发光细菌法测生物毒性
毒性试验整理
实验一发光细菌的急性毒性评价试验一、实验器材1.菌株明亮发光杆菌（Photobacterium phosphoreum）2.培养基酵母膏0.5%，胰蛋白胨或多聚蛋白胨（Polypetone）0.5%，甘油0.3%，NaCl 3%，Na2HPO4 0.5%, KH2PO4 0.1%，pH6.5。
固体培养基再加琼脂2%。
3.溶液、试剂及待测物质酵母粉，蛋白胨，NaCl（AR），Na2HPO4（AR），KH2PO4（AR），甘油（AR），二甲基亚砜（AR），乙酸乙酯（AR），HCl（1M），去离子水。
4.仪器及其他用品生物毒性测试仪；电热恒温鼓风干燥箱；振荡培养箱；DELTA 320pH计；氮吹仪；镊子，移液枪，三角锥形瓶等。
二、目的要求1.学习了解发光细菌的急性毒性评价试验的基本原理。
2.掌握发光细菌的急性毒性评价试验的操作要领和评价方法。
三、基本原理发光细菌是指在正常的生理条件下能够发射肉眼可见的蓝绿色荧光的细菌，这种可见荧光波长在450-490 nm之间，在黑暗处肉眼可见。
不同种类发光细菌的发光机理是相同的，都是由特异性的荧光酶(LE)，还原性的黄素(FMNH2)，八碳以上长链脂肪醛(RCHO)，氧分子(O2)所参与的复杂反应，大致历程如下：FMNH2+LE→FMNH2·LE+O2→LE·FMNH2·O2+RCH→LE·FMNH2·O2·RCHO→LE+FMN+ H2O+RCOOH+光具体来说，生物发光反应由分子氧作用，胞内荧光酶催化，将还原态的黄素单核苷酸(FMNH2)及长链脂肪醛氧化为FMN及长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度在波长为407-409 nm处的蓝绿光。
发光细菌法是利用灵敏的光电测量系统测定毒物对发光细菌发光强度的影响。
发光细菌含有荧光素、荧光酶、ATP等发光要素，在有氧条件下通过细胞内生化反应而产生微弱荧光。
当细胞活性升高，处于积极分裂状态时，其ATP含量高，发光强度增强。
发光细菌法测定有机污染土壤的生物毒性
Ｄ Ｙ一 Ｘ ２型生物 毒性测试仪 （ 中国科学 院南京
土壤 研究 所 ） 。
生物毒性测定仪。相对 于传统 的毒物检 测方法如 Ａ ｓ ， 方法 具有灵 敏 、 ｍｅ 等 该 快速 、 成本 低 等优 点 。 国 内也研制出相关的仪器并制定 了相应 的国家标准。 近年来该方法 已成功应用于某些污染水体和土壤的 生 物毒性 评价 上 Ｊ 。在利用 发光 细菌 对 环境 样 本 进 行生 物毒性 评 价分 析 时 ， 往 采用 样 品 的水 浸 提 往 液或稀释液。由于在 自然环境 中存在的大量有机污 染 物为非 极性 物质 ， 水溶 性差 ， 因此 其水 浸提 液或 稀 江苏Βιβλιοθήκη 业科学２０ ０ ８年第 ５期
－— ２ ５ ．— － ８ － — — － —
发光 细菌法测定有机污染土壤 的生物毒性
吴 向 华
（ 京晓庄 学院生命科学 系， 南 江苏南京 ２ １７ ） １ １ １
摘要 ： 在研究发光细 菌培养 方法 、 同有机溶剂对土壤 中有机毒 物提 取效率 、 不 土壤有机 毒物对发光 细菌 的生 物毒性基础上 ， 用发光细菌法测定 了不同来源石油污染土壤 的生物毒性 。结果表 明 ， 利 发光细菌 的发光强度 与污 染土壤的 Ｄ Ｍ Ｄ Ｏ提取 液浓度呈负相关 ， Ｃ ／ ＭＳ 但土壤 的生物毒性与其 中的污染 石油含量并 不成对应关系 。 关键词 ：土壤 ； 有机污染 ；生物 毒性 ； 测定 ；发光细菌法
释液 往往 不能 完全反 映环 境样 品 的生物 毒性 。尽 管 很多 有机溶 剂 对土壤 中有 机污 染物 具有 很好 的提 取 效果 ， 但是 大多数 有 机 溶 剂本 身对 发 光 细 菌 也具 有 较强 的生物 毒性 ， 很 大 程 度 上 限制 了发 光 细 菌 在 在 环境生 物毒 性检 测上 的应用 。本 研究 首先 筛选 对有 机污染 物具 有较 强浸 提 效 率 、 对 发 光 细 菌无 毒 或 但
DB44T 1946-2016 生物毒性水质自动在线监测仪技术要求 发光细菌法.pdf
