检测试剂盒反向斑点杂交法
pcr反向点杂交检测地中海分型报告
pcr反向点杂交检测地中海分型报告PCR反向点杂交检测地中海分型报告一、引言地中海贫血是一种常见的遗传性血液病，主要分为地中海贫血（β-地中海贫血）和地中海贫血症（α-地中海贫血）。
PCR反向点杂交（PCR-RFLP）是一种常用的分子生物学方法，可用于检测地中海分型。
本报告旨在详细介绍PCR-RFLP技术在地中海分型检测中的应用。
二、PCR反向点杂交原理1. PCR原理PCR是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）的缩写，是一种通过体外扩增DNA片段的方法。
它利用DNA聚合酶酶活性，在特定条件下，使DNA模板得到高效扩增。
2. 反向点杂交原理反向点杂交是一种基于DNA序列特异性识别的方法。
它通过将目标DNA序列与特异性引物结合，并经过适当处理后，通过电泳或其他方法进行检测。
三、PCR-RFLP技术在地中海分型检测中的应用1. 样本采集和DNA提取需要从受检者身上采集样本，如静脉血或口腔黏膜细胞。
通过常规方法提取DNA，如酚/氯仿法或商用DNA提取试剂盒。
2. PCR扩增使用特异性引物对目标基因进行PCR扩增。
对于β-地中海贫血，通常选择扩增β-地中海贫血突变的片段；对于α-地中海贫血，通常选择扩增α-地中海贫血突变的片段。
3. 酶切反应将PCR产物与适当的限制性内切酶一起进行酶切反应。
限制性内切酶是一种能够识别特定DNA序列并在该序列上切割的酶。
4. 胶电泳分析将酶切产物经过胶电泳分离，并使用合适的染料染色。
在紫外光下观察和记录胶图。
根据不同基因型的特点，可以确定受检者的地中海分型。
四、结果解读根据PCR-RFLP结果，可以得出以下结论：1. 如果在PCR-RFLP分析中观察到明显的限制性内切酶位点差异，即PCR产物经过酶切后出现不同长度的片段，可以判断受检者为地中海贫血（β-地中海贫血）或地中海贫血症（α-地中海贫血）。
2. 通过比对PCR-RFLP结果与已知标准样本的电泳图，可以进一步确定受检者的具体地中海分型。
乙型肝炎病毒基因分型检测标准操作规程(PCR-反向斑点杂交法)
乙型肝炎病毒基因分型检测标准操作规程（PCR-反向斑点杂交法）1.目的:乙型肝炎病毒基因分型检测标准操作规程，保证检测结果的准确性。
2.应用范围: PCR实验室。
3.职责:3.1 文件编写：实验室技术员。
3.2 文件审核：实验室主管。
3.3 文件审批：实验室主任。
3.4 执行：PCR实验室所有工作人员。
4. 参考文献:4.1《中山大学达安基因股份有限公司乙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒说明书》4.2 中山大学达安基因股份有限公司核酸扩增荧光检测系统DA7600型使用说明书5. 内容:5.1 检测方法：PCR-反向斑点杂交法。
5.2 实验原理：选取人乙型肝炎病毒基因组中编码表面抗原的S基因的编码区为扩增区域，设计特异性引物及B，C，D型特异性探针，预先将特异性探针包被在尼龙膜上，再利用生物素标记的引物对靶片段进行PCR扩增，PCR产物和膜条上的特异性探针杂交，靶标中的型特异性片段会和特异性探针结合，未结合的PCR 产物通过洗膜去除，最后进行显色和结果分析，可检测HBV B、C、D三种基因型DNA.5.3 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集。
5.3.1 标本类型：血清。
5.3.2 标本采集：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml，注入无菌的干燥玻璃管，室温（22～25℃）放置30～60 min，全血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1,500 rpm离心5min；吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管。
5.3.3 标本保存：标本采集后保存于2～8℃。
5.3.4 运送条件：标本运送采用冰壶。
5.3.5 标本拒收标准：污染、严重溶血、脂血类或肝素抗凝剂标本。
