拟南芥原生质体的提取和转化
拟南芥原生质体的提取和转化
拟南芥原生质体的提取和转化拟南芥原生质体的提取和转化(1)取4周后抽薹前的叶片，切成1mm宽的长条，置于甘露醇溶液（称1.82g D-甘露醇于20ml双蒸水中）；共需叶片约90片；(2)将步骤1中细条捞出，置于酶解液中；避光，23℃,40-50rpm 摇床上酶解3小时；(3)酶解液过100-200目的筛子，收集滤液，置于15ml离心管中，均分为两管；于4℃，60g，离心15min；(4)原生质体用冰冷W5溶液轻柔洗涤，每管4ml；4℃，100g，离心1min；(5)弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔悬浮，每管4ml；冰上放置30min；(6)23℃，100 g离心1min；弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg 重悬；以下操作均在23℃下进行：(7)取约10-20ug 质粒于1.5ml EP管中，加100ul 步骤6中的原生质体；用200ul 枪头（剪去前端）轻柔混匀；(8)加入110ul PEG/Ca 溶液，轻柔混匀；放置20-30min；(9)加入0.44ml W5 溶液，来回颠倒混匀；23℃，100 g，1min，brake 设为4-5；(10)弃上清，加100ul W5，混匀；加900ul W5，混匀；(11)上述混合液体置于六孔板内，23℃，避光，孵育6-18小时。
(1)酶解液：cellulose R10 15%Macerozyme R10 0.3%Mannitol 1.09gKCl 0.3MMES 0.3M调节pH值到5.7，55℃加热10min，冷却到室温再加入下列溶液CaCl20.15Mβ-巯基乙醇0.75mM(2)PEG溶液（40%，v/v）PEG4000 1g0.8M Mannitol 0.625ml1M CaCl2 0.25m(3)W5溶液154mM NaCl 9.0g125mM CaCl218.4g5mM KCl 0.37g5mM glucose 0.9g0.03%MES 0.3g用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌(4)MaMg溶液1M MgCl20.5ml0.1%MES 0.1g0.4M Mannitol7.3g用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌。
原生质体制备
拟南芥原生质体制备转化方法选取开花前生长良好情况的拟南芥（Columbia型）叶片，用刀片切成0.5-1 mm宽的叶条；浸于配置好的酶解液中（每5-10 mL酶解液约10-20片叶子）；暗箱抽真空，30 min；转移至室温，继续黑暗酶解3-5 h；当酶解液变绿时轻轻摇晃培养皿促使原生质体释放；加入等量的W5溶液稀释酶解液；用60-100目筛子（W5溶液润湿）过滤酶解液；将滤液转移至30 mL eppendorf管，500-700 g离心1-2 min，弃上清；加入10 mL预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体；放于冰上静置30 min；保持室温在23℃以下；500 g离心8-10 min，弃上清；加入1 mL MMG溶液重悬原生质体（使其终浓度约在2×105个/mL）；即得到原生质体溶液。
用移液器吸取100 L的以上原生质体溶液于1.5 mL eppendorf管，加入10L DNA（10-20 g的质粒DNA），轻柔混合后，加入110 L PEG溶液，轻柔拍打eppendorf管使其混合完全；室温下诱导转化5-15 min；加入400-440 L W5溶液稀释转化混合液，轻柔颠倒，使之混合完好以终止转化反应；500 g离心2 min，弃上清；加入1 mL W5溶液悬浮清洗，500 g 离心2 min，弃上清；再用1 mL WI溶液轻柔重悬原生质体；室温（20-25℃）下，诱导载体表达18小时以上。