2016-12-02 发布
2017-03-02 实施
广东省环境保护厅
发布
广东省质量技术监督局
DB44/ T 1946—2016
目次
前 言 .............................................................................. II 1 适用范围 ........................................................................... 1 2 规范性引用文件 ..................................................................... 1 3 术语和定义 ......................................................................... 1 4 仪器组成、测量原理、测量指标及范围 ................................................. 2 5 性能指标及测量方法 ................................................................. 3 6 技术要求 ........................................................................... 5 7 操作说明书 ......................................................................... 6
HJ/T 212
污染源在线自动监控（监测）系统数据传输标准
生物毒性检测技术在农产品检测中的应用研究
Ｋｅ ｒ ｓ ａ ｒ ｕｔｒｌｐ ｏ ｕ ｔ ｓｆｔ ； ｈ ｔｂ ｃｅ ａ ｔｘｃ ； ｅｅｔ ｎ ｔ ｈ ｏｏ ｙ ｙ ｗｏ ｄ ： ｇｉ ｌ ａ ｒｄ ｃｓ ａｅ ｐ ｏｏ ａ ｔｒ ； ｏ ｉｉ ｄ ｔｃ ｏ ｅ ｎ ｌｇ ｃ ｕ ｙ ｉ ｙ ｔ ｉ ｃ
ｌ 生 物 毒 性 检 测 技 术 概 述
结果表明 ： 品 中毒性物质 的浓度 与发光细 菌的相对发 光度 呈现较好的 负相 关性 ， 光细 菌生物 毒性检测 法可 样 发
以作为一种快速的毒性 筛查技 术应用于农产品安全检 测。
关键 词 ： 农产品安全； 发光细菌； 毒性 ； 检测技术
Ａｐ ｌ ａ ｉ ｎ ｏ ｏ ｔ ｘ ｃｔ ｔ ｒ ｉ ａ ｉ ｎ ｉ ｒｃ ｌｕ ａ ｏ ｕ ｔ ｐ ｉ ｔ ｆＢｉ － ｏ ｉｉｙ Ｄｅ ｅ ｍ ｎ ｔ ｎ Ａｇ ｉｕ ｔ ｒ ｌ ｃ ｏ ｏ Ｐｒ ｄ ｃｓ
收 稿 日期 ： ０ １０ ．７ ２ １ －３ ２
光 细 菌 的急 性 毒 性 ， 结果 表明 ， 性 染 料 、 原 性 碱 还
文献标识码 ： Ａ
生 毒 检 技 在 产 检 中应 研 物 性测术农 品测 的用究
卢 俊 荣
（． １ 莆田市质量技术监督局 ，福建 莆田 ３ １０ ； ５ １ ０
２ 莆田市工业产品生产许 可证 审查技 术 中心 ，福 建 莆 田 ３ １０ ． ５ １０）
摘 要 ： 应用发光细菌生物毒性检测技术对农产品的小白菜样品、 罗非鱼样品和大米样品进行生物毒性检测，
性 ， 有毒 物 浓度 越 大 ， 光细 菌 发 光越 弱 或 者 凋 即 发
亡 。所 以 ， 用生物 发 光测 定仪 器检 测发 光 细菌 接 触
毒性 物 质 时 的光 强变 化 ，就可 以推 算 出综 合 毒性
发光细菌法检测水土环境毒性的进展和评价分析
发光细菌法检测水土环境毒性的进展和评价分析摘要：发光细菌法是一种快速、灵敏的生物测试方法，被人们广泛应用在水土环境毒性测试工作中，取得了理想的成绩。
文章在阐述发光细菌法测定原理的基础上，就发光细菌法在水土环境毒性测定中的应用问题进行探究。
关键词：发光细菌法；水土环境；毒性；检测在现代工业的快速发展下，金属开始通过各个途径进入到土壤、水文、大气等生态系统中，这个期间会对系统中的生物体产生不良反应，进而使得整个生态系统遭受到破坏。
