透射电镜样品制作(2015-12-11)
透射电镜样品制备方法
透射电镜样品制备方法由于电子束穿透能力限制，必须把标本切成厚度小于0.1um以下的薄片才适用，这种薄片称为超薄切片。
常用的超薄切片厚度是50-70nm。
在透射电镜的样品制备方法中，超薄切片技术是最基本、最常用的制备技术。
超薄切片的制作过程基本上和石蜡切片相似，需要经过取材、固定、脱水、渗透、包埋聚合、切片及染色等步骤。
一．取材的基本要求组织从生物活体取下后，如果不立即进行适当处理，会由于细胞内部的各种酶作用，出现细胞自溶现象。
此外还可能由于污染，微生物在组织内繁殖使细胞的微细结构遭受破坏，因此，为了细胞结构尽可能保持天然状态，必须做到快、小、准、冷。
（1）动作迅速，组织从活体取下后应在最短的时间内（争取1分钟内）投入2.5%戊二醛固定液。
（2）所取组织的体积要小，一般不超过1mm*1mm*1mm。
也可将组织修成1mm*1mm*2mm大小长条形。
因为固定剂的渗透能力较弱，组织块如果太大，块的内部将不能得到良好的固定。
（3）机械损伤要小，解剖器械应锋利，操作宜轻，避免牵拉、挫伤与挤压。
（4）操作最好在低温（0℃~4℃）下进行，以降低酶的活性，防止细胞自溶。
（5）取材部位要准确。
二．取材方法将取出的组织放在洁净的蜡版上，滴一滴预冷的固定液，用新的、锋利的刀片将组织切下并修小，然后用牙签或者镊子将组织块移至盛有冷的固定液的1.5ml离心管中。
如果组织块带有较多的血液和组织液，应先用PBS洗几遍，然后切成小块固定。
1.动物及人体组织的取材（在冰浴上进行）动物组织的取材，应麻醉（1%戊巴比铵5ml/kg体重腹腔注射）或断头急性处死，解剖出所需器官，用解剖剪刀剪取一小块组织，放在干净的纸板上，滴一滴冷却的固定液，用新的、无油污的锋利双面刀片将材料切成大约1mm宽，2~3mm长的小块并从中选出受损伤较小的小条，再将其切成1mm3的小块，最后用牙签将这些小块逐一放入盛有预冷的、新鲜固定液的1.5ml管内，放入冰箱冷藏室低温固定（0~4℃）2-4小时或以上。
透射点镜的生物样本的制样过程
透射电镜生物样品制作过程透射电镜生物样品制作过程大致经过取材、固定、脱水、浸透、包埋、切片及染色等步骤。
一. 取材取材时要注意的要点是：快、小、冷、净、准、避免机械损伤。
取材方法：将固定液滴在冰台上的卡片上，在麻醉后的动物身上快速用剪刀剪取一块组织，用预冷的过的缓冲液将剪下的组织洗净，迅速放到卡片上的固定液中，用刀片切去被镊子夹到和剪刀剪过的组织，后按实验的目的将组织切成0.5~1mm2的立方或横截面为1mm2的长方体。
用牙签将切好的组织块转移到装有固定液的小瓶中，贴好标签并置于4℃的冰箱中。
二．固定以下操作尽可能在4℃的环境下，使用的溶液也要保存在4℃的冰箱中。
1、戊二醛固定：用镊子轻轻的将组织块从固定液中取出，放在卡片上的固定液中，利用双面刀片把组织块切成小块状，放进盛有1~1.5ml的0.1%的戊二醛的固定液的细管中，将吸管放进真空箱中，将大气压抽到760托后取出，使组织块在戊二醛溶液中固定1小时。
2、漂洗：经戊二醛固定的组织块要用1~1.5ml的0.1%PBS缓冲溶液漂洗，漂洗的次数为5次，在漂洗到第四次时可以将组织留在PBS漂洗液中过夜，放入4℃的冰箱中。
第二天早晨再进行第五次漂洗。
3、四氧化锇固定：向漂洗过的组织中加入0.5ml的0.1%四氧化锇固定液，固定时间为2个小时。
由于四氧化锇具有毒性，因此操作在通风橱里进行。
4、漂洗四氧化锇：用0.1%PBS缓冲溶液漂洗剩余的四氧化锇，然后再漂洗两次，其时间间隔为10min。
