段解决。
3、定向转化
在植物中IR> HR几个数量级，因此不 能定向插入外源基因。原因：外源DNA进 入基因组时，与双链DNA发生断裂后进行 修复时机制在前关：同源重组修复（HR） 为主时外源基因按定向插入，非同源末端 连接重组修复（NHEJ）时则能达到外源基 因不能定向插入。而 Physcomitrella （moss基因组大小与水稻相当）能定向插 入。
常用的基本技能：
1)大肠杆菌、农杆菌的培养、继代与保 存； 2)大肠杆菌、农杆菌中的质粒小量提取、 大肠杆菌中质粒大量提取与纯化； 3)各种质粒载体的酶切，回收； 4)大肠杆菌与农杆菌感受态细胞的制备； 5)相关酶切DNA片段的连接与转化； 6)PCR引物设计与检测。
进行植物表达载体构建时，根据 所选载体的内切酶位点进行准确设计 是工作的关键；但是这种仅仅基于分 子生物学常识的设计不一定能保证成 功，还有许多未知因素影响实验工作， 能及时发现问题及并进行再次的合理 设计有助于加快工作进度。
从理论上讲，一个好的遗传 转化体系应能解决嵌合体及育性 问题。即受体再生系统要再生效 率高、再生植株可育且不受基因 型影响；另外，两者相互较好地 匹配。
而实际上，由于多种因素 的影响如转化方法要高效、被 转化的部位与可转化再生部相 同等问题至今仍未能很好解决。
农杆菌介导转化技术比较 简单，但转化有基因型依赖、 质粒与菌株特异性。