免疫细胞化学实验技能总结概要
医学检验免疫学检验归纳总结
医学检验免疫学检验归纳总结三大免疫结合反应直接凝集反应玻片凝集反应试管凝集反应间接凝集反应间接血凝试验胶乳凝集试验凝集反应P47 明胶凝集试验自身细胞凝集试验抗球蛋白试验直接coombs试验（RBC膜上的不完全抗原）间接coombs试验（血清中的游离抗原）液体内沉淀试验絮状沉淀试验抗原稀释法抗体稀释法方针滴定法免疫浊度测定沉淀反应凝胶内沉淀试验单向扩散试验双向扩散试验免疫电泳技术对流免疫电泳 CIEP火箭免疫电泳RIE免疫电泳IEP免疫固定电泳交叉免疫电泳三大标记技术一、放射免疫：放射免疫：免疫放射：二、荧光免疫技术P81 荧时间分辨荧光免疫测定（方法）双抗体夹心法光免固相抗体竞争法疫分固相抗原竞争法析类型荧光偏振免疫测定测定荧光酶免疫测定（方法）双抗体夹心法双抗原夹心法固相抗原竞争法三、酶免疫技术 P95 酶免疫技术分类均相酶免疫测定EMIT克隆酶测定分析异相酶免疫测定异相液相酶免疫测定固相酶免疫测定酶联免疫吸附试验ELISA （方法）Ab 双抗体夹心法双位点一步法竞争法Ag 间接法双抗体夹心法竞争法捕获法其他标记技术化学发光免疫分析技术 CLIA 直接化学发光免疫分析CLIAP109类型化学发光酶免疫分析CLEIA电化学发光免疫分析ECLIA 生物素，亲和素放大技术固相膜免疫测定免疫试验IFA免疫层析试验 ICA膜免疫测定的种类斑点酶免疫吸附试验 DOT-ELISE酶联免疫斑点试验 ELISPOT免疫印迹法 IBT/EITB放射免疫浊度试验 RIPA免疫细胞1、分离方法外周血单个核细胞分离 PBMCP161淋巴细胞分离贴壁粘附法吸附柱滤过法磁铁吸引法Percoll分离液法T细胞和B 细胞的分离 E花环沉降法尼龙毛柱分离法T细胞亚群分离亲和板结合分离法磁性微球分离法荧光激法细胞分离仪分离法2、免疫细胞表面标志的检测方法抗体致敏细胞花环法P174 免疫细胞化学法免疫荧光法FCM3、功能检测 T 细胞增殖试验方法形态学P178 3H-TdR掺入法淋巴细胞 T细胞 MTT比色法CFSE（活细胞染料）T细胞分泌功能检测T细胞介导的细胞毒性试验体内试验B细胞：B细胞增殖试验、溶血空斑实验、ELISPOT、体内试验NK细胞：..........。
免疫学实验技巧分享
免疫学实验技巧分享免疫学实验是生命科学研究中的重要组成部分，对于揭示免疫机制、诊断疾病以及研发免疫治疗方法都具有至关重要的意义。
在进行免疫学实验的过程中，掌握一些实用的技巧可以大大提高实验的成功率和准确性。
接下来，我将为大家分享一些在免疫学实验中积累的宝贵经验。
一、实验前的准备（一）实验设计在开始实验之前，一定要进行详细的实验设计。
明确实验的目的、预期结果以及所需的实验步骤。
同时，要考虑到可能出现的误差和干扰因素，并制定相应的应对措施。
合理的实验设计是实验成功的基础。
（二）试剂和材料的选择选择高质量、可靠的试剂和材料至关重要。
对于抗体、细胞因子等关键试剂，要选择知名品牌，并仔细查看其说明书，了解其适用范围、保存条件和使用方法。
此外，实验中使用的耗材，如移液器枪头、离心管等，也要确保无菌、无杂质。
（三）仪器设备的校准和维护定期对实验中使用的仪器设备进行校准和维护，如移液器、离心机、酶标仪等。
确保仪器的准确性和稳定性，能够有效减少实验误差。
二、细胞培养技巧（一）细胞的复苏细胞复苏是细胞培养的第一步，操作不当容易导致细胞死亡。
从液氮中取出细胞冻存管后，要迅速放入 37℃水浴中，轻轻摇动使其快速融化。
融化过程中要避免水没过管盖，以免造成污染。
待细胞完全融化后，将其转移至离心管中，加入适量的培养基，离心去除冻存液，然后将细胞重悬并接种到培养瓶中。
（二）细胞的传代当细胞生长至 80%－90%汇合度时，需要进行传代。
传代前要先对细胞进行消化处理，常用的消化酶有胰蛋白酶和 EDTA 等。
消化时间要根据细胞的类型和状态进行调整，一般控制在 1-5 分钟。
消化结束后，加入适量的培养基终止消化，轻轻吹打细胞使其分散，然后按照适当的比例进行传代。
（三）细胞的冻存为了长期保存细胞，需要进行冻存。
冻存细胞时，要先将细胞消化、离心，然后用含有 10%DMSO 的冻存液重悬细胞，将细胞分装至冻存管中，缓慢降温至－80℃，最后转移至液氮中保存。
免疫组化常用方法介绍及个人经验总结
免疫组化常用方法介绍及个人经验总结1 、定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。
2 、原理根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。