三．脱水为了保证包埋介质完全渗入组织内部，必须事先将组织内的水分驱除干净，即用一种和水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水，常用的脱水剂是乙醇和丙酮。
1、酒精脱水:用浓度梯度依次为30%、50%、70%、90%的酒精，依次浸泡组织，其浸泡的时间一般为10min。
当在70%梯度的酒精时，样品可以放置过夜。
2、丙酮脱水：用浓度梯度为90%、100%的丙酮浸泡组织，在纯丙酮中浸泡三次。
透射电镜样品制备
（2）浸透、包埋具体步骤：
① 浸透： a、包埋液与环氧丙烷1：1，37℃或常温1小时。 b、包埋液与环氧丙烷3：1，37℃或常温5小时或过夜。 c、纯包埋液37℃5小时，摆床或振荡器上浸透。
② 包埋与固化： 组织块用牙签挑入包埋管中，注满包埋液，置温箱
中 固 化 。 37℃ 、 12 小 时 后 ， 移 入 45℃ ， 24 小 时 ， 60℃，24小时。
5．超薄切片
（1）制备超薄切片的准 备
1）金属载网：
耐高温，无磁性；平整； 网孔大小合适，孔间距小， 价格便宜。 (一般直径3mm， 内有网孔200～300个)
50%→70%→80%→90%→无水乙醇（或丙酮）（2～3次） 每步10～20分钟（培养细胞时间可短些，致密组织时间长些）， 除无水乙醇（或丙酮）在室温下进行外，其余均应在4℃下进行。
可在70%乙醇中加2%铀盐块染：电子染色。
4．浸透与包埋：
是将组织块制成能进行超薄切片的硬块。
（1）包埋液的组成：
捞片——染色
6．超薄切片染色（正染）
染色的目的： 利用重金属盐与组织细胞的不同成份呈不同程
度的结合或吸附，从而造成这些成份对电子散射 能力的差异，散射电子多的结构在荧光屏上的图 像深暗，称电子密度高;反之即为浅亮，电子密度 低，从而起到增强图像反差的作用。
6．超薄切片染色（正染）
重金属盐有铀盐（如醋酸双氧铀）和铅盐（枸 椽酸铅）等。
【2】常用固定剂的特点
（1）戊二醛（Glutraldehyde） 1）2.5%戊二醛固定液的配制（见书） 2）固定原理及优缺点
透射电镜样本的制备
➢超薄切片制样 ➢负染
超薄切片
由于电子的穿透能力弱，一般的组织细胞的切片，无法在 电镜下获得清晰的图像。阻碍了电子显微镜的发展。
1957年，英国Huxley发明超薄切片机。
超薄切片制片过程
取材
固定
染色
切片
脱水
浸透 包埋
取材
快小冷准净
取材
迅速
部位 少带
放入
0.5-
低温 准确 血液
5mL 10mL 20mL 30mL 40mL 50mL
2.495 0.62 1.885 0.085 2.57 0.31 2.12 0.085 2.425 0.925 1.65 0.085
4.99 9.98 14.97 19.96 24.95 1.24 2.48 3.72 4.96 6.2 3.77 7.54 11.31 15.08 18.85 0.17 0.34 0.51 0.68 0.85 5.14 10.28 15.42 20.56 25.7 0.62 1.24 1.86 2.48 3.1 4.24 8.48 12.72 16.96 21.2 0.17 0.34 0.51 0.68 0.85 4.85 9.7 14.55 19.4 24.25 1.85 3.7 5.55 7.4 9.25 3.3 6.6 9.9 13.2 16.5 0.17 0.34 0.51 0.68 0.85
Epon812 DDSA（十二烷基琥珀酸酐） MNA （甲基内次甲基邻苯二甲酸酐） DMP-30（2,4,6三，二甲氨基甲基苯酚）
