发光菌的生物毒性测试方法
发光细菌实验
发光细菌毒性试验实验方案邱琳3090103476 于晓晴3090101007一、实验目的1、了解发光细菌毒性试验的基本原理；2、学习应用发光细菌毒性试验检测被测毒物毒性的方法；3、检测不同品牌及防晒系数防晒霜的毒性大小及其浓度与发光细菌发光强度的关系。
二、实验原理1、明亮发光杆菌T3小种具有发光能力，其发光反应如下：FMNH2+O2+R-CO-H→FMN+R-COOH+H2O+Light 其发光要素是活体细胞内的荧光素（FMN）、长链醛和荧光酶。
在遇到有毒物质时，发光细菌的发光能力减弱，衰减程度与有毒物质的毒性和浓度才成一定的比例关系。
通过灵敏的光电测定装置，可检查发光细菌受毒物作用时发光强度的变化，进而度量被测物毒性的大小。
2. 防晒霜是通过无机或有机活性成分起防晒作用的。
无机防晒成分通常是氧化锌、氧化钛等无机物，它们可以反射和散射紫外线辐射；有机防晒成分通常是OMC(octyl methoxycinnamate )、羟苯并唑(oxybenzone)，它们可以吸收紫外线辐射，把辐射能量转化成热能。
许多防晒霜同时保护皮肤不受到两种紫外线(UVA,UVB)的伤害。
UVA和UVB对皮肤会造成不同的伤害。
从另外一个角度说：通过对光的反射和吸收两种机制起作用。
一般无机物是反射作用，有机物是吸收作用。
最常见的紫外线化学吸收物质是PABA(对氨基苯甲酸，para-aminobenzoic acid)，PABA吸收UVB。
（注意：如果您的皮肤敏感，应该谨慎使用含有PABA的防晒剂，因为PABA容易导致敏感肌肤发红和过敏。
）其它的吸收紫外线的有机物还有：肉桂酸(Cinnamates)，吸收UVB；苯甲酮类(Benzophenones)，吸收UVA；临氨基苯甲酸或脂(Anthranilates)，同时吸收UVA和UVB。
3、进行不同品牌或不同防晒系数防晒霜毒性的测定，对其浓度与毒性的关系进行探究，并绘制不同浓度毒物与发光细菌相对发光强度的关系图。
生物发光毒性测试分析.pdf
生物发光毒性测试分析毒性是一项综合的生物学参数，它是衡量样品对活性生物体所产生的影响，不能以化学分析的方法进行测定，一些生物测试方法如鱼类试验、浮游动物试验、藻类试验等则较为复杂，且必须使用高等生物进行试验，从而引起众多的争议。
发光细菌测试使用了具有发光特性的天然或人工遗传改造的微生物，这一方法经研究被证实具有快速、简便的特点，同时有很好的灵敏度和可靠性，发光细菌本身又没有危害性。
发光细菌试验已成为环境样品毒性检测的生物测试技术，被列入了我国国家标准GB/T 15441-1995，德国国家标准(DIN38412)和国际标准(ISO11348)。
发光细菌毒性测试方法是一个我国国家标准和ISO标准认证的，运用发光细菌Vibrio fischeri进行急性毒理测试。
发光细菌闪烁测试（flash test）是一个改良的方法用于测试含有固体和有色的样品。
上述两个系统包括化学发光检测仪（闪烁测试系统的发光仪必需有自动样品注射器），软件程序，试剂冷却/孵育器和冷冻干粉状态的测试用发光细菌。
生物重金属试剂盒是一个革命性地用于分析环境中少量样品的方法。
这些细菌能够特异性地感受到某种特定金属的存在，如来自固体和液体样品中ppb水平的铅、汞、砷和镉。
发光终点测试方法具有很高的灵敏度，快速和高通量进行。
发光细菌毒性测试此方法是传统和标准的通过发光细菌方法来测试化合物或污水的毒性（GB/T 15441-1995，ISO 113483: 水质）测定水样对Vibrio fischeri <发光细菌测试>的光发射抑制效果。
这个测试方法是建立在此基础之上的――当有毒性的化合物存在时，细菌的发光量会降低。
这个方法非常快速，只需要5－30分钟就可以完成。
