原生质体转化
拟南芥原生质体的提取和转化
拟南芥原生质体的提取和转化拟南芥原生质体的提取和转化(1)取4周后抽薹前的叶片，切成1mm宽的长条，置于甘露醇溶液（称1.82g D-甘露醇于20ml双蒸水中）；共需叶片约90片；(2)将步骤1中细条捞出，置于酶解液中；避光，23℃,40-50rpm 摇床上酶解3小时；(3)酶解液过100-200目的筛子，收集滤液，置于15ml离心管中，均分为两管；于4℃，60g，离心15min；(4)原生质体用冰冷W5溶液轻柔洗涤，每管4ml；4℃，100g，离心1min；(5)弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔悬浮，每管4ml；冰上放置30min；(6)23℃，100 g离心1min；弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg 重悬；以下操作均在23℃下进行：(7)取约10-20ug 质粒于1.5ml EP管中，加100ul 步骤6中的原生质体；用200ul 枪头（剪去前端）轻柔混匀；(8)加入110ul PEG/Ca 溶液，轻柔混匀；放置20-30min；(9)加入0.44ml W5 溶液，来回颠倒混匀；23℃，100 g，1min，brake 设为4-5；(10)弃上清，加100ul W5，混匀；加900ul W5，混匀；(11)上述混合液体置于六孔板内，23℃，避光，孵育6-18小时。
(1)酶解液：cellulose R10 15%Macerozyme R10 0.3%Mannitol 1.09gKCl 0.3MMES 0.3M调节pH值到5.7，55℃加热10min，冷却到室温再加入下列溶液CaCl20.15Mβ-巯基乙醇0.75mM(2)PEG溶液（40%，v/v）PEG4000 1g0.8M Mannitol 0.625ml1M CaCl2 0.25m(3)W5溶液154mM NaCl 9.0g125mM CaCl218.4g5mM KCl 0.37g5mM glucose 0.9g0.03%MES 0.3g用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌(4)MaMg溶液1M MgCl20.5ml0.1%MES 0.1g0.4M Mannitol7.3g用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌。
原生质体转化原理
原生质体转化原理
原生质体转化原理
原生质体转化是一种生物技术，旨在将外源DNA引入宿主细胞以获得特定的遗传性状态或表观遗传变化。
原生质体转化原理是一种利用外源DNA（例如体外克隆的DNA和质粒）彻底改变宿主细胞的生理特性。
它为研究者提供了一种简便的方法来改变宿主细胞的遗传特性，同时也能够可靠地测定插入外源DNA的效果。
原生质体转化可以用于实验检测基因的功能，改变宿主细胞的生理特性以及研究各种调控机制的功能。
原生质体转化是一种简易的、可重复的、可控的、有效的技术，可以用来利用外源DNA改变宿主细胞的生理表型，插入和表达外源DNA成为宿主细胞的一部分。
原生质体转化可以被用来驱动各类基因的表达，修改受体的结构，调控蛋白质表达。
原生质体转化是一种可以用来将外源DNA进行插入的非常有效的技术，其优势在于很多具有特定功能的DNA可以被插入宿主细胞，可以较快的检测基因的功能，改变宿主细胞的生理特性以及研究各种调控机制的功能。
原生质体转化依赖于抗生素耐受性，以及抗性转录因子的表达。
这种抗生素耐受机制通过一系列复杂的交互作用使宿主细胞能够耐
受特定的抗生素，该抗生素是质粒DNA的载体，从而达到对特定DNA 序列的特异性。
另外，原生质体转化还可以依赖于转录抑制因子的表达，如亢余的转录抑制因子，以防止宿主细胞的表达被抑制，并保持外源DNA的表达稳定。
总而言之，原生质体转化是一种简便而可靠的技术，可以用来改变宿主细胞的遗传特性，实现对基因功能的检测，以及研究调控机制的功能。
原生质体转化原理
原生质体转化原理原生质体转化是一种重要的基因工程技术，它被广泛应用于生物学研究和生物技术领域。
原生质体是细胞膜和细胞壁之外的细胞质，是一种裸露的细胞质体。
在细菌和植物细胞中，原生质体是一种具有自主活动能力的细胞器，它能够在细胞内外自由运动，承担着许多重要的生命活动。
而原生质体转化则是利用原生质体的自主活动能力，将外源基因导入目标细胞内部，实现基因转移和表达的过程。
原生质体转化的原理和过程原生质体转化的原理是利用高浓度的离子溶液和渗透剂，在低温条件下使原生质体发生体积缩小和形态变化，从而使其细胞膜和细胞壁发生裂解，形成空泡。