固化剂：控制软度 固化剂：控制硬度 加速剂
包埋剂配方
季节配比 包埋液成份
春秋 夏 冬
Epon812 DDSA MNA DMP-30 Epon812 DDSA MNA DMP-30 Epon812 DDSA MNA DMP-30
透射电镜样品制备步骤
透射电镜样品制备步骤透射电镜是一种重要的材料表征技术，它利用电子的波动性和微粒性来观察材料的结构和性质。
为了能够使用透射电镜观察样品，首先需要对样品进行制备。
透射电镜样品制备步骤如下：1.选择合适的样品：透射电镜样品可以是固体、液体、薄膜或纳米颗粒等。
根据研究目的和样品性质选择合适的样品。
2.样品预处理：根据样品性质的不同，进行必要的预处理。
例如，对于固体样品，可以选择切割、抛光或电解抛光等方法来得到平滑的表面。
3.样品固定：将样品固定到透射电镜样品架上。
不同的样品有不同的固定方法。
例如，对于固体样品，可以使用导电胶将其固定在样品架上。
4.薄层制备：对于厚度过大的样品，需要将其制备成透明的薄层以便透射电镜观察。
常用的方法有机械研磨、电子束刻蚀或离子束刻蚀等。
5.样品清洁：将样品放入超声波清洗机中进行清洗，以去除可能附着在样品表面的杂质或污染物。
6.特殊处理：如果需要对样品进行特殊处理，例如加热、冷冻处理或受到特定环境气氛的影响等，根据需要进行相应的处理。
7.样品干燥：将样品放入真空或氮气环境中，以确保样品干燥。
避免样品受到水汽的污染。
8.获得薄片：使用切片机将固态样品切割成适当厚度的薄片。
为了获得高质量的薄片，可以选择特殊的切片工具和技术，例如离子束切片或低速钻磨切片。
9.薄片形状整理：使用不同的研磨和抛光方法，将薄片的形状和表面进行调整，以确保样品的平滑度和一致性。
10.网格制备：将薄片粘贴在透射电镜网格上。
网格可以增强样品的稳定性和保护，同时提供用于定位和标识的标记。
11.后续处理：根据研究目的和透射电镜分析的要求，可以对样品进行进一步处理。
例如，可以进行染色、脱膜、溅射或腐蚀等处理。
以上是透射电镜样品制备的一般步骤。
不同样品和研究目的可能会有所不同。
因此，根据具体的研究需求和样品特点，制备过程可以做相应的调整和优化。
透射电镜样品制备方法
透射电镜样品制备方法透射电镜（Transmission Electron Microscope，简称TEM）是一种高分辨率的显微镜，能够观察到纳米级别的细微结构。
在进行透射电镜观察之前，制备样品是非常关键的一步。
本文将介绍透射电镜样品制备的方法，希望能够对相关研究者提供一些参考和帮助。
首先，样品的制备需要从样品的选择开始。
在透射电镜观察中，样品通常是非晶态材料、纳米颗粒、生物样品等。
根据需要观察的对象，选择合适的样品非常重要。
在选择样品时，需要考虑到样品的尺寸、形状、结构等因素，确保样品能够满足观察要求。
其次，样品的制备需要进行样品的处理和制备。
对于非晶态材料和纳米颗粒样品，通常需要将样品制备成薄膜或薄片的形式，以便透射电镜能够观察到样品的内部结构。
而对于生物样品，则需要进行化学固定、脱水、包埋等处理，以保持样品的形态和结构。
在样品的处理和制备过程中，需要严格控制各个步骤的条件和参数，确保样品的质量和结构不受影响。
接着，样品的制备需要进行样品的切割和抛光。
对于非晶态材料和纳米颗粒样品，通常需要使用离心切片机或离心抛光机进行样品的切割和抛光，以获得薄膜或薄片样品。
而对于生物样品，则需要使用超薄切片机进行样品的切割，以获得透明的样品切片。
在样品的切割和抛光过程中，需要严格控制切割和抛光的条件和参数，确保样品的表面平整和光滑。
最后，样品的制备需要进行样品的染色和标记。
