06 甲基化检测原理及步骤
甲基化测序原理
甲基化测序原理甲基化测序是一种用于研究DNA甲基化状态的技术，它能够帮助我们了解基因组中甲基化的分布情况，从而深入理解基因表达调控、疾病发生机制等重要生物学问题。
在甲基化测序中，我们通常会使用一些特定的方法和技术来分析DNA中的甲基化信息，下面我们将对甲基化测序的原理进行详细介绍。
首先，我们需要了解DNA甲基化是什么。
DNA甲基化是指DNA分子中的甲基基团（-CH3）与DNA碱基结合的化学修饰过程，主要发生在胞嘧啶（C）碱基上。
这种化学修饰可以影响基因的表达和功能，对细胞的生长、分化和发育起着重要作用。
因此，研究DNA甲基化对于理解生物学过程和疾病机制至关重要。
甲基化测序的原理主要包括以下几个步骤，DNA提取、甲基化处理、测序和数据分析。
首先，我们需要从待测样本中提取DNA，并对DNA进行甲基化处理，将未甲基化的胞嘧啶与甲基化的胞嘧啶区分开来。
接下来，我们将进行测序，通过高通量测序技术获取DNA序列信息。
最后，我们需要对测序数据进行分析，识别出甲基化位点的信息。
在甲基化测序中，常用的技术包括甲基化特异性PCR、甲基化敏感限制酶切和甲基化敏感测序。
甲基化特异性PCR是一种通过特定引物扩增甲基化和非甲基化DNA片段的方法，可以用于检测DNA甲基化的状态。
甲基化敏感限制酶切是利用甲基化状态对限制酶的敏感性不同来区分甲基化和非甲基化DNA片段的方法。
而甲基化敏感测序则是利用高通量测序技术对甲基化DNA进行测序，从而获得甲基化位点的信息。
甲基化测序的原理虽然看似简单，但在实际操作中需要高度的技术和方法的支持。
同时，对于测序数据的分析也需要专业的知识和工具。
通过甲基化测序，我们可以全面了解基因组中的甲基化信息，从而深入研究基因表达调控、疾病发生机制等重要生物学问题，为生命科学研究提供重要的数据支持。
总之，甲基化测序是一种重要的技术手段，它为我们研究DNA甲基化提供了有力的工具。
通过深入理解甲基化测序的原理和方法，我们可以更好地开展基因组学研究，为生物学和医学领域的发展做出更大的贡献。
dna甲基化测序原理
dna甲基化测序原理DNA甲基化测序原理DNA甲基化测序是一种用于检测DNA分子上甲基化修饰形式的方法。
甲基化是一种常见的DNA化学修饰形式，它可以影响基因的表达和细胞分化过程。
通过测序和分析DNA中的甲基化位点，科学家能够深入研究这种修饰对基因组功能的影响。
甲基化测序的原理基于DNA甲基化位点与未甲基化位点之间的区别。
在DNA分子中，甲基化通常发生在CpG位点（即DNA的Cytosine和Guanine碱基之间的连接点）。
未甲基化的CpG位点在测序中会被处理成TpG位点，而甲基化的CpG位点则保持不变。
甲基化测序通常通过两种方法进行：1. 亚硫酸转换法（Bisulfite Conversion）：该方法通过使用亚硫酸盐将未甲基化的CpG位点转换为尿嘧啶（T），而甲基化的CpG位点则保持不变。
经过亚硫酸转换后的DNA样本可以通过测序技术直接检测出甲基化位点和未甲基化位点的差异。
2. 甲基化特异性切割（Methylation-specific cleavage）：该方法使用甲基化特异性的限制性内切酶来识别甲基化的CpG位点，并在CpG位点附近切割DNA。
未甲基化的CpG位点由于没有甲基化修饰而不被切割。
通过测序这些切割的DNA片段，可以确定DNA分子上的甲基化位点的位置。
甲基化测序技术的发展为研究DNA甲基化在基因组中的分布和功能提供了重要的工具。
科学家可以利用这些技术研究不同细胞类型、病理状态以及环境因素对甲基化模式的影响，以及通过甲基化修饰调控基因表达的机制。
这些研究对于揭示基因组调控和疾病发生机制具有重要意义。
甲基化测序原理
甲基化测序原理甲基化测序是一种用于检测DNA甲基化的方法。
DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰方式，在多种生物过程中发挥重要作用，如基因表达调控、细胞分化、基因组稳定性维持等。
甲基化测序已经成为研究癌症、神经退行性疾病等疾病的重要手段之一。