为了能够确保工业发展的安全有效，需要相关人员按照规范的标准研究金属生物毒性以及其在生态系统中的潜在危害。
生物毒性是指生物体在毒物的作用下所产生的不良效应，为了能够更为精准的把握这种反应，可以借助生物测试方法，比如发光细菌法来测试生物体中的毒性。
一、发光细菌法的测定原理生物发光是一种普遍的自然现象，在自然环境中，可见光的生物有发光细菌、真菌、放射虫类等。
发光是发光细菌的一种生理过程，在分子氧作用、细胞内荧光酶催化作用下会将还原态的黄素单核苷酸和长链脂肪醛氧化为黄素单核苷酸和长链脂肪酸。
在发生化学反应之后还会释放出波长在450nm到490nm的蓝绿光。
从实际发展情况来看，发光过程很容易受到外界环境的影响，这个期间，能够干扰或者损害细菌呼吸、生理过程的任何因素都会使得细菌的发光强度出现变化。
在有毒有害物质和发光细菌出现接触的时候，发光强度会出现变化，且随着毒性物质浓度的增加，发光也会日渐减弱。
基于这个特点，可以利用发光细菌作为指示微生物，将发光强度的变化作为重要参考指标，在此基础上深入测定环境中有毒有害物质的生物毒性，从而帮助相关人员全面的了解环境中的污染物质。
二、发光细菌法检测水土环境毒性检测使用发光细菌进行毒性测试可以从以下几个方面进行：第一，利用野生型发光细菌来开展毒性测试，细菌发光强度和毒性物质的浓度会呈现出一种反比的关系。
在具体测试分析中会通过发光抑制率来体现水土环境中的毒性大小。
生物发光毒性测试分析.pdf
生物发光毒性测试分析毒性是一项综合的生物学参数，它是衡量样品对活性生物体所产生的影响，不能以化学分析的方法进行测定，一些生物测试方法如鱼类试验、浮游动物试验、藻类试验等则较为复杂，且必须使用高等生物进行试验，从而引起众多的争议。
发光细菌测试使用了具有发光特性的天然或人工遗传改造的微生物，这一方法经研究被证实具有快速、简便的特点，同时有很好的灵敏度和可靠性，发光细菌本身又没有危害性。
发光细菌试验已成为环境样品毒性检测的生物测试技术，被列入了我国国家标准GB/T 15441-1995，德国国家标准(DIN38412)和国际标准(ISO11348)。
发光细菌毒性测试方法是一个我国国家标准和ISO标准认证的，运用发光细菌Vibrio fischeri进行急性毒理测试。
发光细菌闪烁测试（flash test）是一个改良的方法用于测试含有固体和有色的样品。
上述两个系统包括化学发光检测仪（闪烁测试系统的发光仪必需有自动样品注射器），软件程序，试剂冷却/孵育器和冷冻干粉状态的测试用发光细菌。
生物重金属试剂盒是一个革命性地用于分析环境中少量样品的方法。
这些细菌能够特异性地感受到某种特定金属的存在，如来自固体和液体样品中ppb水平的铅、汞、砷和镉。
发光终点测试方法具有很高的灵敏度，快速和高通量进行。
发光细菌毒性测试此方法是传统和标准的通过发光细菌方法来测试化合物或污水的毒性（GB/T 15441-1995，ISO 113483: 水质）测定水样对Vibrio fischeri <发光细菌测试>的光发射抑制效果。
这个测试方法是建立在此基础之上的――当有毒性的化合物存在时，细菌的发光量会降低。
这个方法非常快速，只需要5－30分钟就可以完成。
标准发光细菌的测试过程是：把样品和细菌混合在一起，经过短暂的孵育，测试发光强度。
检测仪器只需要化学发光仪（如Berthold Detection Systems管式或板式化学发光仪)。
发光菌的生物毒性测试方法
发光菌的生物毒性测ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 方法
实验原理
1 发光菌的发光机理 细菌生物发光反应是由分子氧作用，胞内荧光酶催化， 将还原态的黄素单核苷酸(FMNH2)及长链脂肪醛氧化为 FMN 及长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度在波长 为450-490nm处的蓝绿光。 2 实验原理 当发光细菌接触有毒污染物时,细菌新陈代谢则受到影 响,发光强度减弱或熄灭,发光细菌发光强度变化可用发 光检测仪测定出来。在一定浓度范围内,有毒物浓度大 小与发光细菌光强度变化成一定比例关系,因此可通过 发光细菌来监测环境中的有毒污染物。发光细菌应用最 多的是明亮发光杆菌,可以监测各种水体,对气体中可溶 性有毒物质,可先通过吸收、溶解在溶液中,再来观察其 对发光细菌的影响。