5.4 设备和试剂:5.4.1 设备： DA7600 PCR仪、低速水平离心机、生物安全柜、台式高速离心机、移液器、混匀器、恒温水浴箱/干式恒温器、冰箱（4℃、-20℃）、移动/固定紫外灯、冷冻离心机。
5.4.2 试剂：5.4.2.1 试剂品牌：中山大学达安基因股份有限公司乙型肝炎基因分型检测试剂盒5.5.2.2 试剂组成：DNA 浓缩液（2,000μL/管）1 管；DNA 提取液（500μL/管）1 管；HBV 基因分型突变反应管（未贴标签管）10 人份；HBV 基因分型阳性质控品（50μL/管）1管，HBV 基因分型突变阴性质控品（50μL/管）1管，杂交液Ⅰ浓缩液（50ml/瓶）1瓶，杂交液Ⅱ浓缩液（30ml/瓶）1瓶，溶液Ⅰ（100μL/管）1管，溶液Ⅱ浓缩液（25ml/瓶）1瓶，溶液Ⅲ（1ml/管）2管，溶液Ⅳ（100μL/管）1管，杂交膜条（10人份/袋）1袋。
人乳头瘤病毒(HPV)基因分型检测标准操作规程(PCR-反向斑点杂交法)
人乳头瘤病毒（HPV）基因分型检测标准操作规程1.目的：规范人乳头瘤病毒（HPV）反向点杂交（RDB）基因分型检测操作流程，保证检测结果的准确性。
2.应用范围: PCR实验室。
3.职责:3.1 文件编写：实验室技术员。
3.2 文件审核：实验室主管。
3.3 文件审批：实验室主任。
3.4 执行：PCR实验室所有工作人员。
4. 参考文献:4.1《中山大学达安基因股份有限公司乙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒说明书》4.2 中山大学达安基因股份有限公司核酸扩增荧光检测系统DA7600型使用说明书5. 内容：5.1 检测方法：PCR-反向斑点杂交法。
5.2 实验原理：选取人乳头瘤病毒（HPV）基因组保守序列为扩增靶序列，设计通用引物和特异型别探针（包括16种中高危型和3种低危型HPV）,将RNA逆转录为cDNA后，利用生物素标记的通用引物对cDNA进行PCR 扩增，得到的产物与固定在膜上的特异型别探针按照碱基互补配对的原理杂交。
若PCR产物和探针完全配对，则膜条上相应探针位置捕获到标有生物素的PCR产物，并和亲和素–辣根过氧化物酶偶联，再与四甲基联苯胺（TMB）反应呈现较强的深蓝色，若与探针不完全配对，则经严格杂交和洗涤后膜条上相应探针位置不能捕获到标有生物素的PCR产物，结果无显色反应或显很淡的背景色。
5.3 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集。
5.3.1 标本类型：尿道分泌物、宫颈脱落细胞、疣体细胞等。
5.3.2 标本采集：5.3.2.1 道分泌物：在无菌条件下，用棉拭子伸入尿道内,旋转数周并停留片刻后取出。
5.3.2.2 宫颈脱落细胞:在无菌条件下，用宫颈刷伸入宫颈管内2cm,旋转数周并停留片刻后取出。
5.3.2.3 疣体细胞: 用无菌棉拭子在疣体部位刮取上皮细胞。
5.3.3 标本保存：采集的标本置于盛有1ml生理盐水的小试管中，2～8℃保存。
5.3.4 运送条件：标本长途运送时采用冰壶。
5.3.5 标本拒收标准：污染标本。
β地中海贫血基因检测反向点杂交法ppt课件
反向斑点杂交技术
反向斑点杂交(reverse dot blot，RDB)是Saiki等提 出的一种斑点杂交技术，该技术采用固化了多种特异 性探针的膜条与扩增靶序列杂交，使一次杂交即可同 时筛查被检DNA中的多种突变。这种以膜上固定探针取 代固定靶DNA的方式，改变了传统杂交法一次只能检测 一种突变的模式，具有快速、简便、高敏感度和特异 性强的特点，尤其在基因突变检测、基因分型、病原 体的检测等领域有其独特的优势。
反向斑点杂交技术原理
反向斑点杂交采用生物素标记的引物进行靶核酸的扩 增，将扩增产物同固定在尼龙膜上的探针进行杂交， 一次杂交反应可以检测多种靶序列。该方法具有快速、 简便，高灵敏度和特异性的特点，广泛应用于病原体 检测、基因突变检测、基因分型以及遗传多态性检测 等多个方面，具有潜在的临床应用价值。
31N
27/28M
41-42M 654M -28M 71-72M 17M
βEM
31M
IVS-I-1M
43M
-32M -29M -30M 14-15M CAP
IntM