3 、分类1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。
2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。
与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。
3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP 法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。
4 、目前几种常用免疫组化方法简单介绍1）免疫荧光方法是最早建立的免疫组织化学技术。
它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。
当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。
由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。
免疫细胞功能检测技术知识分享
（3）MTT比色法
淋巴细胞DNA合成期 3HTdR掺入 测定细胞内的3H
SI=
PHA刺激管cpm均值 对照管cpm均值
优点：敏感性高，客观性强 重复性好
缺点：设备条件 放射性核素污染
培养终止前加入MTT 测定溶解的甲？
试验孔A均值 SI对照孔 57A 0n均 m 值
570nm
优点：操作简便，无放射性污染 缺点：敏感性低于3H-TdR掺入法
优点：敏感性高，客观性强 重复性好
缺点：设备条件 放射性核素污染
培养终止前加入MTT 测定溶解的甲臜
试验孔A均值 SI对照孔 57A 0n均 m 值
570nm
优点：操作简便，无放射性污染 缺点：敏感性低于3H-TdR掺入法
(二) T细胞分泌功能测
体外培养的T细胞经各种丝裂原或抗原刺激后,分泌各 种细胞因子,可借助免疫学、细胞生物学及分子生物学技 术分别检测细胞因子含量、生物学活性或基因表达水平， 以反映T细胞功能。
第二节 吞噬细胞功能
检测技术
一、中性粒细胞功能检测技术 二、巨噬细胞功能检测技术
大吞噬细胞： 单核巨噬细胞系统
小吞噬细胞： 中性粒细胞
趋化 吞噬 胞内杀伤作用
一、中性粒细胞功能的检测
1
细胞趋化功能的检测
2
吞噬和杀菌功能的检测
（一）趋化功能检测
原理
中性粒细胞
方法
滤膜渗透法
微生物细胞成 分及代谢产物 补体活性片段 细胞因子等
本章内容
免疫细胞功能检测技术 淋巴细胞的功能检测
吞噬细胞功能检测技术 免疫细胞功能检测的临床应用
一、T细胞功能的检测
1
T细胞增殖试验
2
T细胞分泌功能测定
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。
如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。
就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。
2、免疫组化最大的优势是定位和定性。
相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。
尤其对于有些因子的转位研究十分有用。
3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。
免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。
4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。
阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。
前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。
5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。
如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。
当然也不能做假阳性或假阴性结果。
6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。