结果与数据处理
1 相对发光度的平均值
相对发光度（%）=Hgcl2管或样品管发光量/CK管发光量 再求相对发光度平均值 2 建立并检验HgCl2浓度与其相对发光度均值的相关关系 先求出线性回归方程，再在一定的P值条件下查表进行r检测， 验证相关方程成立，然后做出两者的关系曲线，按照同样的方 法检测样品浓度与其相对发光度均值的相关性。
4仪器检验复苏发光细菌冻干粉质量3细菌冻干菌剂复苏1仪器的预热15min和调零2试管排列和滴加3nacl及样液取出含有05g发光细菌冻干粉的安瓿瓶和nacl溶液将安瓿瓶置于含有冰块的保温瓶中注入nacl溶液混匀2min后菌即复苏发光取2ml测试管加2mlnacl3溶液10l复苏发光菌液颠倒摇匀测试发光量倍率调至x2发光量高于600mv此冻干粉可用5给各测试液加复苏菌液发光菌液复苏满15min用10l微量注射器准确吸取10l复苏菌液逐一加入各管摇匀精确计时记录到秒6读数拔出样品室的盖子红指示灯亮将待测样品液比色管放入盖好盖子抓住盖子顺时针旋转此时只绿指示灯亮约12s读数抓住盖子顺时针旋转至原处只红指示灯亮向上拔出盖子取出样品
发光菌在环境毒性检测中的应用
进行监测。利用发光菌对污水处理厂的进出水进行持续监测表 明， 经处理 过后的水质毒性有了明显的降低， 还 发现初级沉淀不能有效 的降低污水 的 毒性， 而毒性的去除主要是在生物处理 阶段 。 除此之外 ， 发光菌还能够评估 化合物的毒性并探 讨毒性指标和 化学指标 的联 系。
３ ． ２发 光 菌 应 用 于 大 气 污 染 毒 性 的 监 测 利用发光菌进行大气污染监测早期出现在四 ｆ 一 年 代。 将 火 力 发 电厂 排
概括如下 ： 细 菌中的黄素单核苷酸在细菌荧光酶 的催化 下发生氧化反应而 放 出光子 ， 从而发 出荧光 。 一般此 荧光 的波长 范围在 ４ ２ ０ — ６ ７ ０ ｎ ｍ， 最大 的发
射波长为 ４ ９ ０ ｎ ｍ， 因此 发 光 菌 发 出的 光 呈 现 蓝 绿 色 。这 个 过程 可 以用 以 Ｆ 反应 式 表 示 ： Ｆ ＭＮＨ２ ＋ Ｏ２ ＋ ＲＣＨＯ 细 菌 荧 光 酶 ＲｃｏｏＨ＋ Ｆ Ｍ Ｎ＋ Ｈ２ ０＋ｈ
３ ． ３发光 菌 用 于 土 壤 污 染 毒 性 的监 测 目前 ， 由于大量农药的使用， 我 国各 地 土 壤 都 受 到 了不 同程 度 的 污 染 ， 危 害 十 分 严 重 。因此 近 些 年 有 人 对 发 光 菌 用 于 七壤 污 染 毒 性 监 测 做 了相 关 研 究 。 通 过 将 土 壤 中 的 毒 性 物 质抽 提 到 水 溶 液 中， 再 用 发 光 细 菌进 行 监 测
科 学研 究
礴湾
发光菌在环境毒性检测 中的应用
潘 涛 朱小亮 王 海 燕
（ 江苏新源水 务有限公司 ２ ２ ３ ８ ０ ９ ） 摘 要： 发光细菌法在环境毒性检测 中是一种快速 、 灵敏 、 低成本 的生物检 测方法 ， 受 到人们 的』 泛 重视。本文就发光菌的形态、 生理 、 生态 以及应用 原理 等进 行 了简述 ， 并对发光菌在环境毒性检测中的应用进行 了概述 。 关键 词 ： 发光菌 ； 环境污染 ； 毒 性 监 测
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主要任务
1.对常用钻井液材料进行生物毒性分析，遴选出符合环保要求的材料。
2.通过进行生物毒性分析，对不符合环保要求的钻井液材料，如果是必备材
料而且目前又找不到相同功能的替代品，则研制新型的符合环保要求的替代品材料。
3.在遴选出的钻井液材料中，择优选用价格性能比较好的材料，通过室内钻
井液性能综合试验研究，研制出一种钻井液性能优良，能保证钻探施工顺
利进行，符合环境保护要求的新型钻井液体系。