甲基化测序原理是基于DNA甲基化后所形成的5-甲基脱氧胞嘧啶（5-mC）与未甲基化的脱氧胞嘧啶（dC）在化学和物理性质上的不同之处。
甲基化测序主要分为两种类型：全基因组甲基化测序和目标区域甲基化测序。
全基因组甲基化测序是指将整个基因组的所有区域进行甲基化测序，而目标区域甲基化测序是指仅测序已知某些基因的甲基化状态。
在全基因组甲基化测序中，首先需要将DNA样品进行加样性处理，以消除非特异性结果。
接着通过酶切将整个基因组的DNA进行裂解，然后使用甲基化特异性的抗体来富集甲基化的DNA片段。
然后，将富集后的DNA片段进行二代测序，以获得所有DNA片段的甲基化情况。
在目标区域甲基化测序中，采用PCR扩增或捕获技术，只测序目标区域的甲基化状态。
在PCR扩增的情况下，可以设计特定的引物，使PCR仅扩增目标区域的DNA片段。
在捕获技术中，通常使用探针来捕获目标区域的DNA，然后进行二代测序，以获得目标区域的甲基化情况。
通过这些甲基化测序技术，可以获得DNA甲基化的高分辨率图谱，并进一步了解甲基化在基因表达调控和基因组可塑性等方面的功能和作用。
甲基化测序技术还可以用于诊断和治疗风险评估，以及个体化医疗。
DNA甲基化是一种非常重要的表观遗传修饰方式，甲基化测序技术可以帮助我们更深入地理解甲基化在基因表达调控和基因组可塑性等方面的功能和作用。
随着技术的不断更新和完善，相信甲基化测序技术将会在疾病预防、基因治疗和精准医疗等领域发挥越来越重要的作用。
甲基化测序技术的应用癌症：DNA甲基化调节基因活性，已经成为许多癌症的发病机制之一。
甲基化测序技术已被广泛应用于癌症研究中，以识别癌症相关的甲基化变化，并作为新型癌症治疗的候选靶点。
DNA甲基化检测
Bis预处理 DNA
与原序列做 比对并分析
PCR扩增 测序
DNA纯化与 回收
T/A克隆
不应包含CG二核苷酸 长度在25－30bp较为合适 扩增产物要尽可能的包含较多的CpG位点
F1
F2
R2
R1
利用Taq酶能够在PCR 产物的3’末端加上一 个非模板依赖的A，而 T载体是一种带有3’T
甲基化的概念 甲基化的作用 甲基化检测方法
甲基化在表观遗传学中的意义 甲基化原理
概念： 基因的DNA序列不发生改变的情况下，基因的表达水 平与功能发生改变，并产生可遗传的表型。
表观遗传学的现象（基因表达的调控方式）： ◦ DNA甲基化---最初始的调控方式
◦ 组蛋白修饰 ◦ MicroRNA ◦ Genomic imprinting
哺乳动物中，CpG序列在基因组中出现 的频率仅有1%
健康人基因组中，CpG岛中的CpG位点 通常是处于非甲基化状态，而在CpG岛 外的CpG位点则通常是甲基化的。
在发育和分化中调控基因的表达 转录抑制 特征性表型基因的表达（肤色、毛发） X染色体的失活（X-inactivation ） 基因印记 碱基突变 肿瘤代谢
预处理方法 特异性位点分析
凝胶分析
阵列分析
基于NGS分析
甲基化敏感 • HpaII-PCR 性内切酶
亲和富集 • MeDIP-PCR
• Southern blot • RLGS • MS-AP-PCR • AIMS
• DMH • MCAM • HELP • MethylScope • CHARM • MMASS
不同层次表达调控
RNA碱基机制
组蛋白翻译后修饰
甲基化原理及方法
甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰测序法）基本原理在于：样本经亚硫氢酸盐处理后,甲基化的胞嘧啶（C）保持不变,但非甲基化的胞嘧啶被转化成脲嘧啶,因此在利用该处理产物作为模板的PCR产物中,甲基化的胞嘧啶还是胞嘧啶,但非甲基化胞嘧啶变成了脲嘧啶（胸腺嘧啶）,此时检测到的胞嘧啶（C）即是样品中本身的甲基化位点.第一部分基因组DNA的提取。
DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。
DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。
此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。
因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。
使用两者的细节：1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。
否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。
两者均于-20度保存。
验证提取DNA的纯度的方法有二：1：紫外分光光度计计算OD比值；2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。
我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。
第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。
1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；3：42℃水浴30min；水浴期间配制：4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）5：3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。
这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。
PH一定要准确为5.0。
加520ul至上述水浴后溶液中。
甲基化测序原理
甲基化测序原理甲基化测序是一种广泛应用于DNA研究中的技术，用于检测DNA分子上的甲基化修饰。
甲基化是一种常见的DNA修饰形式，可以对基因表达和染色质结构产生重要影响。
通过了解DNA序列的甲基化状态，人们能够更深入地研究生物学过程以及疾病的发生机制。
甲基化测序的原理是基于DNA序列中C（胞嘧啶）碱基的甲基化状态。
在正常情况下，DNA中的C碱基会被一个甲基分子修饰，形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）。
然而，在一些情况下，这种甲基化修饰可能会发生异常，导致基因沉默或功能改变。
因此，分析DNA分子中的甲基化状态对于理解基因组功能和疾病机制非常重要。
甲基化测序的方法主要分为两种：全基因组甲基化测序和特定位点甲基化测序。
全基因组甲基化测序是指对整个基因组进行甲基化的分析，可以提供全面的甲基化图谱。
特定位点甲基化测序则是选取特定的DNA区域进行检测，可以更加深入地研究某些关键基因或区域的甲基化状态。
甲基化测序的过程首先需要将DNA样本进行处理，包括DNA提取和断裂。
接着，通过特定的化学反应将5-mC转化为甲基化敏感的测序标记物。
然后，使用高通量测序技术对DNA样本进行测序，得到包含甲基化信息的DNA序列。
最后，通过对测序结果进行分析和比对，可以确定DNA序列中每个碱基的甲基化状态。
甲基化测序技术的发展为研究者提供了一个非常有力的工具，可以帮助他们深入了解DNA的甲基化修饰和相关生物学过程。
这种技术在癌症研究、遗传学研究以及表观遗传学研究中具有重要的应用价值。
随着技术的不断进步，甲基化测序将进一步发展，为科学家解开生命奥秘提供更多帮助。
dna甲基化检测方法
DNA甲基化检测方法引言DNA甲基化是一种常见的基因表达调控方式，可以影响基因的转录和表达，以及细胞分化和发育等生物学过程。
因此，对DNA甲基化状态的准确检测和分析对于理解疾病发生发展机制以及预防和治疗疾病具有重要意义。
本文将介绍几种常用的DNA甲基化检测方法，并对它们的原理和应用进行详细描述。
1. 甲基化特异性PCR（MSP）甲基化特异性PCR（Methylation Specific PCR，MSP）是一种经典的DNA甲基化检测方法。
该方法通过特殊的PCR反应体系和引物设计，可以区分甲基化和非甲基化的DNA序列。