IVS-I-5M
杂交膜条
41-42N 654N -28N
71-72N 17N
βEN
31N
27/28M
41-42M 654M -28M 71-72M 17M
15min 10min 1min 30sec 30sec 7min
35cycles
反应条件按照试剂盒要求
影响PCR的因素见理论课内容
3.杂交 ：
15ml管 探针膜条（做好记号） A液 5-6ml DNA溶液（PCR产物）25ul
沸水浴10min
42℃杂交1.5小时以上
4.洗膜 ：
50ml塑料管
反向斑点杂交技术应用于青少年女性HPV感染检测的研究
反向斑点杂交技术应用于青少年女性HPV感染检测的研究陈淑芬;叶智良;朱晓丹;李相新;蔡艳桃【摘要】目的利用反向斑点杂交技术检测青少年女性的人乳头状瘤病毒(HPV)的感染情况并进行型别分析,为该类人群的HPV感染情况提供流行病学数据.方法应用PCR-反向斑点杂交(RDB)法对85例青少年女性进行23种HPV亚型检测(低危型为HPV6、11、42、43、45和高危型为HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4).结果 85例样本中,HPV感染者40例,阳性率为47.06%,高危型占感染例数的50.62%,低危型占49.38%,二型或二型以上混合感染占52.5%(21/40).结论应大力加强青少年女性HPV感染的宣传和筛查力度;反向斑点技术是很好的青少年女性HPV感染的筛查手段.【期刊名称】《检验医学与临床》【年(卷),期】2010(007)016【总页数】3页(P1665-1666,1669)【关键词】人乳头瘤病毒;反向斑点杂交;青少年女性;亚型【作者】陈淑芬;叶智良;朱晓丹;李相新;蔡艳桃【作者单位】广东省佛山市妇幼保健院检验科,528000;广东省佛山市妇幼保健院检验科,528000;广东省佛山市妇幼保健院检验科,528000;广东省佛山市妇幼保健院检验科,528000;广东省佛山市妇幼保健院检验科,528000【正文语种】中文【中图分类】R446.61;R711.742008年德国科学家郝森(Hausen)因发现了人乳头瘤病毒(HPV)导致子宫颈癌，与另外两位科学家共享了2008年度的诺贝尔生理学或医学奖。
高危型HPV持续感染是世界范围公认的导致宫颈癌的根本原因，但宫颈癌的发生与发展是一个漫长的过程，所以加强HPV感染的筛查，及早发现、及时干预是预防宫颈癌有效而经济的手段。
加上HPV疫苗的开发和应用，将有助于降低宫颈癌的发病率并使宫颈癌成为第一个可预防的癌症[1]。
反向点杂交的实验原理
反向点杂交的实验原理反向点杂交（reverse dot blot）是一种用于检测DNA序列的实验技术。
这项技术的原理是利用固相杂交（solid-phase hybridization）原理，通过在固相载体（如膜、芯片等）上附着特定的探针来识别和鉴定DNA样本中的目标序列。
反向点杂交的实验流程一般包括以下几个步骤：1. DNA提取：从样本中提取出待检测的DNA，通常采用常见的DNA提取方法。
2. 特异性股DNA片段的合成：选择与目标序列互补的引物，通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）合成出特异性的DNA片段作为探针。
3. 固相载体表面预处理：将固相载体（如膜、芯片等）在实验前进行预处理，以便更好地固定探针和样本DNA。
4. 探针固定：将合成的特异性DNA片段固定在固相载体上的特定位置，形成探针阵列。
5. 样本处理：将待检测的DNA样本进行预处理，如酶切、标记等操作，以便后续杂交反应。
6. DNA杂交：将预处理后的DNA样本与探针阵列同时加入反应管中，在适当的条件下进行DNA杂交反应。
在杂交过程中，DNA样本中的目标序列与探针阵列上的相应探针发生特异性的配对结合。
7. 杂交后的处理：将杂交反应后的反应管进行洗涤等处理，以去除非特异性结合的DNA分子，保留特异性结合的探针-目标序列杂交产物。
8. 检测信号的产生和分析：通过适当的检测方法（如放射性标记、化学标记等）对特异性结合的探针-目标序列杂交产物进行检测和分析。
通常可以通过辐射计数、光度计等设备来测定探针与目标序列的结合情况。