我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。
失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。
免疫化学技术
8 免疫化学技术8.1 免疫化学技术简介现代免疫化学是研究抗原与抗体的组成、结构以及抗原和抗体反响的机制。
此外，还研究体内其他免疫活性物质，如补体分子的组成、结构及其功能。
目前，免疫化学已应用于免疫性疾病发病机制的根底研究和临床检测等。
随着免疫化学、细胞生物学及分子生物学的进展，免疫学实验技术也迅猛开展，并已成为当今生命科学研究的重要手段，尤其是在医学根底研究和临床实践中得到广泛应用。
免疫学检测方法可分为体液免疫测定及细胞免疫测定。
前者主要是根据抗原与相应抗体能在体外发生特异性结合，并在一些辅助因子的参与下出现沉淀、凝集及溶化等反响，从而采纳抗原检测未知抗体，或用抗体检测未知抗原。
此外，尚包含检测体液中各种可溶性免疫分子，诸如补体、各类免疫球蛋白、循环免疫复合物、溶菌酶、各种细胞因子等。
细胞免疫测定则是根据各种免疫细胞〔T细胞、B细胞、K细胞、NK细胞及巨噬细胞等〕外表所具有的独特标志及其各自的特别功能，在体外〔有时亦可在体内〕测定上述各种细胞及其亚群的数量和功能，以援助了解机体的细胞免疫水平。
本章节仅限于介绍几种主要的免疫化学实验技术的根本原理及实验操作方法。
8.2 抗原的免疫原性和专一性抗原与免疫原：抗原〔antigen,Ag〕是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答，并能与相应免疫应答产物即抗体和致敏淋巴细胞在体内或体外发生特异性结合的物质，也称为免疫原〔immunogen〕。
前一种性能称为免疫原性〔immunogenicity〕或抗原性〔antigenicity〕，后一种性能称为反响原性〔reactogenicity〕或免疫反响性〔immunoreactivity〕。
抗原的分类：根据抗原物质所具备的性能可分为完全抗原〔complete antigen〕和半抗原〔hapten〕两类。
同时具有免疫原性和免疫反响性的抗原称为完全抗原，如细菌、病毒、异种动物血清等。
仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反响性，而无免疫原性的物质称为半抗原，如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质，它们本身不具免疫原性，但当与蛋白质大分子结合后形成复合物，便获得了免疫原性，这种与半抗原结合并给予它免疫原性的蛋白质大分子称为载体〔carrier〕。
临床检验师-免疫组织化学技术考点总结
免疫组织化学技术考点总结免疫组织化学技术又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。
第一节概述免疫组织化学的基本过程包括：①抗原的提取与纯化；②免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；③将标志物与抗体结合形成标记抗体；④标本的处理与制备；⑤抗原抗体免疫学反应以及标志物呈色反应；⑥观察结果。
一、标本的处理（一）标本的主要来源1.活体组织：应取材于病变组织及病变与正常组织交界处，大小适中。
减少对组织标本的损伤与挤压。
2.体液、穿刺液：可直接涂片或经离心后取沉淀物涂片。
3.培养细胞：悬浮培养的细胞经离心沉淀后做细胞涂片，盖玻片上的单层培养细胞直接固定。
（二）标本的固定与保存1.标本固定的目的：使细胞内蛋白质凝固，细胞内分解酶反应终止，以防止细胞自溶，保持细胞形态和结构；保存组织细胞抗原性；防止标本脱落；除去妨碍抗体结合的类脂，便于保存；抑制组织中细菌的繁殖，防止组织腐败和在后续组织制备中的细胞结构和成分的改变。
标本的固定应以不损伤细胞形态，不干扰固定后抗原的识别和结合为原则。
2.固定剂的选择：蛋白质类抗原，可用乙醇或甲醇固定；微生物抗原可用丙酮或三氯化碳固定；如需除去病毒的蛋白质外壳，可使用胰蛋白酶；多糖类抗原用10%福尔马林固定或以微火加热固定；如有黏液物质存在，应用透明质酸酶等处理除去；类脂质丰富的组织进行蛋白、多糖抗原检测时，需用有机溶剂（乙醚、丙酮等）处理除去类脂。
组织标本常规固定液为中性缓冲甲醛。
3.制片方法的评价：冷冻和石蜡切片是免疫组化最常用的制片方法。
首选冷冻切片。
其操作简便，可避免石蜡切片因固定（甲醛）、脱水、浸蜡等对抗原所造成的损失，适用于不稳定的抗原。
