DNA甲基化实验操作原理及方法-Hxg
二代测序检测甲基化的方法
二代测序检测甲基化的方法二代测序是一种高通量测序技术，可以快速、精准地分析DNA序列。
甲基化是一种重要的表观遗传修饰方式，可以对基因表达和细胞功能产生重要影响。
因此，通过二代测序检测甲基化状态成为了研究人员关注的焦点。
本文将介绍基于二代测序的甲基化检测方法。
一、甲基化的检测原理甲基化是指在DNA分子中加入甲基基团，可以影响DNA的结构和功能。
为了检测DNA中的甲基化状态，研究人员通常采用亚硫酸氢盐处理和二代测序相结合的方法。
亚硫酸氢盐可以将未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶不受影响。
通过测序分析DNA中的U和C的比例，就可以确定DNA中的甲基化状态。
二、甲基化检测的实验流程1. DNA提取：从待检测的细胞或组织中提取DNA样本，保证样本的纯度和完整性。
2. 亚硫酸氢盐处理：将DNA样本与亚硫酸氢盐溶液反应，将未甲基化的C转化为U。
3. 文库构建：将经过亚硫酸氢盐处理的DNA样本进行文库构建，包括DNA片段的断裂、连接、文库扩增等步骤。
4. 二代测序：使用二代测序技术对DNA文库进行高通量测序，获得原始测序数据。
5. 数据分析：对原始测序数据进行质控、去除低质量序列和接头序列，然后将剩余的序列与参考基因组进行比对。
6. 甲基化位点鉴定：根据比对结果，统计序列中U和C的比例，确定甲基化位点的甲基化水平。
三、甲基化检测的数据分析甲基化检测的数据分析是整个过程中最关键的一步。
主要包括质控、比对、甲基化位点鉴定和甲基化水平分析等。
1. 质控：对原始测序数据进行质量控制，去除低质量的序列以及接头序列。
这一步骤可以保证后续分析的准确性和可靠性。
2. 比对：将质控后的序列与参考基因组进行比对。
通过比对可以确定序列的位置信息，为后续的甲基化位点鉴定提供基础。
3. 甲基化位点鉴定：根据比对结果，统计序列中U和C的比例。
如果某个位点的U和C比例明显偏差，即可判定该位点存在甲基化。
4. 甲基化水平分析：根据甲基化位点的甲基化水平，可以分析不同位点的甲基化状态。
DNA甲基化检测实验指导
DNA甲基化检测甲基化是蛋白质和核酸的一种重要的修饰，调节基因的表达和关闭，在细胞正常发育、基因表达模式以及基因组稳定性中起着至关重要的作用，与癌症、衰老、老年痴呆等许多疾病密切相关，是表观遗传学的重要研究内容之一。
目前甲基化特异性PCR ,Methylmion Specific PCR，简称MSP，及其改进方法是检测基因甲基化的经典方法．原理是首先用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶都被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不变。
然后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物并进行PCR扩增，通过检测，确定与引物互补的DNA序列的甲基化状态。
MSP法灵敏度较高，应用范围广。
实验前准备在实验开始前，先准备好本次实验所需的各种试剂，如：3mmol NaOH，DNA 纯化试剂盒，以及PCR检测用到的试剂盒等。
所涉及的仪器和耗材有赛默飞公司提供的单道移液器、QSP盒装吸头、Nun 冰盒，Thermo Scientific全波长扫描式多功能读数仪，还有常规的离心机、水浴锅等。
本实验的操作流程为：引物设计，重亚硫酸盐修饰后进行DNA纯化，通过浓度检测方进行甲基化特异性PCR检测。
首先进行引物设计甲基化常发生在启动子区，以DAPK1基因甲基化引物设计为例来。
首先要找到DAPK1的启动子区，登陆Map Viewer，搜索DAPK1。
点击gene,filter，找到对应的基因，获得更多的信息。
点击Map Viewer，可见DAPK1在9号染色体的具体位置。
第一个外显子位于90140 kb处，估计启动子就在其上游2000kb内。
显示为Genbank格式，点击display，获得序列。
将得到的序列拿到Promoter Scan中预测，获得该启动子的相关信息。
预测结果的可靠性，需要通过实验证实。
最后，登陆在线引物设计程序“MethPrimer”，将序列复制到框中，这选项是设计BSP引物，可根据需要设置参数。
我们选择MSP引物，点击Submit获得MSP的5对引物。
甲基化测序原理
甲基化测序原理甲基化测序是一种广泛应用于DNA研究中的技术，用于检测DNA分子上的甲基化修饰。
甲基化是一种常见的DNA修饰形式，可以对基因表达和染色质结构产生重要影响。
通过了解DNA序列的甲基化状态，人们能够更深入地研究生物学过程以及疾病的发生机制。
甲基化测序的原理是基于DNA序列中C（胞嘧啶）碱基的甲基化状态。
在正常情况下，DNA中的C碱基会被一个甲基分子修饰，形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）。
然而，在一些情况下，这种甲基化修饰可能会发生异常，导致基因沉默或功能改变。
因此，分析DNA分子中的甲基化状态对于理解基因组功能和疾病机制非常重要。
甲基化测序的方法主要分为两种：全基因组甲基化测序和特定位点甲基化测序。
全基因组甲基化测序是指对整个基因组进行甲基化的分析，可以提供全面的甲基化图谱。
特定位点甲基化测序则是选取特定的DNA区域进行检测，可以更加深入地研究某些关键基因或区域的甲基化状态。
甲基化测序的过程首先需要将DNA样本进行处理，包括DNA提取和断裂。
接着，通过特定的化学反应将5-mC转化为甲基化敏感的测序标记物。
然后，使用高通量测序技术对DNA样本进行测序，得到包含甲基化信息的DNA序列。
最后，通过对测序结果进行分析和比对，可以确定DNA序列中每个碱基的甲基化状态。
甲基化测序技术的发展为研究者提供了一个非常有力的工具，可以帮助他们深入了解DNA的甲基化修饰和相关生物学过程。
这种技术在癌症研究、遗传学研究以及表观遗传学研究中具有重要的应用价值。
随着技术的不断进步，甲基化测序将进一步发展，为科学家解开生命奥秘提供更多帮助。
DNA甲基化检测
1.DNA甲基化检测的基本原理
目前文献报道的各种DNA 甲基化分析方法均依赖于三种 基本原理，它们分别是： 甲基化敏感性限制性核酸内切酶（MSRE）分析方法 对DNA 中的胞嘧啶进行化学修饰的重亚硫酸盐转化 用甲基CpG 结敏感性限制性核酸内切酶分析方法
2.2甲基化特异性PCR（MSP）
• 基本原理是当用化学试剂重亚硫酸盐处理样品时，所有未 被甲基化的胞嘧啶C将发生脱氨基作用，变为尿嘧啶U； 而甲基化的胞嘧啶则不发生改变。
• 该技术主要对CpG岛甲基化情况进行分析。甲基化和未甲 基化的样品被处理后，其碱基序列将不再相同。据此分别 设计甲基化引物和非甲基化两对引物去扩增，重硫酸盐处 理后的模板，以是否能得到相应的PCR产物确定甲基化情 况。
• 若仅能用甲基化引物得到预期的PCR产物，则该片段高度 甲基化；若仅能用非甲基化引物得到预期的PCR产物，则 该片段未发生甲基化。若两对引物均能得到阳性PCR产物， 则说明该片段部分甲基化。
技术路线
染色体DNA的 制备
染色体DNA的 亚硫酸盐处理
引物的设计
PCR扩增，得 到结果
2.3重亚硫酸盐测序
甲基化特异性多重连接反应依赖性探针扩增（MS-MLPA）
甲基化特异性PCR（MSP）
重亚硫酸盐测序
2.1甲基化特异性多重连接反应依赖性探针扩
增（MS-MLPA）
这是一种基于MSRE 的分析方法，该
方法要求所检测的CpG 位点位于某 一特定的MSRE 识别序列内，如 HhaⅠ所识别的GCGC。针对该位点设 计两条探针，上游探针的3′端位于 该位点5′端1 个碱基处，下游探针 5′端位于该位点3′端1 个碱基处 。上游探针的5′端和下游探针的 3′端含有一套公用PCR 引物序列。 针对不同位点的探针长度可有不同 。将探针与模板DNA 杂交后，加入 连接酶进行连接反应，并加入相应 的MSRE 如HhaⅠ。若该位点甲基化 ，HhaⅠ不能切割， 则模板保持完 整， 随后的PCR 反应可以进行， 若未甲基化，HhaⅠ将连接反应形成 的模板DNA切割，随后的PCR 反应不 能进行。
dna甲基化检测方法
DNA甲基化检测方法引言DNA甲基化是一种常见的基因表达调控方式，可以影响基因的转录和表达，以及细胞分化和发育等生物学过程。
因此，对DNA甲基化状态的准确检测和分析对于理解疾病发生发展机制以及预防和治疗疾病具有重要意义。
本文将介绍几种常用的DNA甲基化检测方法，并对它们的原理和应用进行详细描述。
1. 甲基化特异性PCR（MSP）甲基化特异性PCR（Methylation Specific PCR，MSP）是一种经典的DNA甲基化检测方法。
该方法通过特殊的PCR反应体系和引物设计，可以区分甲基化和非甲基化的DNA序列。
具体步骤如下：•DNA提取：从待测样品中提取DNA。
•甲基化处理：对DNA进行化学甲基化处理，使甲基化的嵌合基对应DNA序列得以保留，非甲基化的嵌合基对应DNA序列则被转化为不同的碱基。
•PCR反应：使用特异性引物对甲基化和非甲基化的DNA片段进行扩增。
•电泳分析：将PCR产物进行凝胶电泳分析，根据PCR产物的大小和形态进行甲基化状态的判断。
MSP方法具有操作简便、快速、经济等优点，已广泛应用于DNA甲基化的研究和临床诊断中。
2. 甲基化敏感限制性内切酶PCR（MSRE-PCR）甲基化敏感限制性内切酶PCR（Methylation Sensitive Restriction Enzyme-PCR，MSRE-PCR）是一种基于限制性内切酶的DNA甲基化检测方法。
该方法利用甲基化敏感的限制性内切酶和非甲基化敏感的限制性内切酶对DNA进行切割，然后通过PCR扩增来检测DNA甲基化状态。
步骤如下：•DNA提取：从待测样品中提取DNA。
•限制性内切酶切割：使用甲基化敏感和非甲基化敏感的限制性内切酶对DNA进行切割，甲基化酶切割后产生线性DNA片段，非甲基化酶切割后产生环状DNA片段。
•PCR反应：对内切酶切割后的DNA片段进行PCR扩增。
•电泳分析：将PCR产物进行凝胶电泳分析，根据不同大小的PCR产物来判断DNA的甲基化状态。
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Liver and testis genomic DNA templates are PCR amplicated following
digestion with no enzyme(sham),Notl,Hhal(Hh) or McrBc.Amplication
using a second primer pair that has been designed to a sequence
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MSP法检测抑癌基因RASSF1A启动子区的甲基化
U M U M U M ladder
250 200 150 100
图 MSP检测组织切片DNA甲基化状态电泳图片
甲基化特异性PCR（MSP）结果，U为非甲基化，M为甲基化。
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灵敏度，便于分析微量检材 缺点： ①引物设计要求高； ②只能作定性研究； ③存在重亚硫酸盐处理不完全导致的假阳性； ④只能了解部分位点的甲基化状态。
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MethyLight
对MSP的产物用Taqman探针进行qPCR，从而 实现甲基化的定量分析。
优点：增加了重亚硫酸盐转化和DNA复性的质控对照
避免了电泳、酶切等操作
缺点：PCR bias
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应用四：结合重亚硫酸盐的限制性 内切酶法(combined bisulfite restriction analysis，COBRA)
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结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法
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基于限制性内切酶的工具酶
DNA甲基化检测方法
DNA甲基化检测方法DNA甲基化是一种常见的表观遗传修饰方式，通过甲基化在DNA分子上的加合，可以调节基因表达和遗传信息传递。
因此，DNA甲基化检测在遗传学研究、疾病诊断和治疗中具有重要意义。
本文将介绍几种常用的DNA甲基化检测方法，并对其原理、优缺点进行详细讨论。
1.甲基化特异性PCR法（MSP）甲基化特异性PCR法是一种利用特异性甲基化酶、限制性内切酶或碱性处理剂以及增强法进行检测的方法。
该方法的原理是通过甲基化特异性的酶对DNA进行酶切，使得未甲基化的DNA片段与经PCR增强的片段长度不同，从而通过凝胶电泳进行检测和分析。
优点是简单、快速且成本低廉，但缺点是需要设计和合成特异性甲基化酶。
2.基于测序的甲基化特异性分析基于测序的甲基化特异性分析方法主要有甲基化抑制PCR法（MIP）和甲基化敏感限制性内切酶测序法（MSRE-Seq）等。
甲基化抑制PCR法是通过特殊的多聚合酶在特定温度下对未甲基化的DNA完成增长，而甲基化DNA则无法进行扩增，从而区分甲基化和未甲基化的位点。
甲基化敏感限制性内切酶测序法则是首先使用甲基敏感限制性内切酶对DNA进行切割，然后进行测序分析。
这两种方法具有较高的精确性和灵敏性，但测序成本较高。
3. 甲基化特异性酶切测序法（MRE-Seq）甲基化特异性酶切测序法是一种通过甲基化特异性酶切和测序进行检测的方法。
该方法首先使用甲基敏感限制性内切酶将DNA切割成小片段，并在切割位点的两端加入特异性的测序引物，然后进行PCR增强和高通量测序。
通过测序得到的序列和甲基化位点的分布情况可以对DNA甲基化进行精确的定量和定位分析。
甲基化特异性酶切测序法具有高通量、高灵敏度和高分辨率等优点，但仍存在PCR偏差等问题。
4.甲基化微阵列甲基化微阵列是一种通过DNA的甲基化特异性杂交来检测和定量DNA 甲基化水平的方法。
该方法利用DNA片段与微阵列芯片上的探针发生特异性杂交，然后通过荧光信号检测和分析。
DNA甲基化——表观遗传学的重要组成部分
DNA甲基化——表观遗传学的重要组成部分DNA甲基化是一种表观遗传学调控机制，通常指DNA分子上的甲基化修饰。
这种化学变化涉及DNA链上的甲基基团与Cytosine碱基的配对，对基因表达和细胞分化等生命过程具有重要作用。
DNA甲基化不仅在正常生长发育中发挥至关重要的作用，而且也涉及很多人类疾病的发展。
本文将介绍DNA甲基化的基本原理、分布方式、调控机制及其在疾病中的作用。
一、DNA甲基化的基本原理DNA是由4种不同的核苷酸构成的，其中包括Adenine、Thymine、Cytosine和Guanine。
DNA的甲基化通常发生在Cytosine碱基的C5位，即通过甲基基团与细胞内的S-Adenosyl Methionine（SAM）反应，形成5-甲基Cytosine（5mC）。
DNA甲基化是基因组合成和生物遗传变异的关键机制之一。
它可以调控基因的表达和细胞分化，与疾病的发展密切相关。
虽然越来越多的研究表明，DNA甲基化是一种可逆的表观遗传修饰，但它仍然是一种稳定的标记，可以被逐代遗传，影响基因表达和细胞分化。
二、DNA甲基化的分布方式DNA甲基化在不同种类和类型的细胞中存在和分布不同。
在人体内，DNA甲基化主要发生在GC富集区域，如基因启动子、繁殖起始点、转录因子结合区等。
这些区域往往影响到基因表达的调控，因此被视为关键的甲基化信号的地点。
另一方面，DNA甲基化还出现在基因体内部的非编码区域，如intron、intergenic regions、satellite DNA和telomeres。
虽然对它们的确切功能还有争议，但这些甲基化信号可能参与调控DNA复制、染色体结构和修复。
三、DNA甲基化的调控机制DNA甲基化是由DNA甲基转移酶（DNMTs）负责催化核苷酸中的甲基基团的加成。
DNMTs可以对一些具有特定序列和结构的DNA区域进行偏好性的甲基化修饰。
这些区域的一个重要特征是在基因表达和细胞分化中发挥着重要的作用。
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DNA 甲基化重亚硫酸氢盐修饰法（DNA
METHYLATION BISULFITE MODIFICATION）
实验操作原理及方法
一、实验目的：
通过本实验，可以检测特定DNA序列的甲基化状态。
二、实验原理：
DNA 甲基化是指由S-腺苷甲硫氨酸（SAM）提供甲基基团，在DNA 甲基转移酶（DNA
methyltransferases，DNMTs）的作用下，将CpG 二核苷酸的胞嘧啶（C）甲基化为5-甲基
化胞嘧啶（5-mC）的一种化学反应。DNA 甲基化是调节基因转录表达的一种重要的表观遗
传的修饰方式。
DNA 甲基化主要在转录水平抑制基因的表达。DNA 甲基化引起基因转录抑制的机制
可能主要有以下3 种：（1）DNA甲基化直接干扰特异性转录因子与各基因启动子中识别位
置的结合。（2）序列特异性的甲基化DNA 结合蛋白与启动子区甲基化CpG 岛结合，募集
一些蛋白，形成转录抑制复合物，阻止转录因子与启动子区靶序列的结合，从而影响基因的
转录。（3）DNA 甲基化通过改变染色质结构，抑制基因表达。
重亚硫酸氢盐修饰法检测DNA甲基化的基本原理是基于DNA变性后用重亚硫酸氢盐
处理，可将未甲基化胞嘧啶修饰成尿嘧啶。此反应的步骤是：1、在C-6位点磺化胞嘧啶残
基；2、在C-4处水解去氨基来产生尿嘧啶磺酸盐；3、在碱性条件下去硫酸化。在这个过程
中，5-甲基胞嘧啶由于甲基化基团干扰了重亚硫酸氢盐进入到C-6位点而保持着未反应的状
态。在重亚硫酸氢盐处理后，使用针对每个修饰后DNA链的引物进行PCR反应。在这个
PCR产物中，每5-甲基胞嘧啶显示为胞嘧啶，而由未甲基化胞嘧啶转变成的尿嘧啶则在扩
增过程中被胸腺嘧啶所取代。
BSP(bisulfate sequencing PCR) ：重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨
基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，进行PCR扩增。最后，对PCR产物进行
测序，并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。
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三、实验方法及步骤：
1、复苏并培养细胞，当细胞长至一定程度后，收细胞沉淀并提取其DNA。
2、使用EZ DNA METHYLATION-GOLDTM KIT 试剂盒，将DNA进行亚硫酸氢盐修饰，
详见附录1。
3、将上一步中已亚硫酸氢盐修饰的DNA模板进行PCR扩增，详见附录2（BSP）。
4、切胶回收。
5、TA-cloning和转化。
6、涂平板进行蓝白斑筛选。
7、当菌落长至一定程度后，挑选白色菌落进行菌落PCR（体系同BSP）。
8、挑选上一步中跑胶出现条带的白色菌落先将其加入约3ml的不含抗性的LB液体培养
基中摇过夜，后取其1ml送去测序。其余的菌液取500ml加入500ml 50%的甘油冻入-80℃
冰箱。
9、测序结果分析（详见附录3）。
四、试剂配制：
1、CT Conversion Reagent：（1）、将900 µl 水, 300 µl 的M-Dilution Buffer和 50 µl