反向点杂交技术的优势在于其快速、高通量且灵敏的特点。
由于探针阵列上含有大量特异性的DNA片段，可以同时检测多个目标序列，从而提高检测效率和节约实验时间。
此外，反向点杂交还可以适用于不同类型的样本，包括基因组DNA、cDNA、RNA、PCR产物等。
在实际应用中，反向点杂交技术被广泛用于基因诊断、疾病筛查、遗传资源评估等领域。
HPV临床常用检测方法
由于HPV不能在体外细胞培养,故不能用简便的血清血检测进行HPV的诊断与分型。
临床上用于检测HPV的方法包括细胞学方法、免疫组化、原位杂交、斑点杂交、核酸印迹与PCR 等,其中以PCR方法的敏感性最高,就是目前应用最多感染的HPV型别、含量、持续时间决定病变的发展与预后,就是进行HPV检测的主要内容。
目前主要就是通过应用分子生物学方法进行HPV DNA的检测。
1、现有的HPV实验室主要检测手段:①聚合酶链反应(PCR, Polymerase Chain Reaction):扩增位于两段已知序列之间的DNA片断的方法。
该法有较高的敏感度,可进行HPV分型,缺点就是对实验室环境要求较高,容易发生样本间的交叉污染,从而导致假阳性率高。
②核酸杂交检测有较好的特异性与敏感度,还可以进行HPV DNA的分型,各种核酸杂交检测方法有一定的优缺点。
A核酸印迹原位杂交适用于HPV分型与HPV DNA分子量鉴定,虽然灵敏度高,但因操作复杂,需要新鲜组织标本,不便在临床上大规模使用。
B斑点印迹其敏感度与特异性均低于核酸印迹原位杂交法,虽然经济实用,但实验过程存在有放射性污染,就是环保所不能轻视的问题。
C原位杂交(in situ hybridization,一种核酸杂交技术,可用来测定基因或特定核苷酸序列在核酸分子的所在部位,检测重组体DNA) 通过非放射性探针对石蜡组织进行检测,能作定位检测,假阳性率低,但灵敏度不高,大大降低了临床使用价值。
D杂交捕获法(Hybrid Capture)杂交捕获试验就是利用化学发光对抗体捕获的信号加以放大。
首先使DNA双链释放并分解成为可以杂交的核苷酸单链,DNA单链与RNA组合探针结合为RNA-DNA杂合体,特异性抗体将RNA-DNA杂合体捕获,偶联有碱性磷酸酶的第二抗体与RNA-DNA杂合体结合,碱性磷酸酶使酶底物发光,根据光的强弱可确定碱性磷酸酶的含量,从而确定RNA-DNA杂合体的含量。
膜-反向斑点杂交技术检测肺结核患者肺组织和肺泡灌洗液中的结核杆菌
ａ ｎ ｄ ｂ ｒ ｏ ｎ ｃ ｈ ｏ ａ ｌ ｖ ｅ ｏ ｌ ａ ｒ ｌ ａ ｖ ａ ｇ ｅ ｌｕ ｆ ｉ ｄ ｗｅ ｒ ｅ ：ａ ｃ ｉ ｄ － ｆ ａ ｓ ｔ ｓ ｔ ａ ｉ ｎ ｉ ｎ ｇ ｐ ｏ ｓ ｉ ｔ ｉ ｖ ｅ ｒ ａ ｔ ｅ ｗａ ｓ ３ ２ ． ８ ％． ＲＴ－ Ｐ ＣＲ ｐ ｏ ｓ ｉ ｔ ｉ ｖ ｅ ｒ ａ ｔ ｅ ｗ ａ ｓ ８ ２ ． ８ ％ ．ＲＤＢ
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pcr反向点杂交法原理
pcr反向点杂交法原理PCR反向点杂交法（RDA，Reverse Dot Blot Assay）是一种DNA分子生物学技术，用于检测不同样本中的DNA序列差异。
其原理是利用PCR扩增反向寡核苷酸和标记源DNA，在固相介体上固定反向寡核苷酸，并将PCR产物与之杂交，通过信号检测来分析不同样本中的DNA序列多样性。
PCR反向点杂交法的核心是使用反向寡核苷酸作为杂交探针。
反向寡核苷酸是一种寡核苷酸序列，其序列与需要检测的DNA序列相反。
通过PCR扩增，反向寡核苷酸可以标记源DNA序列，并在杂交时与之结合。
这样，如果源DNA中存在反向寡核苷酸所代表的序列，反向寡核苷酸就会结合，并被标记源DNA识别。
PCR反向点杂交法的流程包括以下步骤：1.选择需要检测的不同样本，提取其DNA并进行PCR扩增。
2.设计和合成反向寡核苷酸探针，将其固定在固相介质上，并进行亚群的划分，通常选用聚丙烯酰胺凝胶或纸质介质。
3.将PCR产物加入到反向寡核苷酸探针中，进行杂交，形成稳定的反应复合物。
4.使用信号检测技术（如辐射自显像或色素检测）来检测PCR产物的存在，分析杂交反应的结果，判断不同样本中的DNA序列多样性。
PCR反向点杂交法的优点是可以快速、准确地检测DNA序列的多样性。
