甲基化检测原理及步骤 DNA实验技术方法汇总
dna甲基化测序原理
dna甲基化测序原理DNA甲基化测序原理DNA甲基化测序是一种用于检测DNA分子上甲基化修饰形式的方法。
甲基化是一种常见的DNA化学修饰形式，它可以影响基因的表达和细胞分化过程。
通过测序和分析DNA中的甲基化位点，科学家能够深入研究这种修饰对基因组功能的影响。
甲基化测序的原理基于DNA甲基化位点与未甲基化位点之间的区别。
在DNA分子中，甲基化通常发生在CpG位点（即DNA的Cytosine和Guanine碱基之间的连接点）。
未甲基化的CpG位点在测序中会被处理成TpG位点，而甲基化的CpG位点则保持不变。
甲基化测序通常通过两种方法进行：1. 亚硫酸转换法（Bisulfite Conversion）：该方法通过使用亚硫酸盐将未甲基化的CpG位点转换为尿嘧啶（T），而甲基化的CpG位点则保持不变。
经过亚硫酸转换后的DNA样本可以通过测序技术直接检测出甲基化位点和未甲基化位点的差异。
2. 甲基化特异性切割（Methylation-specific cleavage）：该方法使用甲基化特异性的限制性内切酶来识别甲基化的CpG位点，并在CpG位点附近切割DNA。
未甲基化的CpG位点由于没有甲基化修饰而不被切割。
通过测序这些切割的DNA片段，可以确定DNA分子上的甲基化位点的位置。
甲基化测序技术的发展为研究DNA甲基化在基因组中的分布和功能提供了重要的工具。
科学家可以利用这些技术研究不同细胞类型、病理状态以及环境因素对甲基化模式的影响，以及通过甲基化修饰调控基因表达的机制。
这些研究对于揭示基因组调控和疾病发生机制具有重要意义。
甲基化原理及方法
甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰测序法）基本原理在于：样本经亚硫氢酸盐处理后,甲基化的胞嘧啶（C）保持不变,但非甲基化的胞嘧啶被转化成脲嘧啶,因此在利用该处理产物作为模板的PCR产物中,甲基化的胞嘧啶还是胞嘧啶,但非甲基化胞嘧啶变成了脲嘧啶（胸腺嘧啶）,此时检测到的胞嘧啶（C）即是样品中本身的甲基化位点.第一部分基因组DNA的提取。
DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。
DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。
此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。
因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。
使用两者的细节：1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。
否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。
两者均于-20度保存。
验证提取DNA的纯度的方法有二：1：紫外分光光度计计算OD比值；2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。
我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。
第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。
1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；3：42℃水浴30min；水浴期间配制：4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）5：3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。
这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。
PH一定要准确为5.0。
加520ul至上述水浴后溶液中。
甲基化测序原理
甲基化测序原理甲基化测序是一种广泛应用于DNA研究中的技术，用于检测DNA分子上的甲基化修饰。
甲基化是一种常见的DNA修饰形式，可以对基因表达和染色质结构产生重要影响。
通过了解DNA序列的甲基化状态，人们能够更深入地研究生物学过程以及疾病的发生机制。
甲基化测序的原理是基于DNA序列中C（胞嘧啶）碱基的甲基化状态。
在正常情况下，DNA中的C碱基会被一个甲基分子修饰，形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）。
然而，在一些情况下，这种甲基化修饰可能会发生异常，导致基因沉默或功能改变。
因此，分析DNA分子中的甲基化状态对于理解基因组功能和疾病机制非常重要。
甲基化测序的方法主要分为两种：全基因组甲基化测序和特定位点甲基化测序。
全基因组甲基化测序是指对整个基因组进行甲基化的分析，可以提供全面的甲基化图谱。
特定位点甲基化测序则是选取特定的DNA区域进行检测，可以更加深入地研究某些关键基因或区域的甲基化状态。
甲基化测序的过程首先需要将DNA样本进行处理，包括DNA提取和断裂。
接着，通过特定的化学反应将5-mC转化为甲基化敏感的测序标记物。
然后，使用高通量测序技术对DNA样本进行测序，得到包含甲基化信息的DNA序列。
最后，通过对测序结果进行分析和比对，可以确定DNA序列中每个碱基的甲基化状态。
甲基化测序技术的发展为研究者提供了一个非常有力的工具，可以帮助他们深入了解DNA的甲基化修饰和相关生物学过程。
这种技术在癌症研究、遗传学研究以及表观遗传学研究中具有重要的应用价值。
随着技术的不断进步，甲基化测序将进一步发展，为科学家解开生命奥秘提供更多帮助。
DNA甲基化检测技术全攻略
DNA甲基化检测技术全攻略近年来涌现出不少DNA甲基化的检测技术，少说也有十几种。
大致可以分为两类：特异位点的甲基化检测和全基因组的甲基化分析，后者也称为甲基化图谱分析(methylation profiling)。
下面大家介绍一些常用的方法。
特异位点的甲基化检测甲基化特异性PCR(MS-PCR)这种方法经济实用，无需特殊仪器，因此是目前应用最为广泛的方法。
在亚硫酸氢盐处理后，即可开展MS-PCR。
在传统的MSP方法中，通常设计两对引物，一对MSP引物扩增经亚硫酸氢盐处理后的DNA模板，而另一对扩增未甲基化片段。
若第一对引物能扩增出片段，则说明该检测位点存在甲基化，若第二对引物能扩增出片段，则说明该检测位点不存在甲基化。
这种方法灵敏度高，可用于石蜡包埋样本，且不受内切酶的限制。
不过也存在一定的缺陷，你要预先知道待测片段的DNA序列，并设计出好的引物，这至关重要。
另外，若存在亚硫酸氢盐处理不完全的情况，那可能导致假阳性。
亚硫酸氢盐处理+测序这种方法一度被认为是DNA甲基化分析的金标准。
它的过程如下：经过亚硫酸氢盐处理后，用PCR扩增目的片段，并对PCR产物进行测序，将序列与未经处理的序列进行比较，判断CpG位点是否发生甲基化。
这种方法可靠，且精确度高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序，过程较为繁琐、昂贵。
联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(COBRA)DNA样本经亚硫酸氢盐处理后，利用PCR扩增。
扩增产物纯化后用限制性内切酶(BstUI)消化。
若其识别序列中的C发生完全甲基化(5mCG5mCG)，则PCR扩增后保留为CGCG，BstU I能够识别并进行切割;若待测序列中，C未发生甲基化，则PCR后转变为TGTG，BstUI识别位点丢失，不能进行切割。
这样酶切产物再经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可得出原样本中甲基化的比例。
这种方法相对简单，可快速定量几个已知CpG位点的甲基化，且需要的样本量少。
DNA甲基化检测方法
DNA甲基化检测方法DNA甲基化是一种常见的表观遗传修饰方式，通过甲基化在DNA分子上的加合，可以调节基因表达和遗传信息传递。
因此，DNA甲基化检测在遗传学研究、疾病诊断和治疗中具有重要意义。
本文将介绍几种常用的DNA甲基化检测方法，并对其原理、优缺点进行详细讨论。
1.甲基化特异性PCR法（MSP）甲基化特异性PCR法是一种利用特异性甲基化酶、限制性内切酶或碱性处理剂以及增强法进行检测的方法。
该方法的原理是通过甲基化特异性的酶对DNA进行酶切，使得未甲基化的DNA片段与经PCR增强的片段长度不同，从而通过凝胶电泳进行检测和分析。
优点是简单、快速且成本低廉，但缺点是需要设计和合成特异性甲基化酶。
2.基于测序的甲基化特异性分析基于测序的甲基化特异性分析方法主要有甲基化抑制PCR法（MIP）和甲基化敏感限制性内切酶测序法（MSRE-Seq）等。
甲基化抑制PCR法是通过特殊的多聚合酶在特定温度下对未甲基化的DNA完成增长，而甲基化DNA则无法进行扩增，从而区分甲基化和未甲基化的位点。
甲基化敏感限制性内切酶测序法则是首先使用甲基敏感限制性内切酶对DNA进行切割，然后进行测序分析。
这两种方法具有较高的精确性和灵敏性，但测序成本较高。
3. 甲基化特异性酶切测序法（MRE-Seq）甲基化特异性酶切测序法是一种通过甲基化特异性酶切和测序进行检测的方法。
该方法首先使用甲基敏感限制性内切酶将DNA切割成小片段，并在切割位点的两端加入特异性的测序引物，然后进行PCR增强和高通量测序。
通过测序得到的序列和甲基化位点的分布情况可以对DNA甲基化进行精确的定量和定位分析。
甲基化特异性酶切测序法具有高通量、高灵敏度和高分辨率等优点，但仍存在PCR偏差等问题。
4.甲基化微阵列甲基化微阵列是一种通过DNA的甲基化特异性杂交来检测和定量DNA 甲基化水平的方法。
该方法利用DNA片段与微阵列芯片上的探针发生特异性杂交，然后通过荧光信号检测和分析。
DNA甲基化检测技术
MS-HRM检测方法及步骤
1. 引物设计：
MS-HRM检测方法及步骤
2. DNA样本的准备：
可使用新鲜组织或石蜡组织样本，一般不使用血液样本；
3. 仪器选择（一般可进行HRM分析的仪器均可）：
如LightCycler480 (Roche), RotorGene6000 (Corbett Research), Applied Biosystems 7500 FAST real-time PCR system(Applied Biosystems), LightScanner System and the HR-1 instrument(Idaho Technologies).
