甲基化原理及方法
DNA甲基化——表观遗传学的重要组成部分
DNA甲基化——表观遗传学的重要组成部分DNA甲基化是一种表观遗传学调控机制，通常指DNA分子上的甲基化修饰。
这种化学变化涉及DNA链上的甲基基团与Cytosine碱基的配对，对基因表达和细胞分化等生命过程具有重要作用。
DNA甲基化不仅在正常生长发育中发挥至关重要的作用，而且也涉及很多人类疾病的发展。
本文将介绍DNA甲基化的基本原理、分布方式、调控机制及其在疾病中的作用。
一、DNA甲基化的基本原理DNA是由4种不同的核苷酸构成的，其中包括Adenine、Thymine、Cytosine和Guanine。
DNA的甲基化通常发生在Cytosine碱基的C5位，即通过甲基基团与细胞内的S-Adenosyl Methionine（SAM）反应，形成5-甲基Cytosine（5mC）。
DNA甲基化是基因组合成和生物遗传变异的关键机制之一。
它可以调控基因的表达和细胞分化，与疾病的发展密切相关。
虽然越来越多的研究表明，DNA甲基化是一种可逆的表观遗传修饰，但它仍然是一种稳定的标记，可以被逐代遗传，影响基因表达和细胞分化。
二、DNA甲基化的分布方式DNA甲基化在不同种类和类型的细胞中存在和分布不同。
在人体内，DNA甲基化主要发生在GC富集区域，如基因启动子、繁殖起始点、转录因子结合区等。
这些区域往往影响到基因表达的调控，因此被视为关键的甲基化信号的地点。
另一方面，DNA甲基化还出现在基因体内部的非编码区域，如intron、intergenic regions、satellite DNA和telomeres。
虽然对它们的确切功能还有争议，但这些甲基化信号可能参与调控DNA复制、染色体结构和修复。
三、DNA甲基化的调控机制DNA甲基化是由DNA甲基转移酶（DNMTs）负责催化核苷酸中的甲基基团的加成。
DNMTs可以对一些具有特定序列和结构的DNA区域进行偏好性的甲基化修饰。
这些区域的一个重要特征是在基因表达和细胞分化中发挥着重要的作用。
甲基化原理及步骤
二、DNA亚硫酸氢盐修饰和纯化操作步骤修饰设计：使用CpGenome TM kit使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤如下。
中等温度碱性pH下使DNA变性成为单链形式暴露出碱基。
试剂一，一种包含亚硫酸氢根的钠盐，可使未甲基化的胞嘧啶磺化和水解脱氨，产生一种尿嘧啶磺酸盐中间产物。
然后DNA在另一种盐﹙试剂二﹚存在的条件下与一种微粒载体﹙试剂三﹚结合，并通过重复离心和在70%的乙醇中重悬浮脱盐。
向尿嘧啶的转化是通过在90%的乙醇中反复碱性脱磺酸基作用和脱盐完成的。
DNA最终在TE缓冲液中通过加热从载体上洗脱下来。
第一步：试剂准备（1）3 M NaOH原料（用前现配）把1g干NaOH片剂溶解在8.3mL水中。
使用此类腐蚀性碱，注意小心谨慎和实验操作。
（2）20 mM NaOH/90% EtOH（用前现配）配制1mL该溶液需：900μl 100%的乙醇，93.4μl水，6.6μl 3M的氢氧化钠。
（3）溶解试剂Ⅰ（用前现配）打开前将试剂瓶加温至室温。
对每份待修饰的样本，称取0.227g DNA修饰试剂Ⅰ加入0.571mL水中。
充分涡旋振荡混合。
使用该试剂时要小心谨慎，因为它对呼吸系统和皮肤有刺激性。
用大约20μl 3M NaOH调整pH至5.0，用pH试纸检测pH值。
试剂Ⅰ避光保存以免分解。
为了最佳效果，试剂应在配置后立即使用。
（4）溶解试剂Ⅱ打开前将试剂瓶加温至室温。
将1μl β-巯基乙醇加入20mL去离子水中。
每份待修饰的DNA样本需将750μl该溶液加入到1.35g DNA修饰Ⅱ。
充分混合确保完全溶解。
过量的试剂可用箔纸包裹的容器、2℃-8℃、避光保存长达6周。
第二步：DNA修饰程序1、在带有螺旋形瓶盖的1.5-2.0mL的微量离心管中：将7.0μl 3M NaOH加入到含有1.0 μg DNA的100μl水中（10ng/μl），混匀。
注意：如果样本含有的DNA量不到1.0μg，就向样本DNA中加入2 μl DNA 修饰试剂Ⅳ并加水至总体积100μl。
甲基化转化原理
甲基化转化原理
甲基化转化的原理主要涉及DNA序列中的胞嘧啶（Cytosine）被选择性地添加甲基团，形成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-mC），这一过程通常由DNA甲基转移酶（DNMT）催化完成。
详细来说，DNA甲基化是一种表观遗传修饰，其原理包括以下几个关键点：
1. 化学修饰：DNA甲基化过程中，甲基是由S-腺苷甲硫氨酸（SAM）提供的，这个甲基会被DNA甲基转移酶添加到DNA分子的胞嘧啶上，主要在CG二核苷酸序列中发生。
2. 基因表达调控：当DNA甲基化发生在基因启动子区域时，它通常会抑制该基因的转录活性。
这是因为甲基化会影响转录因子与DNA结合的能力，进而影响基因的表达。
3. 结构维持与印记：DNA甲基化在调控基因表达、维持染色质结构、基因印记以及胚胎发育等生物学过程中扮演着重要角色。
它有助于保持基因组的稳定性和调控特定基因的活性状态。
4. 甲基化检测：为了研究DNA甲基化模式，科学家们开发了多种技术，其中一种常用的是甲基化特异性PCR（MSP）。
这种方法利用重亚硫酸盐处理DNA，将未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则保持不变。
随后通过PCR扩增，可以区分甲基化和非甲基化的DNA序列。
综上所述，DNA甲基化是一种重要的表观遗传机制，它通过在DNA序列中添加甲基团来调节基因的表达，且这种修饰是可逆的。
这一过程对于生物体的发育、基因表达调控以及遗传特征的稳定传递都至关重要。
甲基化pcr原理
甲基化pcr原理甲基化PCR是一种通过特殊处理方法检测DNA中是否存在DNA甲基化修饰的方法。
DNA 甲基化是指在DNA链中某些处存在甲基基团，它一般会改变DNA的结构和功能，并且通过遗传方式传递给后代。
DNA甲基化在许多生物过程中都扮演着重要角色，例如细胞分化、基因表达等，同时它还与人类疾病如肿瘤等有关。
甲基化PCR是遵循PCR（聚合酶链式反应）原理进行的，基于该方法，可以在PCR体系中分析DNA样本的甲基化状态。
该方法基本流程如下：第一步：DNA样品输入将待检测的DNA样品输入反应管中，通常DNA需要通过钠离子的作用，而变性为单链状态，使得甲基化酶在不同的节点上完成甲基化操作。
这样的操作能够确保反应体系到位的甲基化修饰，从而使得后续PCR步骤能够够准确地分析。
第二步：甲基化修饰在这一步，样品DNA和甲基转移酶一起反应，甲基化酶通过将甲基基团连接到DNA的胞嘧啶残基上进行修饰。
此时，DNA样品将发生一些化学变化，其中DNA的骨架结构保持不变。
在此过程中，甲基化酶不能在已经有甲基化修饰的位点上起作用，其功能仅限于未被甲基化的胞嘧啶残基上。
第三步：反转在这一步，样品DNA被反转为双链结构，这使得PCR反应得以进行。
这个步骤通过热循环反应，在高温下熔解DNA，而在低温下恢复其结构，使其形成一些连续的双链DNA。
第四步：PCR反应在此步骤中，DNA的一系列选择性PCR反应被实现，从而能够定向扩增特定的DNA片段或者基因。
通过PCR反应，我们可以检测DNA是否被甲基化，并且这种检测方法不需要特殊的测序化学方法。
该步骤基于聚合酶链式反应（PCR）机制，它可以扩增DNA分子的数量，并且能够在扩增过程中进行其他的DNA标记，常常使用荧光标记物。
该步骤将扩增样品DNA，并对样品进行迅速检测，以来判断样品是否有甲基化修饰。
如果DNA样品在这个过程中扩增，我们就可以得到一个清晰的甲基化PCR条带图，从而准确地分析与检测样品中的甲基化DNA片段。
n-甲基化方法
n-甲基化方法全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：n-甲基化是一种有机合成化学中常见的一种方法，用于在有机分子中引入甲基基团。
n-甲基化方法在有机合成中具有重要意义，可以从简单的甲基供体合成到复杂的天然产物分子的合成。
本文将重点介绍n-甲基化方法的原理、机理、应用以及未来的发展方向。
一、n-甲基化方法的原理n-甲基化方法是通过在有机化合物的分子中引入一个甲基基团，实现分子结构的改变。
常见的甲基化试剂包括碘甲烷、碳酸二甲酯等。
n-甲基化反应的机理通常可以分为两类：亲电取代和自由基取代。
在亲电取代中，甲基基团通过亲电试剂与产物分子中的亲电位点发生反应，形成n-甲基化产物。
而在自由基取代中，通常涉及到自由基的生成和相互反应，最终形成n-甲基化产物。
n-甲基化方法在有机合成中有着广泛的应用。
n-甲基化方法可以用于合成具有特定生物活性的药物分子。
通过在药物分子中引入甲基基团，可以改变分子的生物活性和生物利用度，提高药效。
n-甲基化方法还可以用于合成具有特殊功能的有机分子，如光敏染料、农药等。
n-甲基化方法还可以应用于有机材料的设计和合成，如聚合物材料的修饰等。
随着有机化学领域的不断发展，n-甲基化方法也在不断创新和发展。
未来，我们可以通过结合传统的n-甲基化方法和新型催化剂以及反应条件，实现更高效、更选择性的n-甲基化反应。
随着合成化学领域的发展，我们也可以利用计算化学方法对n-甲基化反应进行精确设计和模拟，加速新型n-甲基化方法的开发和应用。
n-甲基化方法在有机合成中具有重要意义，可以广泛应用于药物合成、有机材料合成等领域。
随着相关技术的不断发展，我们有信心未来可以实现更高效、更可控的n-甲基化合成方法，为有机合成领域的发展做出更大的贡献。
第二篇示例：n-甲基化是一种重要的有机合成方法，广泛应用于药物合成、材料化学和生物化学等领域。
n-甲基化方法的发展，为有机合成领域带来了新的思路和方法，大大拓展了化学合成的可能性。
甲基化检测方法
甲基化检测方法甲基化是一种通过在DNA分子中结合甲基基团来添加化学修饰的过程。
这种化学修饰可以影响基因表达模式，从而对细胞功能和发育过程产生深远影响。
因此，甲基化检测方法在研究生物学、遗传学以及疾病发生机制等方面具有重要意义。
亚硫酸氢盐修饰后测序法是一种被广泛应用于甲基化检测的方法之一，本文将对其原理、步骤和应用进行详细介绍。
亚硫酸氢盐修饰后测序法的原理基于DNA中的甲基化位点与亚硫酸氢盐发生化学反应的特性。
亚硫酸氢盐可以与未甲基化的胞嘧啶碱基形成二硫键结合，而与甲基化的胞嘧啶碱基则不能发生此反应。
利用这个原理，可以将未甲基化的胞嘧啶通过亚硫酸氢盐修饰转化为胞嘧啶-4-亚硫酸酯（CMPS），而甲基化的胞嘧啶则保持不变。
然后，通过测序技术对DNA进行测序，可以得知胞嘧啶碱基是否甲基化。
该方法的具体步骤如下：1.DNA提取：从待测样品中提取DNA，可以使用常规的DNA提取方法来纯化DNA。
2.亚硫酸氢盐修饰：将DNA与亚硫酸氢盐（如亚硫酸氢钠）反应，使未甲基化的胞嘧啶碱基发生亚硫酸化修饰。
通过调整反应条件，可以使甲基化的胞嘧啶碱基保持原样。
3.水解：在亚硫酸氢盐修饰后，将DNA进行水解反应，以将DNA降解成较小的核苷酸片段。
4. 测序：将水解后的DNA片段进行测序，可以使用传统的Sanger测序技术或者高通量测序技术（如二代测序）来完成。
通过测序结果的比对分析，可以确定甲基化位点。
总结起来，亚硫酸氢盐修饰后测序法是一种常用的甲基化检测方法。
通过将DNA中的未甲基化胞嘧啶进行化学修饰，然后通过测序技术分析甲基化位点，可以揭示基因组中的甲基化特征以及其在生物学和疾病中的作用。
在未来，随着测序技术的不断发展和改进，亚硫酸氢盐修饰后测序法还将为我们提供更多深入的甲基化信息。
dna甲基化的原理
dna甲基化的原理DNA甲基化是一种在DNA分子上加上甲基基团的化学修饰过程。
这一化学修饰过程在细胞中发挥着重要的生物学功能，包括基因表达的调控、细胞分化和遗传稳定性等。
DNA甲基化的原理涉及到甲基基团的添加和去除机制。
在DNA甲基化过程中，甲基基团主要被加到DNA双螺旋结构的胞嘧啶（C）碱基的C5位上。
这一过程是通过DNA甲基转移酶来完成的。
甲基转移酶酶能识别DNA分子上的CG序列（称为CpG位点），并在胞嘧啶碱基的C5位上催化甲基基团的转移。
这样，CpG位点上的胞嘧啶碱基就被甲基化了。
DNA甲基化过程的原理如下：1.甲基转移酶的选择性：在细胞中有多种甲基转移酶存在，它们对不同的CpG位点有不同的偏好性。
这种选择性可能受到DNA序列上的特定结构以及附近其他基因组调控元件的影响。
2.甲基化的模式：DNA甲基化不是随机发生的，而是有一定模式的。
例如，在哺乳动物的基因组中，大部分甲基化的CpG位点都集中在基因的启动子区域，这些区域通常与基因的转录调控相关。
3.维护DNA甲基化的稳定性：一旦DNA分子上的某个CpG位点被甲基化，该甲基化状态通常会稳定地维持下去。
这是因为DNA甲基化可以被称为甲基化的遗传记忆体的蛋白质结合并保护。
这些蛋白质可以阻止DNA甲基化酶作用于已经甲基化的CpG位点，从而维持DNA甲基化状态的稳定性。
除了甲基化，DNA上的甲基基团也可以通过DNA去甲基化来去除。
DNA去甲基化是指将DNA分子上的甲基基团去除，从而恢复DNA的原始状态。
DNA的去甲基化机制是多样的，包括被去甲基化酶催化的去甲基化和被氧化剂氧化甲基基团导致的自动去甲基化等。
总的来说，DNA甲基化是一种复杂而精确的生物学修饰过程，它对维持基因组的稳定性和正常的生物学功能至关重要。
了解DNA甲基化的原理，可以帮助我们更好地理解基因调控和生物发育等过程，也有助于深入研究与DNA甲基化相关的疾病，如癌症和染色体异常。
甲基化原理
甲基化原理甲基化是一种重要的生物化学修饰方式，它在生物体内起着重要的调控作用。
甲基化是指DNA分子上的甲基基团与DNA碱基结合的过程，它可以影响基因的表达和细胞的功能。
甲基化是一种重要的表观遗传学调控方式，它可以通过改变DNA的结构和功能来影响细胞的生理过程。
DNA甲基化是由DNA甲基转移酶催化的一种生物化学反应。
在这个过程中，DNA甲基转移酶将甲基基团转移给DNA分子上的特定位置，形成甲基化的DNA。
甲基化的DNA分子具有不同于未甲基化DNA的特性，它可以影响DNA的结构和功能，从而影响基因的表达和细胞的功能。
甲基化的原理是通过改变DNA的结构和功能来影响基因的表达和细胞的功能。
甲基化可以影响DNA的双螺旋结构和DNA与蛋白质的相互作用，从而影响基因的转录和翻译过程。
甲基化还可以影响DNA的复制和修复过程，从而影响细胞的遗传稳定性和功能。
甲基化在生物体内起着重要的调控作用。
它可以通过改变基因的表达来影响细胞的功能和特性。
甲基化可以在细胞分化和发育过程中起着重要的调控作用，它可以使细胞在不同的发育阶段表达不同的基因，从而形成不同的细胞类型和组织结构。
甲基化还可以通过调控基因的表达来影响细胞的代谢和信号传导过程，从而影响细胞的生理功能和适应能力。
总之，甲基化是一种重要的生物化学修饰方式，它可以通过改变DNA的结构和功能来影响基因的表达和细胞的功能。
甲基化在生物体内起着重要的调控作用，它可以影响细胞的分化和发育过程，调控基因的表达，影响细胞的生理功能和适应能力。
对甲基化原理的深入研究可以为人类疾病的治疗和预防提供新的思路和方法，对于生命科学领域具有重要的意义。
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甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰测序法）
基本原理在于：样本经亚硫氢酸盐处理后,甲基化的胞嘧啶（C）保持不变,但非甲基化的胞嘧啶被转化成脲嘧啶,因此在利用该处理产物作为模板的PCR产物中,甲基化的胞嘧啶还是胞嘧啶,但非甲基化胞嘧啶变成了脲嘧啶（胸腺嘧啶）,此时检测到的胞嘧啶（C）即是样品中本身的甲基化位点.
第一部分基因组DNA的提取。
DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。
DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。
此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。
因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。
使用两者的细节：
1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；
2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。
否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。
两者均于-20度保存。
验证提取DNA的纯度的方法有二：
1：紫外分光光度计计算OD比值；
2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。
我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。
第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA
如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。
1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；
2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；
3：42℃水浴30min；
水浴期间配制：
4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）
5：3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。
这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。
PH一定要准确为5.0。
加520ul至上述水浴后溶液中。
6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。
7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。
8：50℃避光水浴16h。
一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，时间上很合适。
这一步细节：
1：基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4ug。
2：所有试剂均须新鲜配制，所以配液的技术要过关，既要快，又要精确。
3：亚硫酸氢钠溶液呈强酸性，一定用碱将PH调制5.0，否则PH不合适会影响后续纯化吸收。
4：水浴最好达16小时，虽可以短至8小时，但后者修饰会有不完全。
第三部分修饰后DNA纯化回收
EP管如无特别说明均为高压蒸汽灭菌的。
1. 将移液器枪头伸入石蜡油层下，先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出，然后吸取混合液至一洁净1.5mlEP管中。
2：以下使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统（Promega，A7280）
1）70℃水浴预热DDW；配制80%异丙醇；
2）加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin，轻柔颠倒混匀，使DNA充分与树脂结合；3）由于该试剂盒中仅配备针筒没有针栓，如果有真空负压吸引器，使用起来很方便；如果没有，需要自备3ml-5ml注射器。
将注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后，将上述混合物用移液器移至针筒内，用2ml以上的EP管放置小柱下接收废液。
加针栓，轻轻加压，将液体挤出，此时可见小柱内有白色的树脂沉积。
4）将注射器与小柱分离后拔出针栓，再将针筒与小柱连接，向针筒内加入2ml 80％的异丙醇，插入针栓，轻轻加压，将异丙醇挤出。
此为洗涤步骤。
5）将注射器与小柱分离，将小柱置于洁净1.5ml洁净EP管上，离心12000rpm，2min，以甩去残余异丙醇成分，使树脂干燥。