在此基础上，将外源基因导入空泡内部，利用渗透剂的作用，使基因与空泡内的原生质体结合并进入目标细胞内部。
随后，通过一系列的复杂生化反应，外源基因被整合到目标细胞的染色体中，并被转录和翻译为蛋白质，实现基因表达。
原生质体转化的应用原生质体转化技术可以被广泛应用于生物学研究和生物技术领域。
在生物学研究中，原生质体转化技术可以用于基因功能研究、基因组编辑和细胞工程等方面。
在生物技术领域，原生质体转化技术可以用于生物制药、农业生产和环境保护等方面。
在生物制药中，原生质体转化技术可以用于生产重组蛋白、抗体和疫苗等生物制品。
通过将外源基因导入目标细胞中，可以实现大规模生产高纯度的生物制品，从而满足临床和市场上的需求。
在农业生产中，原生质体转化技术可以用于改良植物品种、提高作物产量和抗病性等方面。
通过外源基因的导入，可以实现对植物基因组的编辑和修饰，从而实现对植物性状的调控和优化。
在环境保护中，原生质体转化技术可以用于生物降解和生物修复等方面。
通过导入外源基因，可以实现对细菌和微生物的基因编辑和改造，从而提高其对环境污染物的降解和修复能力，为环境保护和生态建设提供有力支持。
原生质体转化是一项重要的基因工程技术，它为生命科学和生物技术领域的发展提供了强有力的支持。
随着技术的不断创新和发展，相信原生质体转化技术将会在更广泛的领域发挥更加重要的作用。
拟南芥原生质体的提取和转化
拟南芥原生质体的提取和转化(1)取4周后抽薹前的叶片，切成1mm宽的长条，置于甘露醇溶液（称1.82g D-甘露醇于20ml双蒸水中）；共需叶片约90片；(2)将步骤1中细条捞出，置于酶解液中；避光，23℃,40-50rpm摇床上酶解3小时；(3)酶解液过100-200目的筛子，收集滤液，置于15ml离心管中，均分为两管；于4℃，60g，离心15min；(4)原生质体用冰冷W5溶液轻柔洗涤，每管4ml；4℃，100g，离心1min；(5)弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔悬浮，每管4ml；冰上放置30min；(6)23℃，100 g离心1min；弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg重悬；以下操作均在23℃下进行：(7)取约10-20ug 质粒于1.5ml EP管中，加100ul 步骤6中的原生质体；用200ul 枪头（剪去前端）轻柔混匀；(8)加入110ul PEG/Ca 溶液，轻柔混匀；放置20-30min；(9)加入0.44ml W5 溶液，来回颠倒混匀；23℃，100 g，1min，brake 设为4-5；(10)弃上清，加100ul W5，混匀；加900ul W5，混匀；(11)上述混合液体置于六孔板内，23℃，避光，孵育6-18小时。
(1)酶解液：cellulose R10 15%Macerozyme R10 0.3%Mannitol 1.09gKCl 0.3MMES 0.3M调节pH值到5.7，55℃加热10min，冷却到室温再加入下列溶液CaCl20.15Mβ-巯基乙醇0.75mM(2)PEG溶液（40%，v/v）PEG4000 1g0.8M Mannitol 0.625ml1M CaCl2 0.25m(3)W5溶液154mM NaCl 9.0g125mM CaCl218.4g5mM KCl 0.37g5mM glucose 0.9g0.03%MES 0.3g用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌(4)MaMg溶液1M MgCl20.5ml0.1%MES 0.1g0.4M Mannitol7.3g用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌。
水稻原生质体制备及转化方法
原生质体制备及转化1.去皮的日本晴种子在75%的酒精中消毒1 min。
然后用2.5%的次氯酸钠消毒20 min。
用无菌水洗至少5次，然后在1/2 MS培养基上，12 h光照（大约150umol m-1 s-1）十二小时黑暗，26 ℃培养7-10天，提前一天烧好去尖的黄蓝枪头备用。
2.取40-60棵水稻幼苗的茎和叶鞘的绿色组织。
3.将一捆水稻植株（大概10棵幼苗）用剃刀一起切成大约0.5 mm的小段。
4.将小片段立刻放进0.6 M的甘露醇中，黑暗中放置10 min。