同时，基于反向寡核苷酸探针的设计，可以大大减少PCR的假阳性和假阴性结果。
此外，该技术还可以用于检测多个样本的DNA序列，从而判断它们之间的相似性和区别性。
总之，PCR反向点杂交法是一种重要的DNA分子生物学技术，已广泛应用于生物医学、生物工程和生态学等领域。
它不仅可以提高我们对不同样本中DNA序列的了解，还可以帮助我们更好地理解生物多样性和进化学等重要问题。
建立一种反向斑点杂交法检测肺炎支原体23SrRNAV区A2063G基因突变的方法
收稿日期 2009-09-15作者简介 沈俊娅(1975-),女,浙江大学在读硕士研究生(杭州市第一人民医院)主管技师,从事临床免疫学研究,Em ai:l sj y87065701@yahoo .co m.c n;范骏,通讯作者文章编号:1005-376X(2009)11-1033-04技术与方法建立一种反向斑点杂交法检测肺炎支原体23S rRNA V 区A2063G 基因突变的方法沈俊娅,范骏(浙江大学医学院附属第一医院传染病诊治国家重点实验室,浙江杭州 310003)摘要 目的 建立检测肺炎支原体(M ycop lasma p neumoniae ,M P )23S r RNA V 区2063基因型的反向斑点杂交方法,并与PCR 产物直接测序法的结果进行比较分析。
方法 19例自临床咽拭子标本分离培养的M P ,用自行设计的反向斑点杂交法检测23S r RNA V 区2063基因型,同时对相应序列测序分析。
抽提标准菌株FH 和127份经PCR 测定M P 阳性的临床标本基因组DNA,用M P 阴性的基因组DNA 抽提物5份作阴性对照,用反向斑点杂交法检测23S r RNA V 区2063基因型。
结果 19例分离培养的M P,经反向斑点杂交法检测15株有23S r RNA V 区基因A 2063G 位点突变;4株为2063A ,与测序结果一致(K appa 一致性检验,P >0.05)。
经反向斑点杂交法检测,127份M P 阳性的基因组DNA 抽提物中有122份标本为A 2063G 位点突变,标准菌株F H 和2份DNA 抽提物的2063位点碱基为A,还有3份抽提物标本的2063位点碱基既有A 又有G,5份阴性对照均无显色。
结论 反向斑点杂交方法能快速、准确检测临床M P 23S rRNA V 区2063基因型。
关键词 肺炎支原体;聚合酶链反应;基因突变;反向斑点杂交法中图分类号 R375.2 文献标识码 BDetection ofA 2063G gene mutation in 23S rRNA do m ai n V of M ycop las ma pneu m on -iae by a reverse dot -blot hybridizationS H E N Jun -ya ,FAN Jun(T he F irst A ff iliated H osp it al of Zhejiang Universit y School of M e d ici ne ,H angzhou 310003,Ch i na)Ab stract O b jective T o establi sh a reve rse do t -blot hybridization i n detecti ng t he genotypes o f 23S r RNA do m a i n V o f M ycop las ma p neumoniae and compare itw ith the d irect sequenc i ng m ethod .M ethod A sel-f desi gned reverse dot -b l o t hybri d izati on was appli ed to detect t he geno t ypes o f 23S rRNA do m a i n V o f M y cop las m a pneu m on i ae i n 19c li n i ca l i solates fro m o ropharyngeal s wabs ,and the correspond i ng sequence was sequenced m ean w hil e .R e ference stra i ns FH and 127M y co -p las m a pneu m oniae DNA ex tracti ons from pa ti ent speci m ens tested positi ve by PCR,w it h 5M y cop las m a pneu m oni ae neg a -ti ve DNA extrac tions as contro l s ,w ere detected m acro lide resistant genotypes o f 23S r RNA do m a i n V by the reverse dot -b l o t hybri d izati on m ethod .Resu lt 15stra i ns of the 19cli n i ca l iso l a tesw ere found to possess po i ntm utati ons of A 2063G w i th i n do m a i n V o f the 23S rRNA gene by t he reverse do t -b l o t hybr i diza tion wh ile the other 4strai ns w ere 2063A i n dom ain V o f the 23S r RNA gene .T hese fi ndi ngs we re concordan tw i th sequenc i ng data (K appa consistency test ,P >0.05).Am ong the 127M y cop las m a pneu m oni ae po siti ve DNA ex tracti ons fro m pati ent spec i m ens ,122ex tracti ons w ere found to possess po int m utati ons o f A2063G by the reve rse dot -b l o t hybridization ;2extractions on l y conta i ned A base and 3ex tracti ons possessed both A and G base in do m a i n V of the 23S r RNA gene ;no positi ve resu lt was found i n 5negati ve contro ls .Conc l u si on The reverse do t -b l o t hybr i diza tion w as capable o f detec ting t he A 2063G po i nt mu tati on i n do m a i n V of 23S r RNA of M y co -p las m a pneu m oniae from i so lates and patient spec i m ens .K ey w ords M y cop las m a pneu m oni ae ;PCR;G ene mu tati on ;R everse do t -blot hybr i d i za ti on肺炎支原体(My cop las m a pneu m oniae ,MP)是人呼吸道感染的主要致病原之一,也是引起社区获得性肺炎的常见病原。
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人乳头瘤病毒基因分型（32型）检测试剂盒使用说明书（PCR-反向斑点杂交法）【产品名称】通用名称：人乳头瘤病毒基因分型（32型）检测试剂盒（PCR-反向斑点杂交法）英文名称：Human Papillomavirus Genotyping Kit For 32 Types（PCR-RDB）【包装规格】25人份/盒【预期用途】本试剂盒用于检测宫颈脱落细胞是否感染人乳头瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）并加以分型，对宫颈癌的早期诊断有重要意义。