对于生物样品，通常需要使用染色剂对样品进行染色，以增强样品的对比度和清晰度。
同时，还可以使用金标记等方法对样品进行标记，以便观察特定结构或分子。
在样品的染色和标记过程中，需要严格控制染色和标记的条件和参数，确保样品的染色和标记效果良好。
综上所述，透射电镜样品制备是透射电镜观察的关键步骤之一。
通过选择合适的样品、进行样品的处理和制备、进行样品的切割和抛光、进行样品的染色和标记等步骤，可以获得高质量的透射电镜样品，为后续的观察和分析提供可靠的基础。
透射电镜的样品制备方法详解
透射电镜的样品制备透射电镜的样品制备是一项较复杂的技术，它对能否得到好的ＴＥＭ像或衍射谱是至关重要的．投射电镜是利用样品对如射电子的散射能力的差异而形成衬度的，这要求制备出对电子束＂透明＂的样品，并要求保持高的分辨率和不失真．电子束穿透固体样品的能力主要取决加速电压，样品的厚度以及物质的原子序数．一般来说，加速电压愈高，原子序数愈低，电子束可穿透的样品厚度就愈大．对于１００～２００ＫＶ的透射电镜，要求样品的厚度为５０～１００ｎｍ，做透射电镜高分辨率，样品厚度要求约１５ｎｍ（越薄越好）．透射电镜样品可分为：粉末样品，薄膜样品，金属试样的表面复型．不同的样品有不同的制备手段，下面分别介绍各种样品的制备．（１）粉末样品因为透射电镜样品的厚度一般要求在１００ｎｍ以下，如果样品厚于１００ｎｍ，则先要用研钵把样品的尺寸磨到１００ｎｍ以下，然后将粉末样品溶解在无水乙醇中，用超声分散的方法将样品尽量分散，然后用支持网捞起即可．（２）薄膜样品绝大多数的ＴＥＭ样品是薄膜样品，薄膜样品可做静态观察，如金相组织；析出相形态；分布，结构及与基体取向关系，错位类型，分布，密度等；也可以做动态原位观察，如相变，形变，位错运动及其相互作用．制备薄膜样品分四个步骤：ａ将样品切成薄片（厚度１００～２００微米），对韧性材料（如金属），用线锯将样品割成小于２００微米的薄片；对脆性材料（如Ｓｉ，ＧａＡｓ，ＮａＣｌ，ＭｇＯ）可以刀将其解理或用金刚石圆盘锯将其切割，或用超薄切片法直接切割．ｂ切割成φ３ｍｍ的圆片用超声钻或ｐｕｎｃｈｅｒ将φ３ｍｍ薄圆片从材料薄片上切下来．ｃ预减薄使用凹坑减薄仪可将薄圆片磨至１０μｍ厚．用研磨机磨（或使用砂纸），可磨至几十μｍ．ｄ终减薄对于导电的样品如金属，采用电解抛光减薄，这方法速度快，没有机械损伤，但可能改变样品表面的电子状态，使用的化学试剂可能对身体有害．对非导电的样品如陶瓷，采用离子减薄，用离子轰击样品表面，使样品材料溅射出来，以达到减薄的目的．离子减薄要调整电压，角度，选用适合的参数，选得好，减薄速度快．离子减薄会产生热，使样品温度升至１００～３００度，故最好用液氮冷却样品．样品冷却对不耐高温的材料是非常重要的，否则材料会发生相变，样品冷却还可以减少污染和表面损伤．离子减薄是一种普适的减薄方法，可用于陶瓷，复合物，半导体，合金，界面样品，甚至纤维和粉末样品也可以离子减薄（把他们用树脂拌合后，装入φ３ｍｍ金属管，切片后，再离子减薄）．也可以聚集离子术（ＦＩＢ）对指定区域做离子减薄，但ＦＩＢ很贵．对于软的生物和高分子样品，可用超薄切片方法将样品切成小于１００ｎｍ的薄膜．这种技术的特点是样品不会改变，缺点是会引进形变．（３）金属试样的表面复型即把准备观察的试样的表面形貌（表面显微组织浮凸）用适宜的非晶薄膜复制下来，然后对这个复制膜（叫做复型）进行透射电镜观察与分析．复型适用于金相组织，断口形貌，形变条纹，磨损表面，第二相形态及分布，萃取和结构分析等．制备复型的材料本身必须是＂无结构＂的，即要求复型材料在高倍成像时也不显示其本身的任何结构细节，这样就不致干扰被复制表面的形貌观察和分析．