石蜡切片是研究形态学的主要制片方法，它不但是观察组织细胞结构的理想方法，而且可用在陈旧石蜡包埋材料免疫组化的回顾性研究。
免疫细胞实验技术
2、抗体形成细胞测定： 溶血空斑试验
溶血空斑形成试验 (hemolytic plaque assay, HPA) 即B细胞功能的一种方法，由Jerne创建，主 要用于测定药物和手术等因素对体液免疫功 能的影响，评价免疫治疗或免疫重建后机体 产生抗体的能力。
1)经典溶血空斑形成试验 用于检测实验动物抗体形成细胞的功能。
五、吞噬细胞的分离和收集
1）Percoll分离法或洗淘法 此法从外周血中分离出单核-巨噬细胞， 但由于此类细胞在外周血中的含量较低， 分离时所需的血量较多。
2）斑螯敷法
此法可从人体组织液中获取较纯的吞噬细 胞。 方法是：用滤纸蘸取10%中药斑螯酒精浸 出液，贴敷在臂内侧皮肤表面，4~5小时后皮 肤局部充血，48小时后局部形成水泡，吸取 水泡中的组织液，内含大量巨噬细胞。但此 法对病人皮肤有一定损伤，有时可引起局部 感染。
（3）细胞能量代谢测定（MTT比色法）：
活的增殖细胞在能量代谢过程中产生琥珀酸脱 氢酶，使黄色可溶性的MTT（四甲基偶氮唑盐）还 原为蓝黑色的不溶性结晶状甲臢，其生成量与细 胞代谢活跃程度呈正比，由此可间接定量分析细 胞增殖水平。 此法敏感性与125I-UdR掺入法大致相同，且经 济、简便、无放射性污染。
方法：将包被有关抗体的磁珠与待分离细 胞充分作用，这样借助于抗体磁珠，将与相应 的细胞结合成：细胞－抗体－磁珠复合物，该 细胞在磁场中运动与其他细胞产生明显差别。 如采用层析的方法，将层析柱放于强磁场中， 与磁珠结合的细胞运动将受限，而未与磁珠结 合的细胞将先被洗脱下出来，再将该柱移出磁 场，与结合的细胞也将被洗脱下来，达到分离 目的。
2、T细胞介导的细胞毒试验
方法学原理： ① CTL 来源：免疫动物脾脏或腹腔渗出液；或将脾 细胞与刺激细胞共同孵育，在体外诱生CTL； ②刺激细胞：预处理后失去增殖能力但仍具有免疫 原性的细胞； ③检测CTL细胞毒活性： 形态学检测法、放射性核素（ 51 Cr、125I-UdR） 释放法、乳酸脱氢酶释放法及流式细胞术等。
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透明
置换组织内的脱水剂，为下一步的浸蜡起到桥梁作用； 二甲苯：是现在应用最广的一种透明剂，价格较便宜，不能 和水混合，遇水则变成乳白色浑浊，因此必完全脱水后才
能使用；易溶于酒精又能溶解石蜡，透明力强；
其最大的缺点是容易使组织收缩变硬变脆，所以组织不能在 其停留过久，透明时间视组织块的大小、性质而定；有的 组织如肌肉、肌腱、软骨、骨、皮肤、头皮及眼球等，不 宜用二甲苯透明，因组织过硬不易切片；长时间接触，对
粘膜有刺激作用。
浸蜡
（1）浸蜡的目的 置换组织中的透明剂，为包埋做准备。 （2）注意事项 温箱中的温度必须严格控制在60℃的范围，不能 超过60℃；浸蜡时间不宜过长。 浸蜡温度过高或时间过长使组织收缩过度收缩和脆 变。
价格昂 贵；有 毒
混合固定剂 （1）Bouin氏固定液：为常用的良好的固定剂，穿透速度快， 组织收缩性较小，固定均匀，固定后组织有适当的硬度， 对于切片和染色均有良好的效果。一般固定12~24小时，
固定后入70%酒精洗去苦味酸的黄色，在脱水时经各浓度
酒精也可洗去黄色。 （2）Carnoy液：渗透力强，特别适宜于固定染色体、肝糖、 粘液等一些较为细微的结构。显示DNA、RNA效果良好。 （3）改良Bouin氏固定液：此液对一般组织固定效果都很好， 固定时间为4~18小时，固定后直接放70%乙醇脱水，固定 时间较长对组织亦无损害。
(horseradish peroxidase)等。
标记同位素的称为 放射免疫法 ，常用的同位素有 3H 、
14C、32S和31P等。
讲解提纲
一、石蜡切片/冰冻切片
二、免疫酶/免疫荧光 三、酶联免疫吸附试验
（1）石蜡切片的制作
取材、固定 洗涤 酒精脱水
蒸馏水洗涤2遍
50％、 70％ 、80％酒精各15 min ，95％ 酒精Ⅰ、Ⅱ各15 min， 无水乙醇Ⅰ 、Ⅱ各 15 min，无水乙醇/二甲苯(1:1) 15 min 二甲苯约20min、二甲苯/石蜡(1:1) 30min, 纯蜡Ⅰ、Ⅱ各30min 常规石蜡切片，切片厚度为7 µm 于干净载玻片上进行展片，37℃烤干
透明、浸蜡
包埋、切片 展片、烤片
取材