【检测原理】反向斑点杂交法本试剂根据HPV基因组的特点设计生物素标记的引物，PCR扩增各基因型HPV的目的片段。
将32型HPV特异性寡核苷酸探针固定在尼龙膜上。
根据生物素-亲和素系统（Biotin-avidin system,BAS）原理，将PCR扩增产物与固化在膜条上的探针杂交，洗膜后加入辣根过氧化合物酶标记的亲和素（POD），与PCR产物上的生物素结合。
加入显色液（TMB，H2O2），辣根过氧化物酶催化其底物H2O2分解，TMB作为供氢体参与反应后产生蓝色的斑点。
根据杂交信号斑点的有无来判断样本中是否存在HPV的基因型。
本试剂盒能有效检测WHO确认的32种HPV的基因型，其中包括19种高危亚型：HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82、83型；13种低危亚型:HPV6、11、40、42、43、44、55、61、67、69、70、72、81型。
【主要组成成分】【自备试剂】1、20×SSC:称取175.3gNaCl和88.2g枸橼酸钠二水，用800mL双蒸水溶解，浓HCl调节pH值至7.0，定容至1000mL，高压灭菌，室温保存。
2、10%SDS:将20gSDS溶解在180mL双蒸水中，浓HCl调节pH值至7.0，定容至200mL，高压灭菌，室温保存。
3、1M柠檬酸钠：294.1g柠檬酸钠加纯水800mL溶解，用浓HCl调pH值至5.0，定容至1000mL，室温保存。
4、A液：(2×洗膜缓冲液)将100mL 20×SSC，10mL 10%SDS用双蒸水定容到1000mL。
5、B液：（0.5×洗膜缓冲液)将25mL 20×SSC，10mL 10%SDS用双蒸水定容到1000mL。
6、C液：100mL 1M柠檬酸钠加纯水定容至1000mL。
【储存条件及有效期】核酸扩增组分（试剂盒I）于-20℃以下冷冻保存；杂交组分（试剂盒II）和核酸提取组分于2～8℃冷藏保存；TMB应避光保存。
试剂有效期6个月。
【适用仪器】核酸扩增仪：ABI-Veriti(USA)；Ependorf Gradient(German)；MJPTC-100(USA)；AB9700(USA)等。
分子杂交仪：亚能YN-H16（中国）；FYY-3（中国）等。
【样本要求】1、检查前准备：女性应在非经期；检查前24小时内不要有性行为，不要做阴道冲洗，不要阴道内用药。
2、标本采集：医护人员先以窥阴器或阴道张开器暴露宫颈，用棉拭子将宫颈口过多的分泌物擦去。
取出宫颈刷单方向旋转4~5周以获得足量的上皮细胞样本，然后放入洗脱管中，旋紧洗脱管盖，做好样本标识，保持洗脱管直立放置。
3、标本的保存及运送：标本采集后，为得到准确的实验结果，原则上应尽可能快的送检，室温保存不超过12小时，2～8℃冷藏保存不超过7天，-20℃以下冷冻保存不超过1个月。
如运送时间超过规定的一般要求，必须用冰盒保存送检。
【检验方法】样本检验操作包括三个步骤：核酸提取；PCR扩增；杂交检测。
一、DNA提取：1、在1.5ml离心管中加入1mL细胞保存液保存的宫颈细胞，13000rpm离心5分钟，弃上清，保留沉淀。
2、在细胞沉淀中加入200µL DNA提取液，高速振荡15秒钟，使细胞沉淀与提取液充分混匀。
3、100℃15分钟。
4、室温下13000rpm离心5分钟，上清可以用于PCR反应。
4℃或者-20℃保存备用。
二、PCR扩增1、根据样本数目取出相应的PCR反应管（每个实验设一个阴性对照和一个阳性对照，即样本数+2），依次做好标记。
低速离心数秒后备用。
2、在准备好的PCR反应管中加入5µL已提取的待测样本DNA（阴性对照、阳性对照同步处理），反应总体系为25µL，低速离心数秒。
3.1、PCR扩增条件如下：50℃10min94℃10min94℃30s Array 42℃45s72℃20s94℃30s46℃45s72℃20s72℃三、杂交检测1、膜条准备：根据PCR的反应管数，取出相应数量的膜条和杂交管。
在膜条上用中性笔编号后放入杂交管中，加入8mL的A液，以膜条完全浸没为准；取25µL对应编号的PCR产物加入管中液面以下，拧紧管盖。
2、DNA变性：将杂交管置100℃水浴中变性10min。
（杂交液面要浸没在水浴液面以下。