常用的复型材料有塑料，真空蒸发沉积炭膜（均为非晶态物质）．常用的复型有：ａ塑料一级复型，分辨率为１０～２０ｎｍ；ｂ炭一级复型，分辨率２ｎｍ，ｃ塑料－炭二级复型，分辨率１０～２０ｎｍ；ｄ萃取复型，可以把要分析的粒子从基体中提取出来，这种分析时不会受到基体的干扰．除萃取复型外，其余复型只不过是试样表面的一个复制品，只能提供有关表面形貌的信息，而不能提供内部组成相，晶体结构，微区化学成分等本质信息，因而用复型做电子显微分析有很大的局限性，目前，除萃取复型外，其他复型用的很少．。
透射电镜样品制备
透射电镜试样制备一、实验内容及目的了解透射电镜对试样的要求，熟悉透射电镜试样的制备过程，制备一个合格的透射电镜试样。
二、薄膜样品的制备用于透射电镜下观察的试样厚度要求在50-200nm之间，试样的制备过程大致可以分为以下三个步骤：第一步从实物或大块样品上切割厚度为0.3-0.5mm厚的薄片。
电火花线切割法是目前用得最广泛的方法，它是用一根往返运动的金属丝作切割工具，以被切割的样品作阳极、金属丝作阴极，两极间保持一个微小的距离，利用其间的火花放电进行切割。
电火花切割可切下厚度小于0.5mm的薄片，切割时损伤层比较浅，可以通过后续的磨制或减薄过程去除。
电火花切割只能切割导电样品，对于陶瓷等不导电样品可用金刚石刃内圆切割机切片。
第二步样品薄片的预减薄。
预减薄的方法有两种，即机械法和化学法。
机械法是通过手工研磨来完成的，把切割好的薄片一面用粘接剂粘在样品座表面，然后在水砂纸磨盘上进行研磨减薄。
应注意把样品平放，不要用力太大，并使它充分冷却。
减薄到一定程度时，用溶剂把粘接剂溶化，使样品从样品座上脱落下来，然后用同样方法研磨另一个面直至样品被减薄至规定的厚度。
（如果材料较硬，可减薄至70μm左右；若材料较软，则厚度不能小于100μm。
另一种预先减薄的方法是化学薄化法。
这种方法是把切割好的金属薄片放入配制好的化学试剂中，使它表面受腐蚀而急需减薄。
因为合金中各组成相的腐蚀倾向是不同的，所以在进行化学减薄时，应注意减薄液的选择。
化学减薄的速度很快，因此操作时必须动作迅速。
化学减薄的最大优点是表面没有机械硬化层，减薄后样品的厚度可以控制在20-50μm 。
经化学减薄的样品最终抛光穿孔后，可供观察的薄区面积较大。
但是化学减薄时必须事先把薄片表面充分清洗，否则将得不到满意的结果。
第三步最终减薄目前效率最高和操作最简便的方法是双喷电解抛光法，图为一台双喷式电解抛光装置的示意图。
将预先减薄的样品剪成直径为3mm的圆片,装入样品夹持器中。
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透射电镜样品包埋块制作原理步骤
一、取材：
1、动作迅速：组织离体后，应将其快速放入4℃戊二醇固定液中，使组织细胞尽可能保持原来的生活状态。
2、减少损伤：选择锋利切割器械，减少牵拉或挤压组织。
3、组织块大小：取材医生可先切成长条形，然后再修成约1mm3大小。
二、固定：
固定目的是把细胞在活体状态时的超微结构细节尽可能完整地保存下来，避免自身酶的分解而出现自溶，或因外界微生物的入侵繁殖而产生腐败，致使细胞的超微结构遭受破坏。
同时也使细胞内的各种成分固定下来，避免以后的冲洗和脱水时溶解和流失。
理想的固定剂应具备以下特点：能够迅速又均匀地渗透到组织结构内；能够稳定细胞各种结构成分，使之在以后处理过程中不致溶解和丢失；对细胞超微结构没有损伤；能供细胞化学测定并能增强图像反差。
当然，满足所有要求的固定剂是不存在的，目前常用固定剂有锇酸和戊二醇。