具体步骤如下：•DNA提取：从待测样品中提取DNA。
•甲基化处理：对DNA进行化学甲基化处理，使甲基化的嵌合基对应DNA序列得以保留，非甲基化的嵌合基对应DNA序列则被转化为不同的碱基。
•PCR反应：使用特异性引物对甲基化和非甲基化的DNA片段进行扩增。
•电泳分析：将PCR产物进行凝胶电泳分析，根据PCR产物的大小和形态进行甲基化状态的判断。
MSP方法具有操作简便、快速、经济等优点，已广泛应用于DNA甲基化的研究和临床诊断中。
2. 甲基化敏感限制性内切酶PCR（MSRE-PCR）甲基化敏感限制性内切酶PCR（Methylation Sensitive Restriction Enzyme-PCR，MSRE-PCR）是一种基于限制性内切酶的DNA甲基化检测方法。
该方法利用甲基化敏感的限制性内切酶和非甲基化敏感的限制性内切酶对DNA进行切割，然后通过PCR扩增来检测DNA甲基化状态。
步骤如下：•DNA提取：从待测样品中提取DNA。
•限制性内切酶切割：使用甲基化敏感和非甲基化敏感的限制性内切酶对DNA进行切割，甲基化酶切割后产生线性DNA片段，非甲基化酶切割后产生环状DNA片段。
•PCR反应：对内切酶切割后的DNA片段进行PCR扩增。
•电泳分析：将PCR产物进行凝胶电泳分析，根据不同大小的PCR产物来判断DNA的甲基化状态。
甲基化检测原理
甲基化检测原理
甲基化检测是一种用于研究DNA甲基化状态的技术。
DNA甲基化是一种重要的表观遗传学修饰方式，通过在DNA分子中加入一个甲基基团来调节基因的表达。
因此，甲基化检测对于研究基因表达和疾病的发生机制具有重要的意义。
甲基化检测的原理通常基于DNA甲基化与非甲基化区域的化学或物理性质的不同，利用这些差异来区分甲基化和非甲基化的DNA序列。
其中最常用的甲基化检测方法包括甲基化特异性PCR（MSP）、限制性内切酶消化（MSRE）、甲基化敏感性高分辨率毛细管电泳（MCE）等。
甲基化特异性PCR（MSP）是一种基于PCR扩增的方法，它利用甲基化的DNA序列和非甲基化的DNA序列在酶切后长度不同的特点实现检测。
MSRE是一种利用限制酶切割甲基化和非甲基化DNA序列的方法。
甲基化敏感性高分辨率毛细管电泳（MCE）是一种高效的甲基化检测方法，它可以通过检测DNA序列中的单个碱基来区分甲基化和非甲基化的DNA序列。
总之，甲基化检测是一种重要的技术，可以帮助我们深入了解基因表达和疾病的发生机制，同时促进了临床诊断和治疗方法的发展。
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DNA亚硫酸氢盐修饰和纯化操作步骤修饰设计：使用CpGenome TM kit使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤如下。
中等温度碱性pH 下使DNA变性成为单链形式暴露出碱基。
试剂一，一种包含亚硫酸氢根的钠盐，可使未甲基化的胞嘧啶磺化和水解脱氨，产生一种尿嘧啶磺酸盐中间产物。
然后DNA在另一种盐﹙试剂二﹚存在的条件下与一种微粒载体﹙试剂三﹚结合，并通过重复离心和在70%的乙醇中重悬浮脱盐。
向尿嘧啶的转化是通过在90%的乙醇中反复碱性脱磺酸基作用和脱盐完成的。
DNA最终在TE缓冲液中通过加热从载体上洗脱下来。
第一步：试剂准备
（1）3 M NaOH原料（用前现配）
把1g干NaOH片剂溶解在8.3mL水中。
使用此类腐蚀性碱，注意小心谨慎和实验操作。
（2）20 mM NaOH/90% EtOH（用前现配）
配制1mL该溶液需：900μl 100%的乙醇，93.4μl水，6.6μl 3M的氢氧化钠。
（3）溶解试剂Ⅰ（用前现配）
打开前将试剂瓶加温至室温。
对每份待修饰的样本，称取0.227g DNA修饰试剂Ⅰ加入0.571mL水中。
充分涡旋振荡混合。
使用该试剂时要小心谨慎，因为它对呼吸系统和皮肤有刺激性。
用大约20μl 3M NaOH调整pH至5.0，用pH试纸检测pH值。
试剂Ⅰ避光保存以免分解。
为了最佳效果，试剂应在配置后立即使用。
（4）溶解试剂Ⅱ
打开前将试剂瓶加温至室温。