DNA甲基化的生物学意义
1、转录抑制
基因启动 子区的甲基化可 影响转录激活因 子和其识别序列 的结合.
DNA甲基化的生物学意义
2、影响基因表达
直接抑制基因表达 或甲基化的 CpG双核苷 酸序列可被甲基结合蛋 白家族 识别,而后者可通 过吸引补充组蛋白去乙 酞化酶 和组蛋白甲基化 转移酶 等组蛋 白修饰蛋 白质来改变染色质的活 性 ,以间接方式影响基因 表达.
MS-HRM检测结果分析
Figure 4. The MS-HRM assay for BNIP3 methylation. Results of the BNIP3-MS-HRM assay for five clinical samples compared to the dilution standards. Samples 1–5 show different methylation levels. The samples have been distributed over three panels to help distinguish the individual samples.
DNA甲基化实验操作原理及方法
DNA 甲基化重亚硫酸氢盐修饰法（DNA METHYLATION BISULFITE MODIFICATION）实验操作原理及方法一、实验目的：通过本实验，可以检测特定DNA序列的甲基化状态。
二、实验原理：DNA 甲基化是指由S-腺苷甲硫氨酸（SAM）提供甲基基团，在DNA 甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）的作用下，将CpG 二核苷酸的胞嘧啶（C）甲基化为5-甲基化胞嘧啶（5-m C）的一种化学反应。
DNA 甲基化是调节基因转录表达的一种重要的表观遗传的修饰方式。
DNA 甲基化主要在转录水平抑制基因的表达。
DNA 甲基化引起基因转录抑制的机制可能主要有以下3 种：（1）DNA甲基化直接干扰特异性转录因子与各基因启动子中识别位置的结合。
（2）序列特异性的甲基化DNA 结合蛋白与启动子区甲基化CpG 岛结合，募集一些蛋白，形成转录抑制复合物，阻止转录因子与启动子区靶序列的结合，从而影响基因的转录。
（3）DNA 甲基化通过改变染色质结构，抑制基因表达。
重亚硫酸氢盐修饰法检测DNA甲基化的基本原理是基于DNA变性后用重亚硫酸氢盐处理，可将未甲基化胞嘧啶修饰成尿嘧啶。
此反应的步骤是：1、在C-6位点磺化胞嘧啶残基；2、在C-4处水解去氨基来产生尿嘧啶磺酸盐；3、在碱性条件下去硫酸化。
在这个过程中，5-甲基胞嘧啶由于甲基化基团干扰了重亚硫酸氢盐进入到C-6位点而保持着未反应的状态。
在重亚硫酸氢盐处理后，使用针对每个修饰后DNA链的引物进行PCR反应。
在这个PCR产物中，每5-甲基胞嘧啶显示为胞嘧啶，而由未甲基化胞嘧啶转变成的尿嘧啶则在扩增过程中被胸腺嘧啶所取代。
BSP(bisulfate sequencing PCR) ：重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，进行PCR扩增。
最后，对PCR产物进行测序，并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。
DNA甲基化实验
3. DNA 甲基化的检测
A．基因组甲基化水平 (Methylation Content)的分析: 高效液相色谱 (High-performance Liquid Chromatography, HPLC) 高效毛细管电泳法 (High-performance Capillary Electrophoresis, HPCE)
2. DNA 甲基化的生物学意义
1. DNA甲基化与遗传物质的稳定性 2. DNA甲基化与基因表达调控 3. DNA甲基化与表观遗传学 4. DNA甲基化与胚胎发育 5. DNA甲基化与肿瘤
2. DNA 甲基化的生物学意义
DNA甲基化与遗传物质的稳定性
a) 研究证明细菌DNA复制起始与DNA甲基化以及DNA与细菌质膜的相互作用有关。 DNA便甲基化作为一种标签决定了复制起始点与细胞膜的结合，控制了复制起始， 使得DNA复制与细胞分裂保持一致。
适用于基因组整体的甲基化水平研究，无法定位甲基化位点。
B.甲 基 化 敏 感 性 限 制 性 内 切 酶 - P C R /Southern法 ( methylation-sensitive restriction Endonuclease -PCR/Southern, MSRE-PCR/Southern)，常使用的甲基化敏感的限制性内切 酶有HpaⅡ-MspⅠ(CCGG)和SmaⅠ-Xmal(CCCGGG)等。