相关溶液配制PEG4000溶液（现用现配）组分用量PEG4000 1 g1 M CaCl20.25 mL0.8甘露醇0.625 mL水0.75 mL纤维素酶解液试剂15 mL酶液体系1-1.5 % Cellulase R10 (YaKult Honsha) 0.225 g 纤维素酶0.2-0.4 % Mecerozyme R10 (YaKult Honsha) 0.045 g 果胶酶0.4 M 甘露醇 1.09 g甘露醇干粉20 mM KCl 1 mL 0.3 M KCl20 mM MES, pH5.7 1 mL 0.3 M MES，pH5.7加水10 mL55℃水浴加热10 min，冷却至室温后加入以下试剂10 mM CaCl2 1 mL 0.15 M CaCl20.1% BSA 1 mL 1.5 % BSA5 mM β-巯基乙醇1mL 75 mM β-巯基乙醇用0.45 m滤膜过滤后即可使用。
大量提取拟南芥保卫细胞原生质体方法的优化
大量提取拟南芥保卫细胞原生质体方法的优化梁芸;孙宁;魏凤菊【摘要】保卫细胞在植物的生理和发育过程中发挥着重要作用,由于拟南芥作为研究材料自身的优越性,其保卫细胞成为研究信号转导机制的良好系统,对于基因组学和蛋白质组学分析具有重要意义.然而,大量获取保卫细胞原生质体存在一定的难度.本研究以拟南芥为材料,在两步酶解法的基础上,改用更加经济的纤维素酶,摸索酶浓度及酶解时间,旨在获得一套可以快捷、高效、低成本提取保卫细胞原生质体的方法.结果表明:黑暗条件下,22℃,酶解液Ⅰ酶解1h,酶解液Ⅱ(纤维素酶Onozuka R-10浓度2.5％)酶解2h,可最大量地收集原生质体.【期刊名称】《河北农业大学学报》【年(卷),期】2014(037)005【总页数】6页(P12-17)【关键词】保卫细胞;原生质体;大量提取;优化【作者】梁芸;孙宁;魏凤菊【作者单位】河北农业大学生命科学学院,植物逆境研究室,河北保定071001;河北农业大学生命科学学院,植物逆境研究室,河北保定071001;河北农业大学生命科学学院,植物逆境研究室,河北保定071001【正文语种】中文【中图分类】Q943气孔是植物进行气体交换的门户，由叶片表皮上的一对保卫细胞组成，可以响应多种外界刺激，如光、干旱和病原菌侵染等［1－4］。
一直以来，气孔是研究信号转导机制的重要模式系统。
多重外界刺激调节着气孔的运动［5－6］。
在保卫细胞中发现了许多与信号转导相关的蛋白质［7－8］，但是信号通路中的许多受体和一些信号相关组分在分子水平上仍然有待研究［9］。
目前关于保卫细胞内特异表达基因的研究还很有限［10－11］，保卫细胞的分子调节机制还不是十分的清楚。
原生质体是指去除细胞壁的细胞，保卫细胞原生质体（Guard Cell Protoplasts，GCPs）是研究气孔运动分子机制、膜透性和离子转运过程的重要材料。
通常将原生质体与膜片钳技术相结合［12－14］来研究膜电位变化；或通过转化GFP等荧光标记基因进行目的基因的亚细胞定位。
模式植物拟南芥
TTG1
正
GL1
调
节
GL3
因 子
负 调 节 因 子
EGL3
GL2
模式植物拟南芥
TRY CPC ETC1
ETC2 ETC3 TCL1 TCL2
表皮毛发生调控机制
R3 MYB
R3 MYB
模式植物拟南芥
(二) 植物激素
Gibberellin
GA
Salicylic acid
SA
Cytokinin
CTK
jasmonic acid
/
ABRC: The Arabidopsis Biological Resource Center NASC: European Arabidopsis Stock Center
模式植物拟南芥
实验技术-原生质体转化
模式植物拟南芥
• 拟南芥原生质体瞬时转化
原生质体是一种常用的植物瞬时表达系统，结合一些报告 基因使用，它具有检测速度快、操作简单等优点。
2. bHLH类转录因子：
GLABRA3 (GL3), ENHANCER OF GLABRA3 (EGL3)
