第一章 基因操作原理的理论基础.
基因操作原理01-PPT精品文档
这里所说的基因操作并不是一个法律概
念，除了包括基因克隆外，还包括基因
的表达，调控，检测等，与基因研究相 关的内容。
了解对基因的研究是如何实施的
二、本课程在学科发展中的地位
这门课以前叫“分子克隆I” 实验课为“分子克隆II”
利用分子生物学原理,为在分子或基因水 平的研究服务的学科
20世纪是生物学发展最为迅速的时期，1953年由于 认识了DNA的双螺旋结构，从而揭开了分子生物学 研究的热潮。 在整个生物学研究进程或研究层次来说，其发展过 程涉及到个体、组织器官、细胞、亚细胞水平 同时由于遗传学的兴起与发展，DNA作为生命遗传 信息的物质基础被确定下来，从而导致分子生物学 的诞生。
基因克隆的技术路线
...GAATTC... EcoRI ...CTTAAG... ...G ...CTTAA AATTC... G...
基因克隆的技术路线
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酶切 连接
酶切
基因克隆的技术路线
２．基因及其产物的非共线性
interrupted gene, intron
３．基因的重叠与可变性
三、基因的基本结构组成
• 编码区 ORF • 启动子 promoter
• RBS
ribosomal binding site
• 终止区 terminator
• flanking sequence
• upstream / downstream • Cap/tail
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酶切
基因克隆的技术路线
基因操作的原理和过程
基因操作的原理和过程基因操作（Genetic engineering）是一种利用基因技术对生物体的遗传物质进行修改和重组的技术手段。
通过基因操作，可以对生物的基因进行剪接、修饰或移除，并向生物中引入新的基因或基因片段，从而改变生物的遗传特征和表现形式。
基因操作在农业、医学、生物工程等领域都有广泛的应用，它不仅可以提高生物的抗病性、耐性和产量，还可以用于研究基因的功能和调控机制。
基因操作的原理是基于对生物体的基因组进行修改和优化，具体分为以下几个步骤：1. 选择目标基因：首先需要确定要操作的基因，可以是现有生物体中的某个基因，也可以是外源基因。
有时也会选择修改某个特定区域的基因片段。
2. 基因克隆和构建载体：利用分子生物学技术，将目标基因从生物体中分离提取。
然后，将目标基因插入到载体DNA中，构建成重组载体。
常用的载体包括质粒和病毒。
3. 转化目标细胞：将构建好的重组载体导入到目标细胞中。
可以通过多种途径实现细胞的转化，如化学转化、电转化、冷冻复苏等。
4. 基因表达和筛选：在转化成功后，目标基因会在细胞内进行表达，从而改变生物的遗传特征和表现形式。
为了筛选出表达目标基因的细胞，可以在重组载体中引入选择标记基因，如抗生素抗性基因。
5. 验证和分析：在筛选出表达目标基因的细胞后，需要对其进行验证和分析。
可以通过PCR、酶切、同源重组等技术手段来验证基因操作的结果，并进一步分析基因的功能。
基因操作的过程中有一些关键技术和工具，如PCR技术、限制性内切酶、连接酶、DNA测序等。
这些技术和工具的应用使得基因操作的过程更加高效、准确。
基因操作的应用领域广泛，涉及农业、医学、生物工程等多个领域。
在农业领域，基因操作可以用于改良农作物的品质和产量，提高抗病虫害的能力，延长保存期限等。
比如，通过引入抗病虫害基因，使植物对害虫和病毒的侵害产生免疫反应。
在医学领域，基因操作可以用于治疗遗传性疾病、癌症等疾病。
比如，通过修正患者的遗传突变，可以恢复正常的基因功能。
《基因操作原理》课程教学大纲
《基因操作原理》课程教学大纲课程编码：3043009402 课程名称：基因操作原理总学分： 3 总学时：48课程英文名称：Principles of Gene Manipulation先修课程：生物学，生物化学，遗传学，分子生物学等适用专业：生物技术, 生物科学, 应用生物技术, 生物工程等一、课程教学目的《基因操作原理》是伴随着生物学尤其是分子生物学的飞速发展而兴起的一门新学科。
是分子生物学系列教材中的重要环节，是一门直接利用分子生物学基础知识指导分子生物学实验操作的理论与实践相结合的课程, 其上承接《分子生物学》课程，其下有《分子克隆技术》作为本课程配套的实验课程。