4.现场试验两口井，通过实践检验其钻井液综合性能，整理试验数据，编写
研究报告。
一、完成了符合环保要求的钻井液材料的遴选
1．生物毒性测定方法的选择
（1）糠虾生物试验法
（2）微毒性分析法
（3）发光细菌法
通过对发光细菌法与糠虾法试验结果对比，我们发现发光细菌法的EC50值与糠虾生物试验法的LC50值之间具有一定的相关性：EC50值总是小于LC50值，实验结果见表1。
这说明相同数值的EC50值和LC50值相比，EC50值比LC50值对环境的毒性污染更小，更安全可靠。
表1 四种钻井液体系的EC 50值与LC 50值比较
因此本项目采用发光细菌法，测定钻井液单剂及体系的生物毒性，用EC50(相对发光率50%时)来表征被测物的生物毒性，
EC50值越大，表明被测物的生物毒性越小；EC50值越小，表明被测物的生物毒性越大。
我们参照糠虾法的排放标准，以EC50＞30000ppm 作为钻井液单剂及体系允许排放的标准。
并参照糠虾生物毒性试验法的生物毒性分级标准，将生物毒性等级划分为六个等级(表2)，以此作为本项目的环境可接受性评价方法和标准。
表2 生物毒性等级分类
2．常用钻井液材料的生物毒性评价
按发光细菌法对常用钻井液材料进行毒性评价，结果见表3
表3 常用钻井液材料生物毒性结果
二、完成环保型高效润滑剂的研制和应用
在地质调查金刚石取心钻探中，因转速较高，要求钻井液具有良好的润滑性；在石油天然气钻探中，定向井、水平井和深井所占的比例日益增加，钻井液的润滑性成为关键指标之一，因此，钻井液用润滑剂成为一种重要的常用的钻井液材料，其市场需求量日益增加，在钻井液化学处理剂中呈大幅度增长趋势，而目前的润滑剂仍在使用有毒性的矿物油材料（如柴油等）作基础原料，必然会被日益严格的环境保护要求所限制。
本项目由于经费有限，把研制新型处理剂的重点放
在环保型钻井液用润滑剂的研制。
完成了室内研制、中试及现场应用。
环保型润滑剂（Glub）以天然植物油为原料，经中高温（130℃-180℃）化学改性，提高其抗温抗盐能力后，再在中低温（70℃-90℃）条件下，进行乳化，使其适度水，能均匀地分散于水中，与水融后成一体。
合成技术路线见图1。
（1）环保型钻井液用润滑剂（Glub）合成技术路线
（2）环保型钻井液用润滑剂（Glub）室内性能评价
环保型润滑剂（Glub）性能检测：
按中国石油天然气行业标准SY/T5662-94《钻井液用极压润滑剂试验方法》对Glub的润滑性能进行检测。
选用二种钻井液作为基浆，测试在基浆中加入Glub 后摩擦系数降低率和相对扭矩降低率。
这二种钻井液为人工钠土基浆、聚合物泥浆。
<1>人工钠土基浆中加入Glub后润滑性能改善情况
人工钠土基浆配制：水+6%Nv-1人工钠土测试结果见表4。
表4 人工钠土基浆加入Glub润滑效果
<2>聚合物泥浆中加入Glub后润滑性能改善情况
聚合物碌配制：水+6%Nv-1人工钠土+0.1PAA（聚丙烯酸钠盐）测试结果见表5。
表5 聚合物泥浆加入Glub润滑效果
测试结果表明：Glub具有很好的润滑性能，能显著降低泥浆的摩擦系数和扭矩，满足钻探要求。
（3）环保型钻井液用润滑剂（Glub）的作用机理
Glub均匀地分散于钻井液中，钻进时，在孔壁或钻杆周围形成一层薄的油膜，油膜具有很高的极压强度，极大地降低钻杆与孔壁间的摩擦系数，从而降低钻杆的扭矩，减少动力消耗，同时有效防止钻杆粘附在孔壁上造成粘附卡钻，确保钻探施工的安全顺利进行。
（4）环保型钻井液用润滑剂的现场应用
∙环保型润滑剂（Glub）中试成功后，已分别在大陆科钻、联合国西藏地热定向钻探项目、江苏油气钻探和海洋油气钻探中使用，效果显著，受到用户的好评。
∙在大陆科钻中，使用Glub后，钻井液的润滑性能大幅度改善，显著改善钻具的使用工况，提高钻具的工作效率，统计结果表明：使用Glub润滑剂后，平均回次长度由3.89 m增至7.28 m，平均机械钻速由0.91m/h增至1.33m/h，岩心采取率由85.6%增至97.41%，日进尺由6.4m/day增至m/day，而且不影响测井，不污染岩心，可见优良的润滑剂明显提高钻进效率，降低钻探成本。