3. 含WD40重复序列的转录因子：
TRANSPARENT TESTA GLABRA1 (TTG1)
模式植物拟南芥
4. C2H2类转录因子：
GLABROUS INFLORESCENCE STEMS (GIS) ,GIS2, Zinc Finger Protein 5 (ZFP5), ZFP6, ZFP8
模式植物—拟南芥
模式植物拟南芥
• 拟南芥简介 • 实验技术-原生质体转化
模式植物拟南芥
• 所谓模式生物是指生物的一个物种，它在人们研 究生命现象的过程中长期、反复的被作为研究材 料，并且，从这个物种的研究中得出的许多生命 活动规律往往代表了许多物种共同的规律。于是 人们在对该物种的形态、解剖、生理、生化、细 胞及遗传进行全面分析和归纳的基础上，把它作 为典范，将对其研究中得出的规律，推演到相关 的生物物种中，从而加快了对其它各种生物研究 的步伐。
植物DNA提取——拟南芥
【实验目的】1、采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA，并用PCR方法鉴定T-DNA插入纯合突变体和琼脂糖凝胶电泳。
2、掌握CTAB法从植物叶片中提取DNA的原理和方法。
3、掌握应用PCR技术扩增目的基因的原理和方法。
4、掌握琼脂糖凝胶电泳的操作和原理及分析方法。
【实验原理】DNA是分子生物学研究的基本材料，依不同实验目的采取相应的抽提DNA方法，获取数量、质量不等的DNA。
CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，也称六癸基三甲基溴化铵)是一种非离子去污剂，用CTAB法抽提植物总DNA，操作简便、快速、产量高，但纯度稍次，适用于一般分子生物学操作。
在DNA提取过程中，第一步就是使组织细胞破裂后释放出DNA，第二步就是DNA与其他细胞组分如蛋白质、碳水化合物、膜和细胞壁相分离。
在这个方法中，植物细胞首先在液氮中冰冻，然后用研钵或植物粉碎机研磨，使组织细胞破裂后释放出D14A。
研磨好的组织置于预热的1．5×CTAB(高盐1．05mol/L NaCl)缓冲溶液中，加热至65℃。
此时CTAB可与核酸形成复合物，这种复合物在高盐(＞0．7mol/L)溶液中是可溶的，并且可以稳定存在，而细胞壁纤维和大部分变性蛋白质则沉淀，从而从DNA中去除污染物，而部分蛋白质及多糖(酶抑制剂)仍溶于溶液中。
β-琉基乙醇可抑制多酚氧化酶的氧化，防止植物组织发黄变褐。
经过初次保温后，氯仿／异戊醇抽提就可除去仍溶于溶液中的蛋白质、多糖，最后用乙醇沉淀DNA(CTAB-核酸复合物在低盐溶液中因溶解度降低而沉淀)，并洗去CTAB。
分离纯化核酸总的原则，一是要保证核酸一级结构的完整性；二是要排除其他分子的污染。
抽提的DNA中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子，且其他生物大分子的污染应降到最低程度。
Ti质粒和T-DNA：Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。
拟南芥培养及遗传转化
拟南芥待转化植株培养及遗传转化一实验目的：获得待转化拟南芥植株并进行花序浸润转化植株。
二实验材料：拟南芥种子（拟南芥的生态型最好是Col-0或者Ws-O，Nd-O，No-O），25cm3花盆，15ml离心管，10ml吸管，Agar，乙醇，次氯酸钠，利福平，Silwet L-77，营养液配方所需试剂，营养土，蛭石，塑料薄膜，托盘等。
三实验步骤：1 待转化植株培养⑴种子消毒：20μl种子装入1.5ml离心管内，加1ml 75% 乙醇消毒1分钟；吸去乙醇，加入1ml 1%次氯酸钠，震荡洗涤15-20分钟；稍离心使种子沉于下部，吸去次氯酸钠，加入无菌蒸馏水清洗（清洗3次，每次洗完后稍离心，吸净水分）；均匀撒播于MS培养基平板上，注意每次洗脱用V ortxe充分混匀。
⑵春化作用：将MS培养基放到4℃冰箱中放置2天。