本教材以基因工程的操作技术，即基因操作原理为主线，重点介绍在核酸水平上进行各种操作的基本原理和技术步骤，希望通过对基础原理的认识，能够理解和掌握实践中具体操作的原理和步骤，并能自主选择或设计相关的实验方法；掌握通过基因工程的方法实现物种改种和生物制药的途径和工作原理。
二、课程教学任务任务重点介绍基因操作中的工具酶及其种类、活性和用途；质粒载体、 噬菌体载体和表达载体等的基本构成、种类和用途；重组DNA导入细菌和真核细胞的方法；DNA、RNA和蛋白质的分离及检测技术；定点诱变技术；PCR技术原理及其应用；cDNA文库和基因组文库的构建；分子杂交原理和技术；DNA序列分析的原理，通过Internet 进行序列分析处理以及数据的获取。
本门课程开设的指导思想在于使学生在掌握一般生物学以及分子生物学知识的基础上，掌握DNA重组，转移、表达和检测等技术的基本概念和基本原理，为日后从事基因工程和分子生物学研究打下技术操作方面的理论基础。
三、课程教学内容的结构课程组将分子克隆的具体技术与基因研究的宏观策略按照“宏观-微观”、“微观-宏观”的方式，实现动态知识与静态基础的有机统一，主要分为四个层次：1.基因操作静态知识。
讲授进行基因操作必备的常用工具，包括分子克隆工具酶（14学时），分子克隆载体（24学时）；2.基因操作动态知识。
基因工程知识点
基因工程各章知识点第一章绪论1．基因工程的首例操作实验三大理论基础：DNA是遗传物质、DNA的双螺旋结构和半保留复制、遗传密码的破译和遗传物质传递方式的确定三大技术基础：限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割、DNA连接酶的发现与DNA片段的连接、基因工程载体的研究与应用基因工程的诞生：72年，P.Berg首次实现体外DNA重组：体外用EcoRI分别切割SV40和λDNA,并用T4 DNA连接酶连接成为重组的杂种DNA分子73年，S.Cohen 体外重组DNA并转化：具Kanr的E.Coli质粒R6－5和具Tetr的E.Coli质粒pSC101切割并连接转化的大肠杆菌具有双重抗性S.Cohen 和H.Boyer首次实现真核基因在原核中表达：将非洲爪蟾的DNA与E.Coli质粒（pSC101）体外切割并连接，转化大肠杆菌2．基因工程的基本概念基因工程是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种新物体（受体）内，使之稳定遗传并表达出新产物或具有新性状的DNA体外操作技术，也称为分子克隆或重组DNA 技术。
供体、载体、受体是基因工程的三大基本元件。
3．基因工程的基本操作过程a分离目的DNA片段：酶切、PCR扩增、化学合成等。
b重组：体外连接的DNA和载体DNA，形成重组DNA分子。
c转化：将重组DNA分子导入受体细胞并与之一起增殖。
d筛选：鉴定出获得了重组DNA分子的受体细胞。
e对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。
第二章载体1．理解用PBR322和PUC18作载体的克隆外源基因的原理。
答案不确定PBR322作载体的克隆外源基因的原理:PBR322质粒具有12 种限制性内切酶的单一识别位点：T et r 基因内有7个酶切位点：Bam HⅠ，SalⅠ：Amp r基因内有3 个酶切位点：PstⅠ。
Eco RⅠ和HindⅢ不在抗生素基因内，不导致插入失活。
基因操作原理和方法
克隆和重组技术的应用
克隆和重组技术广泛应 用于基因工程、生物制 药、农业和医学等领域 。
在基因工程中，克隆和 重组技术用于生产重组 蛋白、疫苗和抗体等生 物制品。
在农业中，克隆和重组 技术用于改良作物品种 和提高农作物的抗逆性 和产量。
生物科学研究
基因敲除和敲入技术可用于研究基因功能、细胞信 号转导、药物筛选等生物科学研究领域，有助于深 入了解生命活动的本质。
生物制药
基因敲除和敲入技术可用于生产基因工程药物，通 过改造或增强微生物、细胞或动物细胞中的基因表 达，生产具有特定功能的药物。
敲除和敲入技术的限制和挑战
80%
技术难度高
基因敲除和敲入技术需要精确的 操作和设计，对技术和实验条件 要求较高，且存在一定的失败率 和不确定性。
05
基因编辑新技术
CRISPR-Cas9系统
总结词
CRISPR-Cas9系统是一种高效、简单、低成本的基因编辑技术，通过向导RNA和Cas9 蛋白的引导，实现对特定DNA序列的切割和修复。
