甲基化整体研究思路

甲基化整体研究思路

DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一，真核生物中甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA 甲基化转移酶（DNMTs）的作用下的CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因重新活化和表达。研究这种DNA修饰方式在不改变基因序列的前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA甲基化状态与生长发育调控及生理状态密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则程高度的甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。

原核生物中甲基化多发生在CCA/TGG和GATC序列；真核生物中DNA甲基化一般发生在CpG位点上；哺乳动物DNA甲基化只发生在CpG岛的胞嘧啶，植物甲基化发生在CpG和CpNpG。甲基化会使胞嘧啶转为5-甲基胞嘧啶，CpG位点在基因组是不常见的，主要密集于接近基因启动子的位置，统称为CpG岛。CpG位点的甲基化可以对基因表现有重要的影响。

哺乳动物中，CpG序列在基因组中出现的频率仅有1%，远低于的其它双核苷酸序列。但在基因组的某些区域中CpG序列密度很高，可以达均值的5倍以上即所谓的CpG岛。通常，CpG岛大约含有500多个碱基，位于基因的启动子区或第一个外显子区。在哺乳动物基因组中约有4万个CpG岛，而且只有CpG岛的胞嘧啶能够被甲基化。

甲基化研究思路：

1. 寻找甲基化位点

1) 甲基化二代测序寻找甲基化位点；

2) 对照组和实验组进行甲基化芯片检测，找到相关的甲基化位点；

3) 一些相关研究显示某些基因存在表达量降低的现象，可预测该基因是否存在CpG岛；

4) 根据文献寻找相关基因的甲基化位点。

2. 验证甲基化位点，并进行甲基化程度分析

采用对照组和实验组样本进行甲基化验证。

1) MSP方法：可进行特定位点甲基化验证，适用于甲基化芯片后的结果，无法进行甲基化程度分析；

2) BSP克隆测序法：验证某些相关基因的甲基化位点，并计算出精确的甲基化程度百分比；

3) HRM法：适用于大批量样本甲基化验证，并能计算出甲基化程度范围；

4）焦磷酸测序法：验证某些相关基因的甲基化位点，并计算出精确的甲基化程度百分比。

3. 分析甲基化位点与研究的相关性

根据对照组和实验组样本的检测结果，分析与研究的相关性。

1) 比较对照组和实验组相同甲基化位点甲基化是否有差异；

2) 比对对照组合实验组相同基因启动子区甲基化程度是否有差异；

4. 验证启动子发生甲基化的基因的表达量变化

采用荧光定量PCR的方法检测相关基因的表达量，如果表达量降低，可能由于启动子区发生甲基化导致的，从而影响该基因所在的某些通路，导致一些疾病，或表型发生变化；如果没有发生变化，可能由于发生甲基化的区域与转录因子之间关联不是很密切，从而不会影响基因的表达。

除了以上4个基础方向外，还有两个特殊方向：

1.省钱思路：老数据二次挖掘

第一步：先从原有的表达谱芯片数据或转录组数据中，挖掘到差异表达的甲基化酶；

第二步：对挖掘到的甲基化酶如METTL3或FTO等进行qPCR验证，并进行m6A-seq分析哪些基因甲基化水平发生改变；

第三步：在细胞或动物模型中对这些基因进行敲低和过表达，qPCR和WB检测基因表达情况，并用LC-MS/MS法检测RNA整体m6A水平；

第四步：继续对这些敲低和过表达的细胞进行转录组测序/小RNA测序或表达谱芯片/小RNA 芯片，分析哪些基因出现差异表达变化和可变剪切变化；

第五步：找到甲基化酶调控的靶基因，进行敲低和过表达，看甲基化酶缺陷的细胞或动物模型表型能否补救；

第六步：在确定上一步靶基因确实受到甲基化酶调控后，对靶基因上的motif进行点突变后进行验证；

第七步：鉴定新型的甲基化酶（可选）。

2.高分思路：研究甲基化修饰差异基因

第一步：直接进行m6A-seq和转录组测序，找到时间顺序或差异表达的基因并用qPCR、WB 等方法验证，此外找到m6A有差异的基因；

第二步：对甲基化酶进行敲低和过表达，检测RNA整体的m6A水平，之后可进行转录组或小RNA测序等方法检验甲基化酶敲低和过表达对mRNA或miRNA整体的影响，并着重研究第一步中感兴趣的m6A有差异的靶基因；

第三步：对靶基因进行敲低或过表达，是否能够对甲基化酶异常表达后的表型进行恢复；第四步：对靶基因上motif进行点突变后进一步确认直接受到甲基化酶调控；

第五步：鉴定新型的甲基化酶（可选）。