5.用100目钢制滤网去掉甘露醇，将小片段放在加入15mL酶液的25mL锥形瓶中，（1.5% Cellulase RS，0.75% Macerozyme R-10，0.6 M甘露醇，pH5.7的10mM MES，10mM CaCl2，0.1% BSA），28℃摇床中轻轻摇晃（50rpm），黑暗孵育4-6 h。
6.此时配置40%的PEG4000，酶消化后，分三次加入等体积15mL的W5溶液（154 mM NaCl，125mM CaCl2,5 mM KCl，pH 5.7的2mM MES）。
用手充分摇晃10s。
7.用400目钢制滤网过滤得到原生质体在圆底管中。
8.80g离心（升降速度设为1档）5min，缓慢吸走上清液。
9.沿壁缓慢加入4mL W5溶液，轻轻悬浮，再离心80g，5min，弃上清10.沿壁缓慢加入4mL Mmg溶液，离心80g，5min，弃上清11.再加Mmg溶液，补至每个样品100μl原生质体12.分装2mL离心管，每100μl原生质体，加入20μl质粒和120μl新鲜制备的40%的PEG4000，混匀13.28℃避光静置转化20--25min14.加1.5 mL W5溶液混匀，80g离心3min，弃上清。
15.重复步骤1416.加2mL W5溶液重悬，轻轻混匀，移到细胞培养板，锡箔纸包裹避光28℃避光静置培养15-20小时17.培养完成后，将培养板中沉淀的原生质体轻轻混匀，吸到2 mL离心管中，80g离心3min，弃上清，保留100μl上清液18.共聚焦显微镜观察拍照配制溶液方法：酶液W5溶液MMG溶液PEG(5mL)。
拟南芥原生质体的制备及转化
拟南芥原生质体制备转化操作流程主要试剂1. 纤维素酶解液：试剂15ml酶液体系1．1-1.5﹪Cellulase R10 (YaKult Honsha)0.225g干粉2．0.2-0.4﹪Mecerozyme R10 (YaKult Honsha)0.045g干粉3．0.4M mannitol1.09g干粉4．20mM KCl1 ml 0.3 M KCl母液5．20mM MES,pH5.7，1 ml 0.3 M MES,pH5.7母液6．加入10ml 水7．55℃水浴加热10分钟（钝化酶，提高酶的可溶性），冷却至室温后加入以下试剂8．10mM CaCl，1 ml 0.15M CaCl29．5 mM β-Mercaptoethanol（可选用）1ml 75mM β-Mercaptoethanol母液(Sigma A-6793) 10．0.1﹪BSA，1 ml 1.5﹪BSA（4℃保存）11．用0.45μm滤膜过滤后使用，酶液是淡棕色的澄清溶液。
2. PEG溶液（40%, v/v）（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100ul PEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量）PEG4000( Fluka, #81240)……………1g………………………………….4g 水…………………………………………………0.75ml…………………………..3g0.8 M Mannitol…………………………..0.625ml…………………………2.5ml1 M CaCl2或Ca(NO3)2………………..0.25ml………………………….1ml约1.2ml3. W5 溶液（1000ml）154mM NaCl, NaCl9g125mM CaCl2, CaCl2.H2O18.4g5mM KCl, KCl0.37g2mM MES（PH 5.7），MES0.39gpH to 5.8 with KOH，高温高压灭菌20分钟，室温保存。
原生质体转化原理
原生质体转化原理原生质体转化是一种重要的基因工程技术，它可以将外源基因导入植物细胞内，实现基因的转移和表达。
原生质体转化原理主要包括以下几个方面，构建适当的载体、选择合适的植物细胞、利用适当的方法导入外源基因、筛选和鉴定转化植株。
下面将对这几个方面进行详细介绍。
首先，构建适当的载体是原生质体转化的关键步骤之一。
载体是用来携带外源基因的DNA分子，一般包括表达载体和转座载体。
表达载体可以使外源基因在植物细胞内得到表达，转座载体则可以使外源基因插入到植物基因组中。
构建适当的载体需要考虑外源基因的大小、表达强度、选择标记等因素，确保外源基因能够在植物细胞内得到稳定的表达。
其次，选择合适的植物细胞也是原生质体转化的重要环节。
不同的植物种类、不同的组织和细胞类型对于外源基因的转化和表达具有不同的适应性。
选择合适的植物细胞需要考虑细胞的分化状态、再生能力、易于培养等因素，以确保外源基因能够被稳定地转化和表达。