标准发光细菌的测试过程是：把样品和细菌混合在一起，经过短暂的孵育，测试发光强度。
检测仪器只需要化学发光仪（如Berthold Detection Systems管式或板式化学发光仪)。
发光菌的生物毒性测试方法
发光菌的生物毒性测ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 方法
实验原理
1 发光菌的发光机理 细菌生物发光反应是由分子氧作用，胞内荧光酶催化， 将还原态的黄素单核苷酸(FMNH2)及长链脂肪醛氧化为 FMN 及长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度在波长 为450-490nm处的蓝绿光。 2 实验原理 当发光细菌接触有毒污染物时,细菌新陈代谢则受到影 响,发光强度减弱或熄灭,发光细菌发光强度变化可用发 光检测仪测定出来。在一定浓度范围内,有毒物浓度大 小与发光细菌光强度变化成一定比例关系,因此可通过 发光细菌来监测环境中的有毒污染物。发光细菌应用最 多的是明亮发光杆菌,可以监测各种水体,对气体中可溶 性有毒物质,可先通过吸收、溶解在溶液中,再来观察其 对发光细菌的影响。
结果与数据处理
1 相对发光度的平均值
相对发光度（%）=Hgcl2管或样品管发光量/CK管发光量 再求相对发光度平均值 2 建立并检验HgCl2浓度与其相对发光度均值的相关关系 先求出线性回归方程，再在一定的P值条件下查表进行r检测， 验证相关方程成立，然后做出两者的关系曲线，按照同样的方 法检测样品浓度与其相对发光度均值的相关性。
4仪器检验复苏发光细菌冻干粉质量3细菌冻干菌剂复苏1仪器的预热15min和调零2试管排列和滴加3nacl及样液取出含有05g发光细菌冻干粉的安瓿瓶和nacl溶液将安瓿瓶置于含有冰块的保温瓶中注入nacl溶液混匀2min后菌即复苏发光取2ml测试管加2mlnacl3溶液10l复苏发光菌液颠倒摇匀测试发光量倍率调至x2发光量高于600mv此冻干粉可用5给各测试液加复苏菌液发光菌液复苏满15min用10l微量注射器准确吸取10l复苏菌液逐一加入各管摇匀精确计时记录到秒6读数拔出样品室的盖子红指示灯亮将待测样品液比色管放入盖好盖子抓住盖子顺时针旋转此时只绿指示灯亮约12s读数抓住盖子顺时针旋转至原处只红指示灯亮向上拔出盖子取出样品
发光细菌法急性毒性的测定
发光细菌法急性毒性的测定大连理工大学环境与生命学院1978年美国Beckman 公司即推出功能完备的生物发光光度计“Microtox”，自此，这一急性毒性测试技术在世界范围内迅速推广。
因此人们也将发光菌毒性测试称为Microtox 测试。
简介发光菌毒性测试是20世纪70年代后兴起的一种微生物监测环境污染及检测污染物毒性的新方法。
采用现代光电检测手段(生物发光光度计)的发光菌生物毒性实验是毒理学中生物测定的方法之一。
该方法快速、简便、灵敏、廉价,在有毒物质的筛选，环境污染生物学评价等方面有重要的意义，因而备受各国有关研究者的关注。
1995年3月，国家环境保护局、国家技术监督局将发光菌毒性测试定为水质监测标准方法(GB/T 15441-1995)。
一、实验目的与内容实验目的1. 掌握发光细菌毒性测试的标准方法；2. 根据发光细菌发光强度的变化判断受试化合物的毒性；3. 初步了解发光细菌毒性测试的影响因素。
实验内容1. 发光细菌的复苏；2. 发光细菌发光强度的测定；3. 受试化合物毒性的计算。
实验原理发光菌的发光现象是其正常的代谢活动, 在一定条件下发光强度是恒定的, 与外来受试物(无机、有机毒物, 抑菌、杀菌物等) 接触后, 其发光强度即有所改变。
变化的大小与受试物的浓度呈相关关系, 同时与该物质的毒性大小有关。
通常认为外来受试物通过下面两个途径抑制细菌发光: (1) 直接抑制参与发光反应的酶类活性; (2) 抑制细胞内与发光反应有关的代谢过程(如细胞呼吸等)。