根据不同的实验目的，选择相应的材料，材料要 求新鲜、准确、完整，材料要避免挤压、挫伤、 干枯。 所采集材料应立即放入固定液，并编号，注明采 集时间、名称、组织部位，所取组织块要大小适 当，即要能说明问题，又要考虑固定剂的穿透能 力。 如：角膜、TE-HC等组织材料 细胞材料 肝脏、鱼卵
免疫化学相关实验
技能
Hale Waihona Puke 1、定义 用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中
某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定
性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学
（ immunohistochemistry ）技术或免疫细胞化学
（immunocytochemistry）技术。
2、原理 根据抗原抗体反应和化学显色原理 , 组织切片或 细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标 记生物素、荧光素等的二抗进行反应，最后通过呈 色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光
固定时应注意的事项
（1）固定液及被固定的组织必须新鲜； （2）固定液的用量一般为组织体积的10~20倍，容器不 要过小，材料也不要太多；应避免组织紧贴瓶底或瓶壁， 以免影响固定液的渗入； （3）固定时间视组织块的种类、性质、大小，固定液的 种类、性质、渗透力的强弱，固定时的温度的高低，实 验目的等； （4）固定所用的固定液，以新配的为好，放置过久会失 效； （5）在固定期间摇动组织或摇动容器有利于固定液的渗 入，对长期固定的标本，可经常更换固定液;
10%甲醛 4%多聚 甲醛 固定效果 好 好
名称
苦味酸 沉淀一 切蛋白 大 不单独 使用
冰醋酸 对染色 质固定 好 小 不单独 使用--核型 使组织 膨胀， 一般不 单独使 用
锇酸 好
组织收缩
大
小 免疫化 学
小 电镜
主要用途 常规病理 切片 缺 点
长期用其 固定的 渗透力 固定的组 时间不 弱，对 织变为酸 宜太长， 组织收 性不利于 以24小 缩大 染色，特 时以内 别是细胞 为宜 核的着色
（2）组织块在高浓度，特别是无水乙醇内不能放置 的时间太长。无水乙醇吸水能力太强，容易造成组 织块的过度硬化，使得切片病理组织易碎裂。
（3）在脱水的过程中可以将组织块停留在70%~80% 的酒精中。
（4）每次更换新的脱水剂时（组织块从低浓度到高 浓度），都要把组织块放在吸水纸上吸干，以免将 水及低浓度脱水剂带入高浓度脱水剂中，影响脱水 效果。
固定的目的和作用在于：
①防止组织自溶和腐败； ②使细胞内的蛋白质、糖、脂肪等各种成分沉淀保 存下来从而保存细胞的各种组成成分使其保持与 生活时相近似的形态和结构；
③因沉淀及凝固的关系，使细胞内不同的成分产生 不同的折光率，造成光学上的差别，使原来在生 活情况下看不清楚的结构变得清晰易见，且有的 固定剂还有助染作用(如醋酸、苦味酸)，从而使细 胞各部易于染色； ④固定剂还兼有硬化作用，使柔软组织硬化而不易 变形，有利于操作。
学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的
抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切
片上原位确定某些化学成分的分布和含量。
常用的标记物有荧光素、酶和放射性同位素：
标记荧光素的称为免疫荧光法，常用的荧光素有异硫氰 酸荧光素(FITC)、罗丹明(rhodamine)等。
标记酶的称为 免疫酶法 ，常用的酶有辣根过氧化物酶
固定
取材后，应立即进行固定。固定是制片极为关键 的一个步骤，制片质量的优劣除与材料的新鲜程度 有关外，还取决于最初的固定是否适当和完全。
固定的意义 新鲜的组织被割取后,由于细胞内酶的作用和细菌 的繁殖，可引起组织的自溶和腐败。因此，割取组 织块后，应立即采用一种方法．将组织尽可能保持 原有的形态结构，且有利于保存和适于制片的操作， 这一步骤称为固定。
（6）取材固定应同时作好记录，包括组织名称、固定液 和时间等内容。
脱水
乙醇：高浓度的酒精对组织有强烈收缩及脆化的缺
点，因此用乙醇脱水不能直接入纯酒精中脱水，
而必须经过由低到高的一系列不同浓度的酒精，
逐渐取代组织中水分，以保证组织脱水彻底，并
避免组织过度收缩和硬化。
注意事项：
（1）脱水的时间应根据组织块的大小和组织的类型 而定。