1.使用锇酸的注意事项：
锇酸即四氧化锇，它能和细胞内绝大多部分成分反应，且能够保护脂肪，但对碳水化合物、糖类和核酸保护作用差，锇酸渗透差，分子密度大，经锇酸固定的组织在电镜下能获得较好反差。
锇酸为剧毒、极易挥发的试剂，对呼吸道有强烈刺激作用，必须在通风橱中操作，废液必须收集在密闭容器中。
常用的锇酸溶液为2%的储备液，使用之前需用0.2MPBS稀释成1%的锇酸溶液。
2.戊二醇
戊二醇能够稳定糖原，同时保存某些锇酸保护作用差的蛋白质结构，对酶活性破坏小。
对微管、滑面内质网等固定较好，对脂肪保护差，且反差小，因此必须和锇酸配合使用，即“双重固定法”。
3.固定方法：
样本先用2.5%戊二醇在4℃下固定2h，经PBS缓冲液多次清洗后再用1%锇酸固定2h。
根据不同组织，可适当延长固定时间。
由于戊二醇能够和锇酸反应产生电子致密的还原锇沉淀，组织经戊二醇固定后，必须将戊二醇清洗干净才能转入锇酸。
此外，锇酸又能和乙醇作用生成沉淀，因此锇酸固定后也应用PBS清洗液进行清洗干净方能进行脱水处理。
一般清洗3次，每次15min左右(或过夜)。
三、脱水：脱水是将组织中的游离水彻底清除的过程。
由于常用的包埋剂，如环氧树脂，大多都是非水溶
性树脂，只有将生物组织中的游离水清除干净，包埋剂才能浸入组织，常用脱水剂是乙醇和丙酮。
乙醇对细胞物质抽提少，组织收缩也少，但它和环氧树脂互溶性差，因此使用乙醇脱水时须用环氧丙烷作为中间溶剂。
丙酮和酒精、环氧丙烷互溶，所以通常先用乙醇后再用丙酮的脱水方法。
急剧脱水会引起细胞收缩，因此应采用逐级脱水(50%-70%-90%-100%乙醇)而不能急剧脱水。
更换溶液时动作要快，特别是不要让组织离开溶液，否则会在组织内外产生气泡；脱水过程中若要长时间停留或过夜，应放在70%乙醇或丙酮中，并在4℃保存。
四、包埋
1.渗透：渗透就是用包埋剂逐渐取代组织中的脱水剂，使细胞内外空隙被包埋剂所填充。
一般可先用环氧丙烷对半稀释的包埋剂浸透1-2h，再用纯包埋剂37℃烤箱渗透2h左右。
包埋剂通常由树脂、硬化剂、增塑剂及催化剂4种试剂按一定比例配制而成。
2.包埋：目的是以包埋剂完全浸透到组织内部，经加温逐渐聚合成坚硬固体。
理想包埋剂应具备的条件：黏稠适中，有良好切割性；能经受电子轰击；透明度较好；对人体无害。
目前常用国产环氧树脂618、Epon812环氧树脂、及低黏度包埋剂Spurr。
3.环氧树脂：环氧树脂为热塑性树脂，主要有两种化学反应基团，即环氧基和羟基。
末端环氧基易与其他含活性氢原子化合物如胺类反应，形成首尾相接的长链状聚合物。
单体中羟基能与酸酐结合，形成分子间横桥连接。
因此，把环氧树脂单体、胺类、酸酐等三者按一定比例混合，加上适当温度，可形成稳定的交
１
链状聚合物。
包埋剂配制及使用过程中的注意事项：
1. 所有容器及玻璃棒等应是清洁和干燥的；
2.配制过程中应搅拌均匀，使用过程中应避免异物，特别是水、乙醇、丙酮等混入包埋剂；
3.配制好的包埋剂应密封保存，避免受潮。
剩余包埋剂可密封并储存在-10—-20℃冰箱中，延长其使用期。
4.常用树脂制方
Epon812环氧树脂：
5.包埋方法
Spurr70℃烤箱内8h即可固化，60℃时间要相应延长，减少DER-736量可增加硬度。
国产树脂618、Epon812环氧树脂需37℃过夜，经45℃12h、60℃24h可固化，干燥存放。
五、切片
1.修快
首先粗修把多余树脂磨掉，然后在双筒镜下把端面修平，使组织面暴露，然后再修成45℃四面锥体。
顶端面可修成长方形或梯形，注意上下面平行。
半薄切片顶端面积以1-2mm2左右为宜，修成直角梯形便于定位。
2.切片操作
固定好组织块，调整刀的高低、角度和刀刃位置，调整刀槽内的液面，调整组织块与刀的距离，选择切片速度及厚度。
可根据干涉色判断切片厚度：灰色40-50nm ；银白色50-70 nm；金黄色70-90 nm；紫色90 nm以上。
灰色、银色较薄，但反差小，金色分辨率低，反差好，紫色太厚，一般不能观察。
六、染色
1.醋酸铀：是目前应用最广泛染色剂，能和大多数成分相结合，对核酸、核蛋白、结缔组织纤维、糖原、
分泌颗粒、溶酶体均可染色，但对膜结构染色效果较差。
醋酸铀在水和乙醇中溶解度较差，一般用50%或70%乙醇或丙酮配制成2%-3%的溶液。
组织块染色1-2h，切片染色30min即可。
长时间染色可引起糖原抽提和组织变形。
2.枸橼酸铅：铅染色其应用也很普遍，它具有很高的电子密度，对细胞超微结构均有广泛亲和力，能提高
细胞膜系统及脂类反差。
铅染液易与空气中二氧化碳接触形成碳酸铅沉淀，污染切片。
一般染10-20min 即可，长时间染色可使反差全部增强，不利于观察。
２
３
枸橼酸铅染液配制：
附表
表1 戊二醛溶液的配制
表2 0.2M 磷酸缓冲液（PBS ）的配制
按下表比例混合A 、B 液后，配成0.2mol/L 的母液，其中pH7.0为常用配方 pH 值 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0 A 液 8.0 12.3 18.5 26.5 37.5 49.0 61.0 72.0 81.0 87.0 91.5 94.7 B 液
92.0 87.7 81.6 73.5 62.5 51.0 39.0 28.0 19.0 13.0 8.50 5.30
在缓冲液中加入葡萄糖，蔗糖或氯化钠等均能改变渗透压。
A 液：0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液
B 液：0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液 Na 2HPO 4 28.4g 或Na 2HPO 4.H 2O 31.61g 或Na 2HPO 4.2H 2O 35.6g 或Na 2HPO 4.7H 2O 53.63g 或Na 2HPO 4.12H 2O 71.64g
加双蒸水至1000mL
NaH 2PO 4 24.0g 或NaH 2PO 4.H 2O 27.6g 或NaH 2PO 4.2H 2O 31.21g
加双蒸水至1000mL
透射电镜样本制备
1.登记好需要制备样本数量及相应位置顺序。
2.摆放好脱水盒，加入适量PBS,依次按顺序转移组织块至脱水盒内。
3.先穿一个空盒作为上盖，再依次把脱水盒穿起来，放入脱水瓶内，加入10mlPBS,4℃存放，过夜，每天换液一次，换液两次。
4.配制脱水剂：PBS、1%锇酸（PBS对半稀释）、双蒸水、50%酒精、70%酒精、90%酒精、100%酒精、50%丙酮、70%丙酮、90%丙酮、100%丙酮（4℃）、100%丙酮（常温）、50%环氧丙烷，共13个，其中第一个PBS 直接用原瓶即可。
5.脱水程序：锇酸1.5h，水1min，其它每步6min。
6.把组织块放入预先环氧丙烷稀释好的包埋树脂中浸透1h。
7.取出脱水盒，先旋转几下，防止组织块贴壁（注意动作要快，如果组织块较多，中间应多次湿润组织快）。
8.把组织依次块放入包埋模具中，过夜浸透。
9.牙签轻轻调整组织块位置，尽量贴边。
10.聚合器中加热聚合：37℃12h、48℃24h、60℃48h。
４。