⑶将MS培养基放置在23 0 C/20 0 C光照培养箱16h/8h培养，在有3~5片成熟叶片后，移栽生长良好的拟南芥幼苗至用营养液浇灌过的营养土和蛭石（4:6）中生长，营养土和蛭石分装在25cm3的小培养皿中，保湿7天左右，湿度为60%~80%。
在生长期间适当浇灌营养液，按需要没3-4周一次（或者时间更长）。
⑷为了在每个植株上得到较多的花芽，当大多数植株第一个花序形成后剪去第一个花序，解除顶端优势，促使多个次生花序的同步出现。
当大多数花序约1~10cm高（剪主序后4~8d）时准备浸润。
表1 MS培养基注意事项：①溶化琼脂：用粗天平分别称取琼脂5.5g、蔗糖20 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入750 mL蒸馏水，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。
然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至1000 mL，搅拌均匀。
②调节PH至5.7~5.8。
表2 营养液配方（无需调节PH）成分含量（mol/L）Ca(NO3)2·4H2O 1.01×10-3NH4H2PO4 1.30×10-4KNO3 5.10×10-3MgSO4·7H2O 4.98×10-4NaOH 3.13×10-5Fe-EDTA 2.24×10-5H3BO39.68×10-6Mncl2·4H2O 2.03×10-6CuSO4·5H2O 2.1×10-7MoO3 1.39×10-7Co（NO3）2·6H2O 8.59×10-8NH4NO3 2.93×10-52 农杆菌的培养取出保种的农杆菌菌液活化后，挑取农杆菌单菌落接入10mL无菌LB液体培养基中（一般含75mg/ L利福平、100mg/ L链霉素和100mg/ L卡那霉素），28℃恒温下250r/ min 振摇过夜培养。
拟南芥转化简易操作
拟南芥转化简易操作（滴染）热带农科院热带生物所的庞永奇向我们介绍了一种拟南芥转化的简易操作。
背景：拟南芥转化大体分为浸花、喷洒及滴染几种，主要是将农杆菌菌液重悬至一定浓度进行侵染，使用中各有优缺。
本人在研究中感觉滴染效果较好，并在实践中做了些简略与细化。
方法改进：摇菌3～5mL过夜，1.5mL管集3mL菌，以1mL渗入缓冲液（1/2MS大量、5%（W/V）蔗糖、0.02～0.05%silwet L-77）重悬，吸取调好的农杆菌菌液滴于每一簇刚露白的花蕾处。
做好标记后直接放回光照培养。
一周内对所转植株进行二次重复侵染转化。
约两三周会有第一批几个荚成熟，直接取了进行筛选，效果好的话一般可以筛到几株至几十株阳性苗。
后续的种子当然也要收着。
结果：一般情况下只需转化2～8株即可筛选获得十几或几十个转基因阳性株系。
单株可以分不同侧枝进行，效果也还不错。
一定要注意苗的生长状况，温度失控、虫害以及打药都可能造成不得影响。
新配的悬浮液浸润效果要好些，浸花时要保证溶液浸入。
http:/newsf/2010-8/2010820173025393.htm拟南芥转化（浸泡）1.准备工作：250mL LB（装锥形瓶中）500mL 5%蔗糖50mL离心管5-6个灭菌转化一般在剪花后一周左右烧杯（500mL）、玻璃棒2.（1）农杆菌活化 5 mL LB +15uL Rif(20mg/mL)+3.75uL Kan(100mg/mL)+200uL菌液。
即：5 mL LB液中（含Rif 60ug/mL;Kan 50ug/L）。
28℃摇床过夜。
（2）将活化的农杆菌液转至250uL LB液中。
LB（250mL）+750uL Rif +187.5uL Kan +5mL预培养的菌液，28℃摇1-2d,至色。
（3）5000rpm;10min. 去上清，加5%蔗糖悬浮沉淀（剩一两管）加至烧杯，混匀，调OD值为0.5—0.8之间（0.7—0.8为最佳）加150uL表面活性剂silwet，混匀浸泡花90s包上保鲜膜，倒放16—24h,保湿正常培养，收种种子的筛选：MS板加入50uL/mL Kan 即可。