将1μl β-巯基乙醇加入20mL去离子水中。
每份待修饰的DNA样本需将750μl该溶液加入到1.35g DNA修饰Ⅱ。
充分混合确保完全溶解。
过量的试剂可用箔纸包裹的容器、2℃-8℃、避光保存长达6周。
第二步：DNA修饰程序
1、在带有螺旋形瓶盖的1.5-2.0mL的微量离心管中：将7.0μl 3M NaOH加入到含有1.0 μg DNA的100μl水中（10ng/μl），混匀。
注意：如果样本含有的DNA量不到1.0μg，就向样本DNA中加入2 μl DNA修饰试剂Ⅳ并加水至总体积100μl。
再加入7.0μl 3M NaOH并混匀。
2、50℃ DNA孵育10分钟（加热块或水浴）
3、加入550 μl新鲜配制的DNA修饰试剂Ⅰ并涡旋振荡。
4、加热块或水浴50℃避光孵育4-16小时。
第三步：初步脱盐
1、强力涡旋振荡悬浮DNA修饰Ⅲ。
用10x的1mL塑料移液管枪头来回吸排悬液以分散仍存在的凝块。
2、向含DNA溶液的管中加入5μl充分悬浮的DNA修饰试剂Ⅲ。
3、加入750μl DNA修饰试剂Ⅱ并充分混匀。
4、室温孵育5-10分钟。
5、5000 X g离心10秒使DNA试剂Ⅲ成颗粒状。
（应出现一种白色的小颗粒。
）弃去上清。
6、加入1.0mL 70%的乙醇，涡旋振荡，5000 X g离心10秒，弃去上清。
该步骤重复进行，共3次。
7、将第三次上清弃去后，离心管高速离心2分钟，用塑料移液管枪头移去剩余上清。
第四步：完成DNA修饰（脱磺酸基作用），再次脱盐，并洗脱。
1、适量样本加入50μl 20 mM NaOH/90% EtOH溶液。
2、充分涡旋振荡悬浮颗粒，再室温孵育5分钟。
3、5000 X g离心以移除管顶所有成分。
加入1.0mL 90%的乙醇并涡旋振荡洗脱颗粒。
再旋转，除去上清。
再次重复该步骤。
4、第二次洗脱除去上清后，高速离心样本3分钟。
5、用塑料移液管头除去所有剩余上清。
试管室温晾干10-20分钟（必须除去酒精气味）。
6、加入TE缓冲液。
注意：加入TE的量取决于起始DNA的量和目的用途所需的加入浓度。
例如，如果加入25μl TE，基于完全恢复1μg DNA的最终浓度应为40ng/μl。
快速强力涡旋振荡直到颗粒完全悬浮。
用手轻打或轻敲内容物至管顶（但是不要离心）。
7、50-60℃下样本孵育15分钟以洗脱DNA。
8、高速离心2-3分钟并用塑料移液管头转移样本（上清）到新管。
9、进行MSP或测序，或-15～-25℃可保存达2个月，-80℃可保存6个月。
避免重复融化和解冻；可分量储存。
不要将DNA存储在自动除霜冰箱。
10、当从一管中转移已解冻的DNA以备用时，避免将试剂Ⅲ转移到PCR反应管中。
通常首先将管充分离心，使残留的试剂Ⅲ固体成颗粒状。
三、MSP
（1）引物合成
运用特别设计的针对甲基化和非甲基化序列的引物，引物由上海生物工程有限公司合成。
见
表1
表1 甲基化引物序列及扩增条件
hMLH1引物引物序列(5’～3’)产物长度温度甲基化(M) 正义ACGTAGACGTTTTATTAGGGTCGC 115 bp 55℃甲基化(M) 反义CCTCATCGTAACTACCCGCG 115 bp 55℃非甲基化(U) 正义TTTTGATGTAGATGTTTTATTAGGGTTGT 124 bp 55℃非甲基化(U) 反义ACCACCTCATCATAACTACCCACA 124 bp 55℃（2）PCR反应条件
a 反应体系：10×PCR缓冲液5μl，2.5mmol/LdNTP4μl，甲基化上下游引物和去甲基化
上下游引物分别为1μl，甲基化模板DNA5μl，Taq酶0.25μl，加水至总体积50μl。
b 循环条件：
共35个循环
（3）PCR产物结果判定：琼脂糖凝胶电泳
a 甲基化阳性：甲基化特异性引物扩增出相应长度的片断，但非甲基化特异性引物未
扩增出相应长度的片断，则判断基因启动子区5’CpG岛甲基化阳性。
b 甲基化阴性：非甲基化特异性引物扩增出相应长度的片断，但甲基化特异性引物未扩增出相应长度的片断。
则判断基因启动子区5’CpG岛甲基化阴性。