(整理)基因操作原理

（这份材料根据老师给的PDF课件整理，仅供参考）

第一章

编码产生一种有生物学功能产物---蛋白质（多肽）或RNA所需信息的一段DNA称基因。Include:

1.编码蛋白质肽链或RNA所必需的核苷酸序列(open reading frame)

2.保证转录所必须的调控序列(S-D)

3. 5’-和3’-非翻译序列(leader and trailer)

4.内含子(intron)

Recombinant DNA（重组DNA）：是将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。

这项技术可概括为∶分、切、连、转、选。

两个最基本的特点是分子水平上的操作和细胞水平上的表达。

基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。

Genetic Engineering（基因工程）重组DNA技术与基因工程的基本用途分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源大规模生产生物活性物质设计、构建生物的新性状甚至新物种大规模生产生物活性物质工程细胞。

Development of gene engineering：

第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表达经典基因工程

第二代基因工程蛋白编码基因的定向诱变蛋白质工程

第三代基因工程代谢信息途径的修饰重构途径工程

第四代基因工程基因组或染色体的转移基因组工程

第二章

目的基因的获得（DNA的准备）

1.从基因组直接获得

2.RT-PCR 方法获得

3.人工合成法

DNA抽提的基本原理

•1 获得细胞，裂解细胞

三种破壁、膜的方法比较：非离子型去污剂法较温和．适用于抽提10kb左右的质粒；而煮沸法与碱性SDS法相对较剧烈．只能抽提小于10kb的质粒，当然在熟练方法的前提下，碱性SDS法也能抽提较大的质粒。非离子型去污剂的变性能力较弱，常用的TritonX—100等，常用的离子型去污别是SDS。在选择去污剂类型对应根据变性剧烈程度的要求而定。

2 分离（质粒DNA与染色体DNA的分离）

3 纯化（去除RNA）

•RNA与DNA相比在化学及生化性质上有差别，因此可选用RNA酶处理．以保留DNA分子而专门分解RNA。

3 纯化（去除蛋白）

•常用的去除蛋白质的试剂有酚、酚／氯仿、氯仿／异戊醇。

PCR的基本原理：变性、复性、半保留复制

PCR三步曲：1. DNA热变性90～97℃ 2. 引物退火45～55℃ 3. 引物延伸72℃左右

How many copies?

1.到第3个循环才有目的片断（指用长DNA作为模板）.

2.早期并不严格按2倍增长

3.30 循环时约有1,073,741,764 个目的产物(~1×109).

4. 有约60 不是目的长度的片断.

5.大于35 个循环时不能明显增加产物量

进入平台期的原因:1.反应试剂用完2.产物之间相互退火3. Taq酶活性降低

优化PCR反应：

1.引物的退火温度.

2.Mg2+ 的浓度.

3. 延伸时间.

4.模板和Taq的量

能否扩增RNA?

• Not directly — the DNA polymerase requires a DNA template and will not copy RNA. • mRNA can first be copied into cDNA using reverse transcriptase.

• cDNA is a template for PCR — it need not be double-stranded.

TA 克隆：

1.Taq扩增PCR产物物末端加个A；

2.可以与末端为T的载体直接连接

引物设计要求：引物长度在20个碱基左右；.引物G/C 含量约 45–55%；2条引物退火温度差别不要超过1°C；引物内部最好没有反相互补序列；2条引物之间不能有互补序列；引物内部不能有重复序列。

PCR存在的问题：

1 . 可信度（ F i d e l i t y ）： P C R 反应过程中的错配现象，给PCR克隆、变异导入带来麻烦。

2.扩增的DNA长度：一般扩增1～2 kbp以下的DNA片段。

3.扩增的DNA量：对有些检测、克隆时，DNA量往往达不到要求。

4. PCR扩增困难：当DNA富含GC或具有复杂二级结构时，PCR很难扩增。

5.PCR反应速度：当急于得到实验结果时，PCR反应速度较慢。

2-3 分子杂交

1 Southern Blotting

2 Northern Blotting

3 Western Blotting

（一）Southern Blot 基因组DNA与DNA探针的杂交

功能：

1 研究某一基因在基因组中的拷贝数

2 研究异源物种是否有类似基因（ZooBlooting）

•原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。

用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。Southern Blot Southern Blot 操作步骤：

DNA →琼脂糖电泳→印迹转移→预杂交→

杂交（变性探针）→洗膜→放射自显影或显色

二、Northern Blooting RNA与DNA探针的杂交

功能：1 分析mRNA的分子量大小 2 分析mRNA表达量