毒物的毒性可以用EC50表示, 即发光菌发光强度降低50% 时毒物的浓度。
实验结果显示, 毒物浓度与菌体发光强度呈线性负相关关系。
因而可以根据发光菌发光强度判断毒物毒性大小, 用发光强度表征毒物所在环境的急性毒性。
二、实验材料与方法1. 试剂：氯化汞（分析纯）；氯化钠（化学纯）；蒸馏水。
氯化钠溶液，2.0 g/100 ml (3.0 g/100 ml)，称取2.0 g (3.0 g)氯化钠溶于100ml蒸馏水中，置于2-5℃冰箱备用。
发光细菌法测生物毒性
主要任务1.对常用钻井液材料进行生物毒性分析，遴选出符合环保要求的材料。
2.通过进行生物毒性分析，对不符合环保要求的钻井液材料，如果是必备材料而且目前又找不到相同功能的替代品，则研制新型的符合环保要求的替代品材料。
3.在遴选出的钻井液材料中，择优选用价格性能比较好的材料，通过室内钻井液性能综合试验研究，研制出一种钻井液性能优良，能保证钻探施工顺利进行，符合环境保护要求的新型钻井液体系。
4.现场试验两口井，通过实践检验其钻井液综合性能，整理试验数据，编写研究报告。
一、完成了符合环保要求的钻井液材料的遴选1．生物毒性测定方法的选择（1）糠虾生物试验法（2）微毒性分析法（3）发光细菌法通过对发光细菌法与糠虾法试验结果对比，我们发现发光细菌法的EC50值与糠虾生物试验法的LC50值之间具有一定的相关性：EC50值总是小于LC50值，实验结果见表1。
这说明相同数值的EC50值和LC50值相比，EC50值比LC50值对环境的毒性污染更小，更安全可靠。
表1 四种钻井液体系的EC 50值与LC 50值比较因此本项目采用发光细菌法，测定钻井液单剂及体系的生物毒性，用EC50(相对发光率50%时)来表征被测物的生物毒性，EC50值越大，表明被测物的生物毒性越小；EC50值越小，表明被测物的生物毒性越大。
我们参照糠虾法的排放标准，以EC50＞30000ppm 作为钻井液单剂及体系允许排放的标准。
并参照糠虾生物毒性试验法的生物毒性分级标准，将生物毒性等级划分为六个等级(表2)，以此作为本项目的环境可接受性评价方法和标准。
表2 生物毒性等级分类2．常用钻井液材料的生物毒性评价按发光细菌法对常用钻井液材料进行毒性评价，结果见表3表3 常用钻井液材料生物毒性结果二、完成环保型高效润滑剂的研制和应用在地质调查金刚石取心钻探中，因转速较高，要求钻井液具有良好的润滑性；在石油天然气钻探中，定向井、水平井和深井所占的比例日益增加，钻井液的润滑性成为关键指标之一，因此，钻井液用润滑剂成为一种重要的常用的钻井液材料，其市场需求量日益增加，在钻井液化学处理剂中呈大幅度增长趋势，而目前的润滑剂仍在使用有毒性的矿物油材料（如柴油等）作基础原料，必然会被日益严格的环境保护要求所限制。
发光细菌法急性毒性的测定
发光细菌法急性毒性的测定大连理工大学环境与生命学院1978年美国Beckman 公司即推出功能完备的生物发光光度计“Microtox”，自此，这一急性毒性测试技术在世界范围内迅速推广。
因此人们也将发光菌毒性测试称为Microtox 测试。
简介发光菌毒性测试是20世纪70年代后兴起的一种微生物监测环境污染及检测污染物毒性的新方法。
采用现代光电检测手段(生物发光光度计)的发光菌生物毒性实验是毒理学中生物测定的方法之一。
该方法快速、简便、灵敏、廉价,在有毒物质的筛选，环境污染生物学评价等方面有重要的意义，因而备受各国有关研究者的关注。
1995年3月，国家环境保护局、国家技术监督局将发光菌毒性测试定为水质监测标准方法(GB/T 15441-1995)。
一、实验目的与内容实验目的1. 掌握发光细菌毒性测试的标准方法；2. 根据发光细菌发光强度的变化判断受试化合物的毒性；3. 初步了解发光细菌毒性测试的影响因素。