详细描述
CRISPR-Cas9系统利用向导RNA与目标DNA序列的特异性结合，将Cas9蛋白引导至目 标位置，通过切割DNA双链形成缺口，启动细胞内的DNA修复机制。在修复过程中， 插入、删除或替换特定DNA序列成为可能，从而实现基因敲除、敲入和点突变等基因
基因操作的历史与发展
基因操作技术的起源可以追溯到20 世纪70年代，当时科学家开始探索 限制性内切酶和DNA连接酶等工具 的应用。
随着技术的不断发展，基因操作逐渐 成为现代生物学和医学研究的重要手 段，广泛应用于基因克隆、基因治疗 、基因工程等领域。
大学《基因工程学》教学大纲
《基因工程学》课程教学大纲（Genetic Engineering）一、课程说明课程编码：02200200课程总学时（理论总学时/实践总学时）：48（48/0）周学时（理论学时/实践学时）：4（4/0）学分：31．课程性质：专业必修课。
2．适用专业与学时分配：适用生物技术专业。
教学内容与学时分配3．课程教学目的与要求：本课程的授课对象是生物技术专业的本科生。
课程简介：《基因工程》是生物技术专业的专业必修课程。
其以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段而建立起来的一门技术学科。
基因工程兴起于20世纪70年代初，它的问世带动了生物技术的兴起和发展，是现代生物技术的核心内容。
基因工程课程的主要内容包括基因的分离、基因的克隆、基因的表达、植物基因工程、动物基因工程、药物基因工程和基因治疗等。
它是生命科学学院生物技术专业本科生的主干专业课程之一，它是生物工程（包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程）中最重要的课程，其它三大工程是建立在基因工程基础之上的，同时也为生物技术制药等后继学科奠定了重要的理论基础。
课程目标：设置本课程是为了让生物技术专业的学生理解和掌握基因工程的技术原理，通过本课程学习，掌握基因操作的工具酶，基因克隆常用载体，目的基因的分离与合成，重组体的构建，重组体向宿主细胞的导入，重组体克隆的筛选与鉴定以及克隆基因的表达，同时了解基因工程在生物学领域中的应用与发展前景。
对学生达到毕业要求贡献如下：1）了解基因工程学的历史、发展和前沿知识。
2）掌握基因工程学的基础理论、基本知识和基本技能；教学要求：学完基因工程学后，学生将具备以下能力：1）具有良好的自学能力；2）综合运用所掌握的基因工程学理论知识和技能、从事生物科学及其相关领域科学研究的能力。
4．本门课程与其它课程关系：先修课程为生物化学、微生物学、分子生物学、细胞学等，具备基础理论知识及实验能力是基因工程学课程的基础。
基因工程的理论基础是什么
基因工程的理论基础是什么简介基因工程是一门将DNA技术应用于生物学和医学领域的学科。
它涉及人为地操纵和编辑基因，以便改变生物体的特性和功能。
基因工程的理论基础是一系列关于基因和遗传信息的原理和概念，包括基因结构、DNA复制、基因表达和基因调控等。
基因结构基因是生物体内控制遗传信息传递和表达的基本单位。
它们由DNA分子组成，DNA分子是由四种碱基（腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和鳟嘌呤）组成的双螺旋结构。
基因包含着编码特定蛋白质的遗传信息。
基因中的信息以特定的顺序编码为DNA中的核苷酸序列。
DNA复制DNA复制是基因工程中的一个关键过程，它使得细胞能够产生相同或相似的DNA分子。
在DNA复制期间，DNA的双螺旋结构被解开，每个DNA链上的碱基被配对，最终形成两条完全相同的DNA分子。
这个过程能够使得遗传信息得以传递给细胞的后代。
基因表达和基因调控基因表达是指基因通过转录和翻译过程产生特定蛋白质的过程。
在转录过程中，DNA的信息被转录成RNA分子，然后通过翻译过程将RNA翻译成蛋白质。
基因调控是控制基因表达的过程，它包括激活和抑制基因的调控元件和转录因子等。
基因调控使得细胞能够根据需要合理地调节基因表达水平，以适应不同环境和生理需求。
基因工程的应用基因工程的理论基础为其在众多领域的应用提供了支持。
基因工程技术已经被广泛应用于医学、农业和环境保护等领域。
在医学领域，基因工程技术被用于生产重组蛋白质药物，如胰岛素和生长因子等。
此外，基因工程还在基因治疗方面有着重要的应用，通过介入细胞基因表达系统来治疗遗传性疾病。