拟南芥转化
拟南芥的遗传转化（花序浸泡法）
1.培养基
YEP培养基：蛋白胨10g/L 酵母提取物10g/L
NaCl 5g/L 固体琼脂粉15g/L
2.拟南芥材料
培养拟南芥直到它们开始抽苔并产生花序（为了让植株产生更多不成熟的花序，需要推迟转化实验，将抽出的第一个苔剪去，以便于莲花座上腋芽分化出的第二花序的增值）。
3.拟南芥的遗传转化
1)含有目的基因的双元载体转化农杆菌，并接种当菌斑到5ml含有
适当抗生素的YEP液体培养基中，28℃培养2天。
2)再将这一培养基内注入500ml带有适当抗生素的YEP液体培养
基，并在28℃条件下培养16-24小时，使用生长达到稳定期的细胞（OD=1.0-1.6）
3)室温下4000rpm离心10分钟，收集农杆菌细胞，然后加入新制的
5%蔗糖，轻轻悬浮细胞，使OD =0.6-0.8
加入Silwet L-77至浓度0.05%，立刻混匀。
将农杆菌悬浮细胞转移到大的平皿中，用于侵染。
注：Silwet L-77可能有毒，腰带手套保护皮肤。
4)倾斜植株，使所有的花序都浸泡在农杆菌溶液中，浸泡时间1.5-2
分钟，取出后轻轻煽动10秒，控干3-5秒，将植株横放，暗处培养16小时，再恢复光照。
5)为了提高转化效率，可以浸泡植株两次，中间相隔7天。
6)分株收种子，并在含有合适抗生素的MS培养基上萌发，筛选得
到T1转基因拟南芥。
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拟南芥原生质体的提取和转化
(1)取4周后抽薹前的叶片，切成1mm宽的长条，置于甘露醇溶液（称1.82g D-甘露醇于
20ml双蒸水中）；共需叶片约90片；
(2)将步骤1中细条捞出，置于酶解液中；避光，23℃,40-50rpm摇床上酶解3小时；
(3)酶解液过100-200目的筛子，收集滤液，置于15ml离心管中，均分为两管；于4℃，
60g，离心15min；
(4)原生质体用冰冷W5溶液轻柔洗涤，每管4ml；4℃，100g，离心1min；
(5)弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔悬浮，每管4ml；冰上放置30min；
(6)23℃，100 g离心1min；弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg重悬；
以下操作均在23℃下进行：
(7)取约10-20ug 质粒于1.5ml EP管中，加100ul 步骤6中的原生质体；用200ul 枪头（剪
去前端）轻柔混匀；
(8)加入110ul PEG/Ca 溶液，轻柔混匀；放置20-30min；
(9)加入0.44ml W5 溶液，来回颠倒混匀；23℃，100 g，1min，brake 设为4-5；
(10)弃上清，加100ul W5，混匀；加900ul W5，混匀；
(11)上述混合液体置于六孔板内，23℃，避光，孵育6-18小时。
(1)酶解液：
cellulose R10 15%
Macerozyme R10 0.3%
Mannitol 1.09g
KCl 0.3M
MES 0.3M
调节pH值到5.7，55℃加热10min，冷却到室温再加入下列溶液
CaCl20.15M
β-巯基乙醇0.75mM
(2)PEG溶液（40%，v/v）
PEG4000 1g
0.8M Mannitol 0.625ml
1M CaCl2 0.25m
(3)W5溶液
154mM NaCl 9.0g
125mM CaCl218.4g
5mM KCl 0.37g
5mM glucose 0.9g
0.03%MES 0.3g
用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌(4)MaMg溶液
1M MgCl20.5ml
0.1%MES 0.1g
0.4M Mannitol7.3g
用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌。