DNA甲基化检测方法
DNA甲基化研究方法
DNA甲基化研究方法DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰形式，常见于生物体细胞中。
它在维持基因转录调控、胚胎发育、细胞分化以及肿瘤形成等过程中起着关键的作用。
因此，研究DNA甲基化的方法对于深入理解生物学和疾病发生机制具有重要的意义。
在接下来的1200字内，我将为您介绍几种常用的研究DNA甲基化的方法。
1.甲基化特异性限制酶消化（MSRE）：该方法利用能够识别并切割甲基化CpG岛的特异性限制酶来分析DNA甲基化水平。
首先，将DNA进行酶切，然后通过聚合酶链反应（PCR）扩增消化后的DNA片段。
最后，利用各种技术如限制性片段长度多态性（RFLP）分析、单体型检测或测序等方式来检测PCR产物是否被酶切。
甲基化的区域将在PCR产物中产生一个酶切位点的改变，从而可以推断原始DNA的甲基化状态。
2.甲基化特异性PCR（MSP）：MSP是一种常用的研究甲基化的方法，它结合了甲基化特异性限制酶消化和PCR扩增的优点。
首先，在甲基化和非甲基化的DNA样品中进行DNA甲基转化反应，将所有未甲基化的胞嘧啶转化为脱氧尿嘧啶。
接下来，使用特异性引物来扩增甲基化和非甲基化的DNA。
扩增产物可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法来检测甲基化状态。
3.甲基化特异性PCR串联扩增（MSP-COOM）：MSP-COOM是一种修饰的MSP方法，它可以同时分析多个CpG位点的甲基化状态。
在该方法中，将样本DNA修饰成两种不同的状态（一种代表甲基化，一种代表非甲基化），然后再进行PCR反应。
扩增产物可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法来检测多个甲基化位点的状态。
4.甲基化敏感限制性内切酶-PCR（MSRE-PCR）：该方法利用MSRE和PCR的组合，可以对CpG岛中的甲基化位点进行定量分析。
首先，将DNA 进行MSRE消化，保留未甲基化的DNA片段。
然后，在未甲基化DNA片段的末端引入一个特定序列，以便在PCR扩增中使用特异性引物。
扩增产物可以通过定量PCR等方法来分析未甲基化的DNA的含量，并间接推断出原始DNA的甲基化水平。
dna甲基化检测方法
DNA甲基化检测方法引言DNA甲基化是一种常见的基因表达调控方式，可以影响基因的转录和表达，以及细胞分化和发育等生物学过程。
因此，对DNA甲基化状态的准确检测和分析对于理解疾病发生发展机制以及预防和治疗疾病具有重要意义。
本文将介绍几种常用的DNA甲基化检测方法，并对它们的原理和应用进行详细描述。
1. 甲基化特异性PCR（MSP）甲基化特异性PCR（Methylation Specific PCR，MSP）是一种经典的DNA甲基化检测方法。
该方法通过特殊的PCR反应体系和引物设计，可以区分甲基化和非甲基化的DNA序列。
具体步骤如下：•DNA提取：从待测样品中提取DNA。
•甲基化处理：对DNA进行化学甲基化处理，使甲基化的嵌合基对应DNA序列得以保留，非甲基化的嵌合基对应DNA序列则被转化为不同的碱基。
•PCR反应：使用特异性引物对甲基化和非甲基化的DNA片段进行扩增。
•电泳分析：将PCR产物进行凝胶电泳分析，根据PCR产物的大小和形态进行甲基化状态的判断。
MSP方法具有操作简便、快速、经济等优点，已广泛应用于DNA甲基化的研究和临床诊断中。
2. 甲基化敏感限制性内切酶PCR（MSRE-PCR）甲基化敏感限制性内切酶PCR（Methylation Sensitive Restriction Enzyme-PCR，MSRE-PCR）是一种基于限制性内切酶的DNA甲基化检测方法。
该方法利用甲基化敏感的限制性内切酶和非甲基化敏感的限制性内切酶对DNA进行切割，然后通过PCR扩增来检测DNA甲基化状态。
步骤如下：•DNA提取：从待测样品中提取DNA。
•限制性内切酶切割：使用甲基化敏感和非甲基化敏感的限制性内切酶对DNA进行切割，甲基化酶切割后产生线性DNA片段，非甲基化酶切割后产生环状DNA片段。
•PCR反应：对内切酶切割后的DNA片段进行PCR扩增。
•电泳分析：将PCR产物进行凝胶电泳分析，根据不同大小的PCR产物来判断DNA的甲基化状态。
dna甲基化检测方法
dna甲基化检测方法
DNA甲基化检测是研究基因组表观遗传调控的重要方法之一，常用于癌症、神经系统疾病、发育障碍等研究。
常见的DNA甲基化检测方法包括：
1. 甲基化特异性限制酶消化（Methylation-Specific Restriction Enzyme Digestion）：通过使用甲基化特异性限制酶，可以选择性地切割未甲基化或甲基化的DNA片段，从而区分甲基化和未甲基化的DNA区域。
2. 亲和富集（Methyl-CpG binding domn-based Pull-down Assay）：通过亲和层析方法，利用DNA结合域能够结合甲基化的CpG位点的蛋白质，将甲基化的DNA片段富集出来，再通过测序或PCR等方法进行分析。
3. 甲基化特异性PCR（Methylation-Specific PCR，MSP）：通过使用甲基化特异性引物，在Bisulfite处理后的DNA上进行PCR，从而区分甲基化和未甲基化的DNA 片段。
4. 甲基化敏感限制酶消化和PCR（Methylation-Sensitive Restriction Enzyme Digestion and PCR）：通过使用甲基化敏感限制酶和甲基化特异性引物，在Bisulfite处理后的DNA上进行PCR，可以区分不同的甲基化状态。
5. 甲基化芯片技术（Methylation Array）：采用芯片技术，可以同时检测大量的DNA甲基化位点，进行全基因组水平的甲基化分析。
以上方法各有优缺点，研究人员可以根据具体实验目的和
需求选择合适的方法进行DNA甲基化检测。
DNA甲基化检测方法
DNA甲基化检测方法DNA甲基化是一种常见的表观遗传修饰方式，通过甲基化在DNA分子上的加合，可以调节基因表达和遗传信息传递。
因此，DNA甲基化检测在遗传学研究、疾病诊断和治疗中具有重要意义。
本文将介绍几种常用的DNA甲基化检测方法，并对其原理、优缺点进行详细讨论。
1.甲基化特异性PCR法（MSP）甲基化特异性PCR法是一种利用特异性甲基化酶、限制性内切酶或碱性处理剂以及增强法进行检测的方法。
该方法的原理是通过甲基化特异性的酶对DNA进行酶切，使得未甲基化的DNA片段与经PCR增强的片段长度不同，从而通过凝胶电泳进行检测和分析。
优点是简单、快速且成本低廉，但缺点是需要设计和合成特异性甲基化酶。
2.基于测序的甲基化特异性分析基于测序的甲基化特异性分析方法主要有甲基化抑制PCR法（MIP）和甲基化敏感限制性内切酶测序法（MSRE-Seq）等。
甲基化抑制PCR法是通过特殊的多聚合酶在特定温度下对未甲基化的DNA完成增长，而甲基化DNA则无法进行扩增，从而区分甲基化和未甲基化的位点。
甲基化敏感限制性内切酶测序法则是首先使用甲基敏感限制性内切酶对DNA进行切割，然后进行测序分析。
这两种方法具有较高的精确性和灵敏性，但测序成本较高。
3. 甲基化特异性酶切测序法（MRE-Seq）甲基化特异性酶切测序法是一种通过甲基化特异性酶切和测序进行检测的方法。
该方法首先使用甲基敏感限制性内切酶将DNA切割成小片段，并在切割位点的两端加入特异性的测序引物，然后进行PCR增强和高通量测序。
通过测序得到的序列和甲基化位点的分布情况可以对DNA甲基化进行精确的定量和定位分析。
甲基化特异性酶切测序法具有高通量、高灵敏度和高分辨率等优点，但仍存在PCR偏差等问题。
4.甲基化微阵列甲基化微阵列是一种通过DNA的甲基化特异性杂交来检测和定量DNA 甲基化水平的方法。
该方法利用DNA片段与微阵列芯片上的探针发生特异性杂交，然后通过荧光信号检测和分析。
DNA甲基化检测方法
DNA甲基化检测方法DNA甲基化检测方法主要包括基于测序的方法和基于非测序的方法。
基于测序的方法包括甲基化指纹测序 (Methylome Sequencing) 和全基因组甲基化分析 (Whole Genome Bisulfite Sequencing, WGBS)。
基于非测序的方法包括限制性片段长度多态性 (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) 和甲基化特异性PCR (Methylation-Specific PCR, MSP)。
下面分别介绍这些方法的原理和应用。
全基因组甲基化分析是一种基于测序的DNA甲基化检测方法。
它通过对全基因组进行测序，得到每个碱基的甲基化状态。
首先，将DNA进行亚硫酸盐处理，将未甲基化的胞嘧啶转化为脱氧尿嘧啶，再进行测序。
然后，通过比对测序结果和参考基因组，可以得到每个位置的甲基化状态。
限制性片段长度多态性是一种基于非测序的DNA甲基化检测方法。
它通过酶切DNA后，观察酶切位点是否发生改变来判断甲基化的差异。
该方法利用了限制酶对于未甲基化的CpG位点酶切敏感，而对于甲基化的CpG位点酶切不敏感的特性。
首先，将DNA进行酶切，然后使用凝胶电泳等方法，观察DNA片段的长度差异。
甲基化特异性PCR是一种基于非测序的DNA甲基化检测方法。
它通过PCR扩增甲基化和未甲基化的DNA片段来检测甲基化的差异。
首先，将DNA进行亚硫酸盐处理，将未甲基化的胞嘧啶转化为脱氧尿嘧啶。
然后，设计特异性引物，选择甲基化和未甲基化的DNA片段进行PCR扩增。
最后，通过凝胶电泳等方法观察PCR产物，确定甲基化的差异。
DNA甲基化检测方法在许多领域广泛应用。
在癌症研究中，可以通过甲基化指纹测序和全基因组甲基化分析来鉴定癌细胞和正常细胞之间的甲基化差异，进一步了解癌症发生发展的机制。
在遗传学研究中，可以通过DNA甲基化检测来鉴定父母遗传给子代的甲基化模式，进一步研究甲基化在遗传变异中的作用。
DNA甲基化检测方法
Base-Specific Cleavage
如图所示切下的每个片段含有一个或两个CpG位点，在质谱图上甲基化片段和 未甲基化片段大小相差16Da或32Da
Primer Extension Methods
如图所示，用ddC和ddT终止延伸后，在质谱图上显示出甲基化组（ddC）和未 甲基化组(ddT)的质谱峰,二者相差16Da。
应用十三：Quantification of
Methylated DNA by HeavyMethyl Duplex PCR
Principle of HeavyMethyl (A) When the DNA is methylated, the blocker oligonucleotides (solid black) do not bind, leaving the primer binding site accessible for the primers (gray arrows) to bind and amplify the target. The amplication is detected with a methylation specific oligonucleotide probe [solid black, labeled with fuorescent dye (F) and quencher (Q) in a 5’-exonuclease assay, used here as an example for a real-time detection method].
Primer are designed to flank Notl(N),Hhal(Hh),and McrBc(M) Restriction sites in the DMR region.
DNA甲基化检测方法回顾和评价
DNA甲基化检测方法回顾和评价DNA甲基化是指DNA分子上一些碱基（通常是胞嘧啶）上的甲基化修饰。
这种修饰可以影响基因的表达，因此对于研究基因功能和疾病发生发展具有重要意义。
为了检测和研究DNA甲基化，科学家们发展了多种方法。
本文将回顾和评价目前常用的DNA甲基化检测方法。
一、甲基化敏感限制性酶切分析这是最早发展的DNA甲基化检测方法之一、该方法利用甲基化敏感的限制性酶与未甲基化的DNA都可以切割，而甲基化的DNA则无法被切割。
通过检测DNA片段的大小来判断DNA是否被甲基化。
这种方法简单易行，但是只能检测甲基化位点上的特定酶切位点，无法全基因组或全基因的检测。
COBRA方法是一种常用的半定量检测DNA甲基化的方法。
该方法首先将DNA经过亚硫酸钠处理，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。
然后利用甲基化敏感的限制性酶切割DNA，再通过扩增特定区域的PCR反应来评估DNA甲基化水平。
最后，通过分析PCR产物的限制性酶切片段的大小和强度来评估DNA甲基化水平。
COBRA方法能够对特定区域进行定量分析，但是无法进行全基因组的检测。
三、甲基化特异性PCR（Methylation-Specific PCR, MSP）MSP方法是一种常用的DNA甲基化检测方法。
该方法通过设计特异性引物，选择性地扩增甲基化和未甲基化的DNA片段。
首先，对DNA进行亚硫酸盐处理，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，然后利用甲基化特异的引物扩增甲基化DNA，以及未甲基化特异的引物扩增未甲基化DNA，最后经过凝胶电泳来判断甲基化状态。
该方法操作简便，只需少量基因组DNA即可进行检测，但是只能分析选定的DNA区域。
四、全基因组甲基化谱（Whole Genome Bisulfite Sequencing, WGBS）WGBS是一种高通量的DNA甲基化检测方法，能够全面揭示基因组上的甲基化信息。
该方法首先将DNA经过亚硫酸钠处理，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，然后通过高通量测序技术对甲基化和未甲基化的DNA进行测序，最后通过比对测序数据来鉴定甲基化的位点和水平。
甲基化检测方式
甲基化检测方式概述：甲基化是指DNA分子上甲基基团的添加，它是一种重要的表观遗传修饰方式。
甲基化修饰可以影响DNA的结构和功能，对基因的表达起到关键的调控作用。
因此，研究甲基化的检测方式对于理解基因表达调控机制、生物学过程以及疾病的发生发展具有重要意义。
本文将介绍几种常用的甲基化检测方式。
1. 甲基化特异性限制酶消化：甲基化特异性限制酶是一类能够识别DNA甲基化位点并在非甲基化位点切割的酶。
通过对DNA样品进行甲基化特异性限制酶消化，可以将甲基化和非甲基化位点区分开来。
消化后的DNA片段可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离和检测。
这种方法简单、快速，适用于大规模样品的筛查。
2. 甲基化特异性PCR：甲基化特异性PCR是一种通过PCR技术检测DNA甲基化状态的方法。
它利用特异性引物，只能在非甲基化位点附近的区域扩增目标序列，而在甲基化位点附近的区域无法扩增。
通过PCR产物的降解、凝胶电泳或者测序等方法，可以判断目标序列是否被甲基化。
这种方法对样品的纯度要求较高，但是可以检测单个CpG位点的甲基化状态。
3. 甲基化敏感的高通量测序：甲基化敏感的高通量测序是一种通过测序技术检测DNA甲基化状态的方法。
它利用特殊的酶或化学处理方法，可以将甲基化和非甲基化的DNA片段区分开来，然后通过高通量测序技术对甲基化位点进行测序。
这种方法可以同时检测全基因组的甲基化状态，具有高通量、高分辨率的特点，对于大规模甲基化调控的研究非常有价值。
4. 甲基化芯片：甲基化芯片是一种基于DNA杂交原理检测DNA甲基化状态的方法。
它利用DNA芯片上固定的甲基化和非甲基化的DNA探针与待测样品中的DNA进行杂交反应，然后通过检测芯片上的荧光信号来判断甲基化位点的状态。
甲基化芯片具有高通量、高灵敏度的特点，可以同时检测大量的甲基化位点。
总结：甲基化检测是研究DNA表观遗传修饰的重要手段。
通过甲基化特异性限制酶消化、甲基化特异性PCR、甲基化敏感的高通量测序和甲基化芯片等方式，可以检测DNA的甲基化状态。
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启动子区甲基化芯片技术
Base-Specific Cleavage
Primer Extension Methods
质谱法检测的优势：
灵敏度准确性高。 操作较简便。
局限性：
DNA样本要求纯度较高，提取过程中的小 离子，未消化完全的蛋白，RNA对结果有干 扰作用。 需用质谱仪。
缺点：检测序列长度不应超过100bp；
只能进行半定量检测
应用十二：焦磷酸测序法
焦磷酸测序法（Pyrosequencing）
焦磷酸测序法（Pyrosequencing）
焦磷酸测优势：
灵敏度高，可测到邻近CpG区域的单个甲基化水平，甚 至包括测序的引物区域。 除常规的检测位点变化情况外，还可准确计算频率变化。 对于检测位点要求低，可检测未知序列信息，覆盖到人 类基因组的所有CpG位点； 对于样品要求低，适用于新鲜、冷冻和FFPE样本。
课题流程： 1.筛选Differentially methylated region；
2.对筛选出的DMR进行测序，验证是否具有甲基化差异性，同时筛选出随龄 变化相关性强的CpG位点； 3.检测每个样本CpG位点的甲基化率，做回归分析。
做回归分析需要的样本量很大，每个样本需要检测多个CpG位点。基于克隆的 Sanger测序需要多个克隆子，操作繁琐，重复性差，成本会很高；焦磷酸测序 需要对多个片段进行测序，样本量太大，成本会不小。对单个位点甲基化进行定 量分析的方法有很多，个人觉得质谱法或者Ms-SNuPE可以考虑，RD-qAMP 可以避免重亚硫酸盐转化，也可以考虑.其它的几个我感觉不太适合，譬如MSPCR只能半定量，MethyLight存在PCR bias，BioCOBRA要求甲基化位点酶 切位点内，MS-HRM和芯片检测的是片段甲基化状态，CHIP-sequence要求 illumina平台。
采用甲基化敏感性限制性内切酶技 术结合PCR的方法（MSRE-PCR） 筛选在肝癌与癌旁组织中有甲基化 差异的基因。
空
21B 21BE 21A 21AE 17B 17BE 17A 17AE M
500bp 400bp 250bp 150bp 100bp
图1-3：DNM基因琼脂糖凝胶电泳图
注：M：Marker；E：加酶体系；A：癌组织；B：癌旁组织；空：水空白
样本分型 （Genotyper或GeneMapper ID）
1 2
3
56
4
这是一个多重SNaPshot的检测结果，总共检测了6个CpG位点，阴影峰 代表甲基化的C，空白峰代表未甲基化C。位点1、2和4显示大约50%的甲 基化率，而位点3、5和6显示0的甲基化率。
HRM技术： 用于筛选大量样本，获得感兴趣的CpG位点 鉴 定感兴趣的CpG 岛 。
研究结果
SREBP-1基因启动子区CpG岛甲基化状态
MSP扩增产物凝胶电泳图
注：M表示 甲基化，U表示未甲基化 B1-B6为高脂血症组六例标本，D1-D5 为正常对照组五例标本； H2O为阴性对照；m为50bpMarker。
优点： ①操作简便；②敏感性高；③Nested-MSP提高 灵敏度，便于分析微量检材 缺点： ①引物设计要求高； ②只能作定性研究； ③存在重亚硫酸盐处理不完全导致的假阳性； ④只能了解部分位点的甲基化状态。
Primer are designed to flank Notl(N),Hhal(Hh),and McrBc(M) Restriction sites in the DMR region.
Liver and testis genomic DNA templates are PCR amplicated following digestion with no enzyme(sham),Notl,Hhal(Hh) or McrBc.Amplication using a second primer pair that has been designed to a sequence devoid Of restriction sites demonstrates that the templates are of equal concentration.
HRM技术原理
HRM技术原理
HRM特点
高灵敏性：可检测低达0.1%甲基化程度。 高通量：1次可同时检测不超过384样本，适用于 大样本多位点甲基化扫描。 高重复性：重复性100%。 使用范围广：不受碱基位点局限。 操作简便：只需设计特异引物，无须序列特异性探 针，无需测序。 标本范围广：可用于新鲜或酒精固定、石蜡包埋的手 术标本，也可用于微量的穿刺或活检标本、血液标本、 粪便标本等非手术标本的检测。
应用十三：Quantification of
Methylated DNA by HeavyMethyl Duplex PCR
Principle of HeavyMethyl (A) When the DNA is methylated, the blocker oligonucleotides (solid black) do not bind, leaving the primer binding site accessible for the primers (gray arrows) to bind and amplify the target. The amplication is detected with a methylation specific oligonucleotide probe [solid black, labeled with fuorescent dye (F) and quencher (Q) in a 5’-exonuclease assay, used here as an example for a real-time detection method]. (B) When the DNA is unmethylated, the blocker oligonucleotides bind, blocking
the access of the primers to their binding sites. No PCR product is generated.
不同甲基化检测方法的检测通量
sample throughput versus genome coverage. A plot of sample throughput against genome coverage for various DNA methylation techniques. Throughput is determined by the number of samples that can be analysed per experiment, based on large eukaryotic genomes. Coverage is determined by the number of CpGs in the genome that can be analysed per experiment.
易老师你认为呢？
对MSP的产物用Taqman探针进行qPCR，从而 实现甲基化的定量分析。
优点：增加了重亚硫酸盐转化和DNA复性的质控对照
避免了电泳、酶切等操作 缺点：PCR bias
应用四：结合重亚硫酸盐的限制性 内切酶法(combined bisulfite restriction analysis，COBRA)
MSRE MDRE
The difference in the Ct value of an enzyme-digested template relative to the sham-digested template determinates the levels of DNA methylation in each tissue.
应用条件：
酶识别位点内含有一个及以上CpG位点
优点： ①方法相对简单； ②可进行甲基化水平的定量研究； ③需要样本量少。
缺点：
①由于CG仅限于内切酶识别序列中，因此非识别序 列的CG将被忽略； ②只有检测与转录相关的关键性位点的甲基化状态 时，该检测方法的结果才有意义； ④存在酶消化不完全引起的假阳性的问题；
应用三： 甲基化特异性PCR (methylafionspecific PCR，MS-PCR)
MSP法检测抑癌基因RASSF1A启动子区的甲基化 U M U M U M ladder
250 200 150 100
图
MSP检测组织切片DNA甲基化状态电泳图片
甲基化特异性PCR（MSP）结果，U为非甲基化，M为甲基化。
步骤
扩增 基因组DNA样本 重亚硫酸盐 转化 PCR ExoSAP消化
引物延伸
加入SNP引物和 SNaPshot Mix
SNP引物延伸 (加入ddT或ddC)
SAP处理
分析
310/3100样本准备 加入GS120LIZ内标
ABI310/3100电泳 选用E5和POP4胶
数据分析 （GeneScan）
应用二： 重亚硫酸盐转化后PCR克隆测序 (Bisulfite-sequence PCR，BSP)
BSP克隆测序结果
43B 43BE
43A 43AE M
(369bp)
43A
43B
43B
注： A：癌组织；B：癌旁组织；○：未甲基化；●：甲基化
BSP克隆测序甲基化率三维图形
优点:能准确的检测出每个DNA分子单倍体型的 甲基化状态，同时能分析不同CpG位点之间 的甲基化状态的联系。 缺点：需要对PCR产物克隆，操作繁琐，费时费 力，克隆子的数目影响结果的准确性。 测序重复性差。
结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法
甲基化特异性的限制性内切酶(MDRE)： 可以识别甲基化的胞嘧啶 甲基化敏感性的限制性内切酶(MSRE)： 可以识别甲基化的胞嘧啶