）3、杂交：将杂交管放入杂交仪中，51℃杂交1.5小时。
（同时将装有40mL B液的50mL杂交管放入杂交仪中预热，每管B液最多洗8张膜条，根据标本的多少放置相应的B液管数量。
）4、洗膜：将膜条取出，放入装有常温B液的小烧杯中涮洗一下，然后将膜条快速转移到已预热至51℃，装有B液的杂交管中。
快速放入杂交仪，于51℃摇洗5min。
（40mL B液最多涮洗8张膜条）5、抗体孵育：将孵育液按照A液：POD=10000:1的比例配制在50mL的杂交管中，将膜条放入孵育液中室温轻摇孵育30min。
（当膜条数目≤8时，20mL A液加2µL POD配成20ml孵育液；当膜条数目＞8时，按1张膜条0.2µL POD的比例配制孵育液。
）6、洗膜：将膜条转入装有40mL A液的杂交管中，室温轻摇洗涤两次每次5min。
7、显色：将膜条放入装有C液的杂交管中，室温摇洗2min；同时配制显色液：19mL C液+1mL TMB+2µL 30%H2O2；将膜条浸没于显色液中避光显色15min，再将膜条转移至蒸馏水中涮洗以下，即可观察实验结果。
（20mL显色液最多显色8张膜条；当膜条数目＞8时，按1张膜条2mL C液的比例配制显色液。
）8、结果判断探针点样的位置顺序如下：依据显色信号的有无和位置判断相应的HPV基因型。
【质量控制程序】阴性质控品的杂交膜条应只有IC位点有蓝色斑点，否则有可能发生污染；阳性质控品需要在相应的HPV基因型位点及IC位点出现蓝色斑点，否则提示PCR扩增或杂交失败。
【检验结果的解释】1、膜条上IC位点出现显色信号IC位点和膜条上其他位点有显色斑点，说明感染了相应基因型的HPV（包括单一感染和混合感染）；检测位点无显色信号，说明未感染本品包含的32种基因型HPV。
2、膜条上IC位点无显色信号膜条上检测位点无显色信号，无法判读结果。
表明本次实验不成功，建议重新实验或重新取样。
单个或多个HPV基因型检测位点出现显色信号，判读为相应位置上标注的基因型阳性。
由于IC和HPV DNA二者在同一PCR反应体系中进行扩增，存在PCR原料竞争，高浓度的HPV DNA可能会对IC扩增产生竞争性抑制。
注：本试剂盒只能对检测对象进行定性分析，以检测位点出现显色信号与否来进行判断，信号点的强弱不能提供定量方面的参考。
【检测方法的局限性】1、本试剂盒可以检测32种HPV基因型，本品不能检测32型以外的其他基因型感染。
2、本试剂盒无法检测病毒载量为1.0×103拷贝/mL以下的样本。
3、检验结果仅供临床参考，如需确诊需综合其他诊断手段。
【产品性能指标】1、分析灵敏度本品对32个基因型进行灵敏度分析，每个基因型3个样本，每个样本包含4个浓度梯度，确定能稳定鉴定出检测范围内HPV的最低检测限为1拷贝/µL。
图1 本产品部分型别灵敏度分析。
注：IC点为人β-globin基因；从上至下每排分别为6，11，16，18，31，33，35，39，45和51型pMD-18T-HPV载体的102、101和100 copies/µL浓度的PCR-RDB结果。
2、测定准确性本品对32个基因型进行准确性分析，每个基因型30个样本，包含高、中、低3个浓度梯度，阳性符合率为100%；对其他常见7种性病病原体（沙眼衣原体，人型支原体，白色念球菌，阴道毛滴虫，梅毒螺旋体，化脓性链球菌及单纯疱疹病毒Ⅱ型）感染的样本进行准确性分析，阴性符合率为100%。
3、分析特异性对其他常见7种性病病原体（沙眼衣原体，人型支原体，白色念球菌，阴道毛滴虫，梅毒螺旋体，化脓性链球菌及单纯疱疹病毒Ⅱ型）进行交叉反应分析，结果无交叉反应。
【注意事项】1、DNA提取液使用前必须充分混匀，细胞沉淀中加入DNA提取液后也必须充分混匀。
★2、配制A、B液时，20×SSC和10%SDS不能同时加入，以免出现结晶。
20×SSC应先用纯水稀释至定容体积的一半，再加入10%SDS，最后定容。
3、室温较低时，A、B液可能会有结晶析出，应先温浴使其溶解后再使用。
4、杂交全过程，避免用手接触膜条，需用镊子夹取膜条边缘。
5、PCR反应体系所用试剂使用前应先低速瞬时离心数秒，然后再开盖使用。
6、显色液要现配现用，显色过程要避光保存。
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