在农业领域，基因工程技术被用于培育转基因作物，以提高产量和抗性。
例如，转基因植物可以被设计成抗虫、耐旱或耐盐等特性，以应对不同的环境条件。
在环境保护领域，基因工程技术可以用于修复环境污染和减少污染物的产生。
例如，通过转基因微生物，可以加强其对污染物的降解能力，帮助净化土壤和水体。
结论基因工程的理论基础是一系列关于基因和遗传信息的原理和概念。
《基因操作原理》课程学习指南
《基因操作原理》课程学习指南《基因操作原理》课程是生命科学相关专业分子生物学课程体系的中间环节，承接上游《分子生物学》课程与下游《基因工程》课程。
《基因操作原理》在基因工程的实践中深化分子生物学的理论知识，并且通过分子生物学的理论知识更好地指导基因工程实践。
《基因操作原理》课堂是学习基因操作技术、基因研究策略等必备本领的场所，是通往分子生物学神圣研究殿堂基石。
本课程目标是让学生掌握基因是怎样去研究的、基因工程是如何实现的，如何设计研究基因的基本方案，为学生进入研究生阶段开展分子生物学研究打好理论和思维基础，为本科毕业从事生物技术和生物科学工作强化基因操作的认识。
一、先期要求和配套课程在学习该门课的先期应学习《分子生物学》，《生物化学》、和遗传学等基本理论知识。
跟该课程同时配套开设的还有《分子克隆技术》，以便于对该课程的相关知识学以致用，加深对相关技术原理的理解和认识。
二、课程学习建议1.教学过程课堂教学——课后自习——课后作业——课外辅导——习题库——课程综合报告——期末考核2.教学内容及学时安排（祥见资源库教学大纲内容）3.各章节教学重点和难点（祥见资源库教学大纲内容）4.指导和建议（1）做好课前预习。
按教学进程做好课前预习，尽可能理解教材中重点和难点内容，记下理解发生困难的内容，然后有针对性的上课听课，同时积极参与课外交流等。
（2）做到认真听课。
理解每次课的教学目的及相关知识点和知识面，记下未听懂的相关问题便于课后交流与辅导。
（3）课后积极交流。
对于本课程难以理解的问题和需要深入讨论的问题可通过课外辅导、习题课等教学环节的帮助。
（4）认真完成课程作业。
课程作业是巩固所学知识点和知识面的重要环节。
本课题布置的相关课程作业均是以实际素材引导学生对基本概念的理解和掌握，充分利用科学研究的实际例子为模板进行剖析，从中找到工作原理和技术实质。
课程作业的完成也是对相关知识点进行整理和积累的过程，应独立收集资料并仔细思考完成。
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第一节基因操作原理
基因操作（Gene Manipulation）的核心部分为分子克隆（molecular cloning）。
由于政府对基因操作有一定的法律约束，大多数国家对此都有一个精确的法律定义。
比如在英国将基因操作定义为将在细胞外产生的核酸（物质）分子插入到病毒、质粒或其它载体系统中，再整合到那些本来不含该类物质的宿主中，从而形成一种新的可连续繁殖的有机体。
（引自Principles of Gene Manipulation ，Black well Scientific Publications , RW. OLD & SB Primrose , 1985）。
强调外源核酸分子（一般情况下都是DNA）在不同宿主中的繁殖，打破自然种的界限，将来自不相关物种的基因放入一个宿主中是基因操作的重要特征。
另一个特征是繁殖。
这里所说的基因操作并不是一个法律概念，除了包括基因克隆外，还包括基因的表达、调控、检测和改造等与基因研究相关的内容。
本课程就是为了讲述在核酸水平上对基因进行研究所涉及的方法、技术和策略的原理，主要是基本的、通用的原理，对于涉及到具体的学科或领域的原理不在此范围内。
基因操作原理在生物学科发展中具有重要地位。
这门课以前叫“分子克隆Ⅰ”，“分子克隆Ⅱ”为实验课。
但无论叫什么，本门课程到底要讲些什么，它的地位如何？
20 世纪是生物学发展最为迅速的时期，1953年由于认识了DNA 的双螺旋结构，从而揭开了分子生物学研究的热潮。
在整个生物学研究进程或研究层次来说，其发展过程涉及到个体、组织器官、细胞、亚细胞水平，同时由于遗传学的兴起与发展，DNA 作为生命遗传信息的物质基础被确定下来，从而导致分子生物学的诞生。
分子生物学严格来说应是从分子水平或核酸水平上进行研究的生物学，研究生物的生物学现象和本质，如DNA的结构、复制、表达、调控、遗传、变异等。