接下来，利用适当的方法导入外源基因是原生质体转化的关键步骤之一。
常用的方法包括生物弹射法、凝胶载体法、冷冻法等。
这些方法可以有效地将外源基因导入植物细胞内，实现基因的转移和表达。
选择合适的方法需要考虑细胞的特性、外源基因的性质、转化效率等因素，以确保外源基因能够被高效地导入植物细胞内。
最后，筛选和鉴定转化植株是原生质体转化的最后一步。
筛选转化植株需要利用适当的选择标记和筛选条件，鉴定转化植株需要利用PCR、Southern blot等技术手段进行分子分析和表型分析，以确保转化植株中外源基因的稳定性和表达性。
总之，原生质体转化原理涉及到载体构建、植物细胞选择、外源基因导入、转化植株筛选和鉴定等多个环节，每个环节都对转化效率和稳定性具有重要影响。
只有在每个环节都做到科学合理、精心设计，才能够实现外源基因的高效转化和稳定表达，为植物基因工程研究提供强有力的技朮支持。
原生质体的提取及在遗传转化方面的应用
原生质体的提取及在遗传转化方面的应用下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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拟南芥原生质体制备
制备酶解液10 ml
1．取幼嫩拟南芥叶片，使用新的单面刀片将叶片切为0.5 mm-1 mm大小。
（用胶带把下表皮沾掉，效果更好。
放一小培养皿里面降解）
2．材料侵入10 ml酶解液中，暗培养2 h-2.5 h，至原生质体完全从叶片上解离下来。
3．酶解结束后轻轻晃动溶液，镜检酶解结果。
4．使用200目不锈钢网筛过滤原生质体至新离心管中10ml。
（冰上）
5．100×g，4℃，离心2 min，收集原生质体。
6．重悬原生质体于等体积预冷的W5液体培养基中，100×g离心2 min，收集原生质体，（重复三次）。
（重悬时，先加入少些W5轻轻悬起原生质体，随后再轻轻加入剩W5）
7．重悬原生质体于等体积预冷的W5液体培养基中，冰浴30 min。
8．100×g离心2 min，收集原生质体，重悬原生质体于1/10体积Mamg中。
（看细胞浓度而定）
9．取少量重悬原生质体镜检，其余用于转化或4℃保存一周内使用。
2.2.8 原生质体转化
1．在2 ml离心管中一次加入10 µl质粒DNA(10-20 µl，大小在5 Kb之内)，100 µl原生质体，充分混匀后加入110 µl PEG4000溶液。
（3=1+2）
2．上述混合物室温放置10-30 min。
3．反应结束后加入440 µl W5液体培养基，充分混匀。
4．100×g离心2 min，收集原生质体，移除上清。
5．加入500 µl W5溶液培养基，100×g离心2 min，收集原生质体，（重复一次,可以重复两次）。
6．重悬原生质体于1 ml W5液体培养基中，在细胞培养板中，24℃黑暗培养。
7．取黑暗培养18 h后的原生质体，加入荧光素底物，使用CCD照相成像保存。
2. 酶解液10ml
在一个10ml试管中分别加入下列组分
Cellulase R10 0.15 g
Macerozyme R10 0.04 g
200mM MES pH5.7 1 ml
200mM KCl 1 ml
D- Mannitol 0.728 g （4ml 1M的甘露醇）
1 M CaCl2100 µl
加ddH2O至10 ml（0.45um过滤）
Cellulase R10 , Macerozyme R10 :Yakault of Japan 都是经科宏达买的能买到sigma 最好了，其他药品都是sigma
3. W5培养基50 ml
在一个100 ml三角瓶中分别加入下列组分
2M NaCl 3.85 ml (或0.45g)
200mM KCl 1.25 ml
200mM MES 0.5 ml
1M CaCl2 6.25 ml
加ddH2O至50 ml
4. Mamg培养基10 ml
在一个50 ml三角瓶中分别加入下列组分
D-Mannitol 0.728 g （4ml 1M的甘露醇）
150mM MgCl2 1 ml
200mM MES pH5.7 200 µl
加ddH2O至10 ml
5. PEG/Ca2+溶液在一个10 ml离心管中分别加入下列组分
PEG4000 4 g
D-Mannitol 0.364 g （2ml 1M的甘露醇）
1M CaCl2 1 ml
加ddH2O至10 ml
实际只需配制：1 ml PEG4000 4 g
D-Mannitol 0.364 g （2ml 1M的甘露醇）
1M CaCl2 1 ml
加ddH2O至1 ml。