实验内容1. 发光细菌的复苏；2. 发光细菌发光强度的测定；3. 受试化合物毒性的计算。
实验原理发光菌的发光现象是其正常的代谢活动, 在一定条件下发光强度是恒定的, 与外来受试物(无机、有机毒物, 抑菌、杀菌物等) 接触后, 其发光强度即有所改变。
变化的大小与受试物的浓度呈相关关系, 同时与该物质的毒性大小有关。
通常认为外来受试物通过下面两个途径抑制细菌发光: (1) 直接抑制参与发光反应的酶类活性; (2) 抑制细胞内与发光反应有关的代谢过程(如细胞呼吸等)。
毒物的毒性可以用EC50表示, 即发光菌发光强度降低50% 时毒物的浓度。
实验结果显示, 毒物浓度与菌体发光强度呈线性负相关关系。
因而可以根据发光菌发光强度判断毒物毒性大小, 用发光强度表征毒物所在环境的急性毒性。
二、实验材料与方法1. 试剂：氯化汞（分析纯）；氯化钠（化学纯）；蒸馏水。
氯化钠溶液，2.0 g/100 ml (3.0 g/100 ml)，称取2.0 g (3.0 g)氯化钠溶于100ml蒸馏水中，置于2-5℃冰箱备用。
发光菌的生物毒性测试方法
精品
仪器介绍
DXY-2型生物毒性测试仪是基于毒性物质对 特殊的发光细菌的发光度的抑制作用而设 计的，它通过测定发光细菌发光度的变化， 量度被测环境样品中由重金属和其它有机 污染物所造成的急性生物毒性。
精品
实验步骤
1 仪器的预热15min和调零
2 试管排列和滴加3%Nacl及样液
取出含有0.5g发光细菌冻干粉的安瓿瓶和
发光强度减弱或熄灭,发光细菌发光强度变化可用发光检
测仪测定出来。在一定浓度范围内,有毒物浓度大小与发
光细菌光强度变化成一定比例关系,因此可通过发光细菌
来监测环境中的有毒污染物。发光细菌应用最多的是明
亮发光杆菌,可以监测各种水体,对气体中可溶性有毒物
质,可先通过吸收、溶解在溶液中,再来观察其对发光细
菌的影响。
3 细菌冻干菌剂复苏 Nacl溶液，将安瓿瓶置于含有冰块的保温
瓶中，注入Nacl溶液混匀，2min后菌即复
苏取发2m光l测试管加2mlNacl3%溶液，10μ L
4仪器检验复苏发光细菌冻复倍苏率干发调粉光至质菌X2液，量，发颠光倒量摇高匀于，60测0m试v发，光此量冻，干
粉可用
发光菌液复苏满15min，用10μ L微量注射
发光菌的生物毒性测试 方法
精品
实验原理
1 光菌的发光机理
细菌生物发光反应是由分子氧作用，胞内荧光酶催化， 将还原态的黄素单核苷酸(FMNH2)及长链脂肪醛氧化为 FMN 及长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度在波长 为450-490nm处的蓝绿光。
2 实验原理
当发光细菌接触有毒污染物时,细菌新陈代谢则受到影响,
1 相对发光度的平均值
相对发光度（%）=Hgcl2管或样品管发光量/CK管发光量 再求相对发光度平均值
在线发光细菌生物毒性监测系统
在线发光细菌生物毒性监测系统随着经济的高速发展，近年来水污染事故处于高发期，水质安全问题已成为世界共同关注的热点问题。
自然界存在数十万种化学物质，常用的化学物质也有七千种左右，一旦这些物质超标进入水体也会导致水体毒性上升。
深圳市耐思特科学仪器有限公司是一家专主于研发在线综合生物毒性监测仪器的高新技术企业，欲了解更多详情请搜索深圳耐思特科学仪器进入网站。
水体中的有机污染物主要为一些碳水化合物及酚类、有机氯农药、多氯联苯、多环芳烃、燃料等物质。
水体中碳水化合物过多会造成水中溶氧降低，而那些有毒有机污染物难降解、残留时间长，可造成人体慢性中毒、致癌、致畸、致突变等生理危害。
当前国内水质毒性事件频发，在单项毒性指标明确之前，要有一种综合的毒性效应指标能够快速报告毒性的存在，为下一步准确确定毒性物质提供指导。