哺乳动物基因组中约有 5%- 10% 是 CpG位点，其中约有 70%为 mCpG。
CpG 位点不是均匀分布，而是呈 现局部聚集倾向，形成一些 GC 含 量较高、CpG 双核苷酸相对聚集的 区域，即 CpG 岛， CpG 岛通常呈 现低甲基化状态。
2. DNA 甲基化的生物学意义
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DNA亚硫酸氢盐修饰和纯化操作步骤修饰设计：使用CpGenome TM kit使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤如下。
中等温度碱性pH下使DNA变性成为单链形式暴露出碱基。
试剂一，一种包含亚硫酸氢根的钠盐，可使未甲基化的胞嘧啶磺化和水解脱氨，产生一种尿嘧啶磺酸盐中间产物。
然后DNA在另一种盐﹙试剂二﹚存在的条件下与一种微粒载体﹙试剂三﹚结合，并通过重复离心和在70%的乙醇中重悬浮脱盐。
向尿嘧啶的转化是通过在90%的乙醇中反复碱性脱磺酸基作用和脱盐完成的。
DNA最终在TE缓冲液中通过加热从载体上洗脱下来。
第一步：试剂准备
（1）3 M NaOH原料（用前现配）
把1g干NaOH片剂溶解在8.3mL水中。
使用此类腐蚀性碱，注意小心谨慎和实验操作。
（2）20 mM NaOH/90% EtOH（用前现配）
配制1mL该溶液需：900μl 100%的乙醇，93.4μl水，6.6μl 3M的氢氧化钠。
（3）溶解试剂Ⅰ（用前现配）
打开前将试剂瓶加温至室温。
对每份待修饰的样本，称取0.227g DNA修饰试剂Ⅰ加入0.571mL水中。
充分涡旋振荡混合。
使用该试剂时要小心谨慎，因为它对呼吸系统和皮肤有刺激性。
用大约20μl 3M NaOH调整pH至5.0，用pH试纸检测pH值。
试剂Ⅰ避光保存以免分解。
为了最佳效果，试剂应在配置后立即使用。
（4）溶解试剂Ⅱ
打开前将试剂瓶加温至室温。
将1μl β-巯基乙醇加入20mL去离子水中。
每份待修饰的DNA样本需将750μl该溶液加入到1.35g DNA修饰Ⅱ。
充分混合确保完全溶解。
过量的试剂可用箔纸包裹的容器、2℃-8℃、避光保存长达6周。
第二步：DNA修饰程序
1、在带有螺旋形瓶盖的1.5-2.0mL的微量离心管中：将7.0μl 3M NaOH加入到含有1.0 μg DNA的100μl水中（10ng/μl），混匀。
注意：如果样本含有的DNA量不到1.0μg，就向样本DNA中加入2 μl DNA修饰试剂Ⅳ并加水至总体积100μl。
再加入7.0μl 3M NaOH并混匀。
2、50℃ DNA孵育10分钟（加热块或水浴）
3、加入550 μl新鲜配制的DNA修饰试剂Ⅰ并涡旋振荡。
4、加热块或水浴50℃避光孵育4-16小时。
第三步：初步脱盐
1、强力涡旋振荡悬浮DNA修饰Ⅲ。
用10x的1mL塑料移液管枪头来回吸排悬液以分散仍存在的凝块。
2、向含DNA溶液的管中加入5μl充分悬浮的DNA修饰试剂Ⅲ。
3、加入750μl DNA修饰试剂Ⅱ并充分混匀。
4、室温孵育5-10分钟。
5、5000 X g离心10秒使DNA试剂Ⅲ成颗粒状。
（应出现一种白色的小颗粒。
）弃去上清。
6、加入1.0mL 70%的乙醇，涡旋振荡，5000 X g离心10秒，弃去上清。
该步骤重复进行，共3次。
7、将第三次上清弃去后，离心管高速离心2分钟，用塑料移液管枪头移去剩余上清。
第四步：完成DNA修饰（脱磺酸基作用），再次脱盐，并洗脱。
1、适量样本加入50μl 20 mM NaOH/90% EtOH溶液。
2、充分涡旋振荡悬浮颗粒，再室温孵育5分钟。
3、5000 X g离心以移除管顶所有成分。
加入1.0mL 90%的乙醇并涡旋振荡洗脱颗粒。
再旋转，除去上清。
再次重复该步骤。
4、第二次洗脱除去上清后，高速离心样本3分钟。
5、用塑料移液管头除去所有剩余上清。
试管室温晾干10-20分钟（必须除去酒精气味）。
6、加入TE缓冲液。
注意：加入TE的量取决于起始DNA的量和目的用途所需的加入浓度。
例如，如果加入25μl TE，基于完全恢复1μg DNA的最终浓度应为40ng/μl。
快速强力涡旋振荡直到颗粒完全悬浮。
用手轻打或轻敲内容物至管顶（但是不要离心）。
7、50-60℃下样本孵育15分钟以洗脱DNA。
8、高速离心2-3分钟并用塑料移液管头转移样本（上清）到新管。
9、进行MSP或测序，或-15～-25℃可保存达2个月，-80℃可保存6个月。
避免重复融化和解冻；可分量储存。
不要将DNA存储在自动除霜冰箱。