此时，修饰后DNA处于与树脂结合状态。
6）将小柱取下置于另一洁净1.5mlEP管上，移液器加50ul预热好的DDW，室温放置5min。
7）离心12000rpm，20s，此为洗脱步骤，此时EP管内液体即为洗脱的修饰后DNA溶液，终体积为50ul。
3：加5.5ul 新鲜配制的3M NaOH，室温放置15min。
4：加33ul 10M乙酸铵，以中和NaOH，使溶液PH于7.0左右。
5：加4ul 10mg/ml糖原，此作为沉淀指示剂，因为其与乙醇混合后可产生沉淀，便于以后离心后辨别回收物的位置，以防在吸取残余乙醇时将回收物吸走。
其实，加入这些糖原究竟能起多大作用，不好说。
不过有国产糖原卖，包装不大，也很便宜，买来一用，算严格遵守文献的步骤吧。
6：加270ul 冰无水乙醇，置于-20度，过夜沉淀。
有人为沉淀最短可至2小时，但我认为时间长些可能会更好。
并且做到此步骤时，一般会到中午，如果样本多的话要到下午，不妨放置过夜，日程可以轻松些，顺便做些其他试验。
如果想当天做完，没有问题，但我认为最好多沉淀些时候，至少6小时吧（这是经验，我做过最少6小时，也是可以的，再短就不敢发表意见了）
7：4度，12000rpm离心，30min，倒去上清液，收集沉淀。
不必吸净。
8：加500ul 70%乙醇，不要将沉淀吹打起来，只要把乙醇加上即可。
轻柔倾斜EP管，旋转一圈，再次离心，4度12000rpm，5min。
离心后倒掉上清，再加同量乙醇，同样再做一遍。
此为洗涤步骤，共2次。
9：倒掉上清，并常温简短离心后，将附壁乙醇离至EP管底，移液器小心将残余液体吸净，室温干燥5min，或沉淀由不透明变为半透明或透明时，加入20ul- 30ulDDW，溶解沉淀。
至此，已完成了修饰后DNA的纯化回收，所得为修饰后DNA溶液，可用于此后的进一步实验。
10：-20℃保存DNA溶液。
此步细节：
1：在使用注射器时，一定要用力均匀且轻，如使用暴力，会将小柱内的薄膜挤破，失去作用。
2：乙酸铵、糖原不需新鲜配制，糖原配好后放在-20度保存，乙酸铵室温即可，因为这样浓度的乙酸铵非常难溶，一旦放在4度，取出用时也会有很多溶质析出。
3：异丙醇、70%乙醇都不需要新鲜配制，但如果用量大，现场配也很方便。
此步关键是在树脂与DNA的结合上，这就再次强调第二部分调亚硫酸钠PH值得重要性。
因为树脂与DNA结合需要有一个适当的PH，如前一步没做好，此步树脂不能与DNA很好结合，将会带来灾难性后果，即DNA随着液体被挤出了，洗脱时实际已没有任何DNA了。
第四部分修饰后DNA用于PCR
这一步也没有悬念。
我主要谈一下这里面的几个比较棘手的问题：
1：引物问题：我感觉自己设计引物有相当的难度，我曾设计过几对引物，并且试验了一下，但以失败告终。
如果时间充裕、作的又是比较新的基因文献不多，自己设计引物没有问题。
如果不是这样，还是参考文献更好些。
首先查阅SCI分值高的文献，然后是著名实验室的文献，如果国内有做的，更好了，可以直接联系咨询。
查到序列后，一定要和Genbank中的序列进行比对，防止有印刷错误造成的个别碱基的差别。
然后再到google上搜一下，看用的人多否，体系条件是否一样。
用的人多、体系条件一样，表明可重复性比较强。
我也是按此行事，算比较顺利。
2：Taq酶问题：有文献用高保真的金牌Taq（Platinum），但我感觉只要体系正确、变性退火等条件合适，一般的热启动酶是可以的。
我开始使用的是Takara的LA Taq，很好用，配有10x含mg2+的LA缓冲液。
有时候用没了，暂时以Takara 的普通Taq酶也可以。
如何选择，可以根据自己的情况。
初作者还是用好一点的酶。
3：PCR的条件：变性一般都选择95度，3min。
其余我感觉还是根据文献，退火可以根据你的引物的退火温度在小范围内尝试。
一般和文献报道差别不大。
只是扩增片断特异性的问题。
建议根据文献。
第五部分PCR产物的凝胶回收
这一步比较简单，可以购买一个凝胶PCR产物回收试剂盒，国产的就很好、价格也合理，比如TIANGEN的产品（用过）。
把切下来的胶按说明书操作即可。
几个细节：
1：PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，要使用新配的电泳液。
凝胶浓度1%-2%均可。
2：凝胶DNA回收时在300nm紫外灯下观察条带位置，切取目的片断所在位置的凝胶，尽量小，保证特异性。
3：紫外照射时间不能过长，否则对DNA有损伤。
4：回收后的DNA如不马上用就储存于-20度，在数月内是很稳定的。
第六部分PCR产物与T载体的连接和转化、测序。