生物综合毒性是最常用的指标，水体水质生物毒性监测是国际上通行的水质监测的必经阶段。
在水源地监测中，现场检测项目基本选自《地表水环境质量标准》中规定的109项，很难判断用水是否安全。
2007 年国家正式执行 GB5749-2006《生活饮用水卫生标准》，新标准由原来的 35 项增加到 106 项，这些物质构成了水体综合毒性的成分因子。
因此，利用在线发光细菌生物毒性监测系统在线实时评估水体毒性的大小是十分必要的，可为水体监测预警和决策提供重要的依据。
在线发光细菌生物毒性监测系统测试方法：试剂水合（菌种活化）。
菌种活化时间统一控制在 15 min，与此同时，小容量的水样和稀释水（小试管中）也在室温下放置了 15 min，可以认为与菌种进行曝光反应时的温度一致，从而消除了因水样和稀释水温度不一致而带来的差异。
由于不同化学物质对发光菌的毒性机理作用不同，其反应过程有的（有机物和农残）在 5 min 内完成，有的（如重金属）则需要更长时间，试验中将菌种的曝光反应时间统一控制在 15 min。
毒性检测模式。
NTOX-1000发光细菌生物毒性检测仪分别设定了快速毒性模式、基本毒性模式以及 ATP 模式，快速模式用于生物毒性的现场快速测定以及低毒模式水样的毒性测定，基本模式用于水样中度毒性或者剧毒水样的监测，ATP 模式用于测定水样中的微生物总量。
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结果与数据处理
1 相对发光度的平均值
相对发光度（%）=Hgcl2管或样品管发光量/CK管发光量 再求相对发光度平均值 2 建立并检验HgCl2浓度与其相对发光度均值的相关关系 先求出线性回归方程，再在一定的P值条件下查表进行r检测， 验证相关方程成立，然后做出两者的关系曲线，按照同样的方 法检测样品浓度与其相对发光度均值的相关性。
仪器介绍
DXY-2型生物毒性测试仪是基于毒性物质对 特殊的发光细菌的发光度的抑制作用而设 计的，它通过测定发光细菌发光度的变化， 量度被测环境样品中由重金属和其它有机 污染物所造成的急性生物毒性。
实验步骤
1 仪器的预热15min和调零 2 试管排列和滴加3%Nacl及样液
取出含有0.5g发光细菌冻干粉的安瓿瓶和 Nacl溶液，将安瓿瓶置于含有冰块的保温 3 细菌冻干菌剂复苏 瓶中，注入Nacl溶液混匀，2min后菌即复 取2ml测试管加2mlNacl3%溶液，10μ L复苏 苏发光 发光菌液，颠倒摇匀，测试发光量，倍率 4仪器检验复苏发光细菌冻干粉质量 调至X2，发光量高于600mv，此冻干粉可 用 发光菌液复苏满15min，用10μ L微量注射 器准确吸取10μ L复苏菌液，逐一加入各管 5 给各测试液加复苏菌液 摇匀（精确计时，记录到秒） 拔出样品室的盖子（红指示灯亮），将待 测样品液比色管放入，盖好盖子，抓住盖 子顺时针旋转（此时只绿指示灯亮）约16 读数 2s读数，抓住盖子顺时针旋转至原处（只 红指示灯亮）向上拔出盖子，取出样品。
发光菌的生物毒性测试 方法
实验原理
1 发光菌的发光机理 细菌生物发光反应是由分子氧作用，胞内荧光酶催化， 将还原态的黄素单核苷酸(FMNH2)及长链脂肪醛氧化为 FMN 及长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度在波长 为450-490nm处的蓝绿光。 2 实验原理 当发光细菌接触有毒污染物时,细菌新陈代谢则受到影 响,发光强度减弱或熄灭,发光细菌发光强度变化可用发 光检测仪测定出来。在一定浓度范围内,有毒物浓度大 小与发光细菌光强度变化成一定比例关系,因此可通过 发光细菌来监测环境中的有毒污染物。发光细菌应用最 多的是明亮发光杆菌,可以监测各种水体,对气体中可溶 性有毒物质,可先通过吸收、溶解在溶液中,再来观察其 对发光细菌的影响。