M-Dissolving Buffer加入一管的 CT Conversion Reagent。（2）、在室温下震荡或颠倒约10分
钟将其混匀。
注意: CT Conversion Reagent中常有少量的不溶试剂，这很正常。每一管 CT Conversion
Reagent 可以处理10个不同的DNA样品。
保存: CT Conversion Reagent 对光敏感, 故要注意避光。为了得到最好的结果, CT
Conversion Reagent最好现配现用。如果用不完, CT Conversion Reagent 溶液可以室温过夜、
4°C保存一周或 -20°C保存一个月。保存的 CT Conversion Reagent溶液必须现将其热至
37°C, 震荡后再使用。
2、M-Wash Buffer：将 24 ml100% 的乙醇加入 6 ml M-Wash Buffer 浓缩液中。
五、注意事项：
1、亚硫酸氢盐修饰的DNA样品的量要在500pg到2ug之间。
2、BSP很容易污染出现阴性条带，故此步骤要注意操作，避免污染。
3、Taq酶是热启动酶。
4、感受态细胞取出后要马上放在冰上解冻，并在刚解冻时马上使用其转化效率最高。感
受态细胞要注意不要反复吹打。
5、步骤6中要使用KANA或Amp抗性的LB平板，在用菌液涂板前要先在每个平板上
涂上500mM的IPTG约8ul和40mg/ml的x-gal约40ul，并在37℃预热。
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附录1：
1、在PCR单管中加入130ul的CT Conversion Reagent和20ul的DNA样品（如样品少
于20ul，用水补齐）。
2、PCR(98℃ 10min 64℃ 60min 64℃ 60min 64℃ 30min 4℃∞)。
3、将600ul的M-Binding Buffer加入Zymo-Spin™ IC Column中，并将其放入收集管中。
4、将步骤2中PCR后产物加入含有M-Binding Buffer的Zymo-Spin™ IC Column中，关
上盖子并颠倒混匀。
5、离心（最高速）30s，弃收集管中的液体。
6、加入100ul的M-Wash Buffer，离心（最高速）30s。
7、加入200ul的M-Desulphonation Buffer，在室温下（20℃~30℃）静置15~20分钟，离
心（最高速）30s。
8、加入200ul的M-Wash Buffer，离心（最高速）30s。重复一次。
9、将Zymo-Spin™ IC Column置入1.5 ml离心管中，加入10ul的M-Elution Buffer（尽
量靠近柱子中心），离心（最高速）30s。产物放入-20℃保存。
附录2:
MSP-S体系：
DNA 4ul
10*PCR buffer 2.5ul
dNTPS 1.5ul
p16-s-f （primer，各为 1ul
p16-s-r 10uM) 1ul
Taq 0.2ul
ddH2O 14.8ul
反应条件：
95℃ 10min 95℃ 1 min 58℃ 40s 72℃ 1min 72℃ 10min 4℃∞
Step 1 1cycle step2 40 cycle step3 1 cycle
附录3：
举例：
上图中P16 exon1是完全未甲基化的对照序列，可见其所有未甲基化的C都转化为T。其下
五个DNA序列为本次测序后回来的序列，它们分别是SCID22-3B-1-tumor细胞的加puer-tea
组、加5-aza-dc组和空白对照组。正常的SCID22-3B-1-tumor细胞其p16基因由于其启动子
CpG岛甲基化是甲基化沉默的，而加puer-tea和5-aza-dc会去甲基化。由上图可见空白对照
组中红色的C为仍然甲基化的C,这些红色的C就是p16基因CpG岛甲基化位点。而其同一
列中黑色的T为去甲基化而转化为T 的C。