由于分子生物学的进一步发展，生物学的各个分枝学科都延伸到了分子水平，在这种情况下，传统分子生物学就是一个包罗万象的学科，大的可以说动、植、微生物的分子生物学，小的可以说某些物种的分子生物学，如水稻的分子生物学、链霉菌的分子生物学、芽胞杆菌的分子生物学。
在这种情况下，传统的分子生物学就好象是高级生物化学，阐述基因或者说 DNA（核酸）的静态和动态化学本质。
目前的分子生物学，朝着发育、结构和遗传生物学的方向发展。
如果说传统的分子生物学是静态分子生物学的话，那么这些学科可以说是动态分子生物学，即在分子水平（核酸）上，研究生物的生长、分化、死亡以及遗传和变异的内在规律。
在以上这些研究中，均涉及在DNA 水平的操作，本门课程就是要讲述这相关的原理，为分子生物学的研究服务。
通过分子生物学内在的原理，如 DNA 结构、复制、转录、表达、调控等，讲述研究方法和技术的设计原理。
1．基因及其产物的共线性
基因决定蛋白质的序列组成，是由密码子对应特定氨基酸所决定的。
当一个基因的核苷酸序列与其产物的氨基酸序列是一一对应时，则表明它们是共线性的。
例如，由N 个氨基酸组成的蛋白质，其基因由对应的基因编码区的3N 个碱基组成。
在原核生物中，基因与其产物是共线性的。
这在基因克隆中有重要意义。
2．基因及其产物的非共线性
70年代以来，在真核生物中发现了间断基因（interrupted genes），后来发现这种间断基因在真核生物中普遍存在，也就是后来所说的基因间存在着内含子（intron）。
内含子指真核生物基因中不能翻译成蛋白质的DNA 片段，但可被转录，当两侧序列（外显子）的转录 RNA 被剪接在一起时，就将内含子转录的RNA 从整个转录物中除去。
外显子是指能够翻译成蛋白质的任一间断的基因片段，一个基因可有多个外显子。
内含子并不是一成不变的，具有相对性，对一个 DNA 片段来说，在某个基因中是内含子，但在另一个基因中却可作为外显子。
图 1-1 是从DNA 到蛋白质的流程。
实际上内含子与外显子的概念是相对而言的。
有些内含子可作为其它基因的外显子，它们是彼此不相关的基因，如Yeast 线粒体中的某些基因。
另外基因本身有可变换的表达途径，在一条途径中作为内含子的片段，在另一途径中可作为外显子。
这两条途径产生两种蛋白质，它们的末端是相同的，但其中之一在中央部分有额外的序列，因而这一DNA 区段可以为一种以上的蛋白质编码。
DNA
exon1 intron 1 exon 2 intron 2 exon 3 intron 3 exon 4
转录
Pro-mRNA
exon1 intron 1 exon 2 intron 2 exon 3 intron 3 exon 4
mRNA
翻译
蛋白质
图1-1：真核生物中蛋白质合成过程中外显子和内含子的关系
3．基因的重叠与可变性
DNA 序列在代表蛋白质方面的功能不是单一的，单个 DNA 序列可编码一个以上的蛋白质，这些蛋白在结构上有的是相同的序列重复，也可以是全新的蛋白质。
由单个基因通过在不同部位的起始（或终止）表达而形成两种蛋白质，两个基因也可通过在不同读码中译读 DNA 而共用同一序列。
基因的重叠与可变性也可从重组中得以体现。
例如芽胞杆菌的spoⅣ 基
因片段分布在两个不同区域，当需要发挥作用时，便通过重组而连接在一起。
另外，抗体基因的重组变换以及表面蛋白的产生也同样都表明基因的可重叠性与可变性。
4．启动子
启动子是基因转录过程中控制起始的部位，通常一个基因是否表达，转录起始是关键的一步，是起决定性的。
对大多数基因来说，只要转录起始了，表达一般是可进行的。
启动子又是 RNA 聚合酶的结合位点，不同生物中这个结合（识别）位点是有差异的，同一生物的不同基因之间也有差异。
转录终止子主要有两种，一种依赖ρ因子，另一种不依赖ρ因子。
后者主要是能够形成特定二级结构的 DNA 序列，如茎环结构。
5．基因克隆的通用策略
克隆的概念是广泛的，但基因克隆在一定程度上被等同于基因的分离。
本讲义主要采用这一狭义的概念。
假如从一个原核生物中克隆某基因（1-2kb），它的基本步骤是先用限制性内切酶切割外源 DNA 和载体（质粒 DNA 载体或噬菌体载体），然后连接，转化，构建出基因文库，再筛选。
克隆的简要步骤见图 1-2 。
除了通常的克隆外，还有亚克隆。
初步克隆中的外源片段往往较长，含有许多目的基因片段以外的 DNA 片段，在诸如表达、序列分析和突变等操作中不便进行，因此必须将目的基因所对应的一小段 DNA 找出来，这个过程叫“亚克隆”。
图1-2 原核生物基因克隆的步骤示意图。