PEG介导法制备拟南芥原生质体及瞬时表达方法
拟南芥原生质体制备
拟南芥原生质体的制备 (Liu et al., 2013)拟南芥原生质体分离前要求：a.保持拟南芥生长条件稳定；b.大约3-4周大的抽叶前苗子用于分离原生质体；c.选择健康未受到胁迫的苗子；d.一般用15mL酶解液酶解20片叶子每次可以做大约15个转化。
①试剂配制：母液试剂：18.2g Mannitol（182.17g/moL）溶于ddH2O，定容至100mL得到1M Mannitol。
1.49g KCl（74.55g/mol）溶于ddH2O，定容至100mL得到0.2M KCl。
11.1g CaCl2（110.98g/mol）溶于ddH2O，定容至100mL得到1M CaCl2。
4.76g MgCl2（95.21g/mol）溶于ddH2O，定容至100mL得到0.5M MgCl2。
1.95g MES（195.2g/mol）溶于80mL ddH2O，用KOH调pH=5.7，再定容至100mL得到0.1M MES。
8.99g NaCl（58.44g/mol）溶于ddH2O，定容至100mL得到1.54M NaCl。
酶解工作液配方如下：组分母液需求量1-1.5% Cellulase R10 0.225g0.4% Macerozyme R10 0.06g0.4M Mannitol 6mL20mM KCl 1.5mL20mM MES（pH5.7） 3mL55℃水浴10min（抑制蛋白酶活性并增加酶溶解性），冷却至室温后再加入下列试剂。
10mM CaCl2 150uL0.1% BSA 0.015gddH2O 2.35mLTotal 15mL在加入酶粉末之前MES溶液先70℃预热2-3min，最后得到的酶解液是淡褐色，澄清的，酶解液最好用0.22μm孔径的滤膜过滤。
W5 Solution配方：组分母液需求量154mM NaCl 10mL125mM CaCl2 12.5mL5mM KCl 2.5mL2mM MES（pH5.7）2mLddH2O 73mLTotal 100mLPEG40%（m/V）：组分母液需求量PEG4000 8g0.2M Mannitol 4mL0.1M CaCl2 2mLddH2O 6mLTotal to 20mLPEG溶液在转染前1h配置好，确保PEG能够充分溶解。
原生质体制备
拟南芥原生质体制备转化方法选取开花前生长良好情况的拟南芥（Columbia型）叶片，用刀片切成0.5-1 mm宽的叶条；浸于配置好的酶解液中（每5-10 mL酶解液约10-20片叶子）；暗箱抽真空，30 min；转移至室温，继续黑暗酶解3-5 h；当酶解液变绿时轻轻摇晃培养皿促使原生质体释放；加入等量的W5溶液稀释酶解液；用60-100目筛子（W5溶液润湿）过滤酶解液；将滤液转移至30 mL eppendorf管，500-700 g离心1-2 min，弃上清；加入10 mL预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体；放于冰上静置30 min；保持室温在23℃以下；500 g离心8-10 min，弃上清；加入1 mL MMG溶液重悬原生质体（使其终浓度约在2×105个/mL）；即得到原生质体溶液。
用移液器吸取100 L的以上原生质体溶液于1.5 mL eppendorf管，加入10L DNA（10-20 g的质粒DNA），轻柔混合后，加入110 L PEG溶液，轻柔拍打eppendorf管使其混合完全；室温下诱导转化5-15 min；加入400-440 L W5溶液稀释转化混合液，轻柔颠倒，使之混合完好以终止转化反应；500 g离心2 min，弃上清；加入1 mL W5溶液悬浮清洗，500 g 离心2 min，弃上清；再用1 mL WI溶液轻柔重悬原生质体；室温（20-25℃）下，诱导载体表达18小时以上。
相关溶液配制PEG4000溶液（现用现配）组分用量PEG4000 1 g1 M CaCl20.25 mL0.8甘露醇0.625 mL水0.75 mL纤维素酶解液试剂15 mL酶液体系1-1.5 % Cellulase R10 (YaKult Honsha) 0.225 g 纤维素酶0.2-0.4 % Mecerozyme R10 (YaKult Honsha) 0.045 g 果胶酶0.4 M 甘露醇 1.09 g甘露醇干粉20 mM KCl 1 mL 0.3 M KCl20 mM MES, pH5.7 1 mL 0.3 M MES，pH5.7加水10 mL55℃水浴加热10 min，冷却至室温后加入以下试剂10 mM CaCl2 1 mL 0.15 M CaCl20.1% BSA 1 mL 1.5 % BSA5 mM β-巯基乙醇1mL 75 mM β-巯基乙醇用0.45 m滤膜过滤后即可使用。
玉米和拟南芥的原生质体制备及瞬时表达体系的研究
玉米和拟南芥的原生质体制备及瞬时表达体系的研究作者：赵苏州卢运明张占路赵杨敏王磊来源：《安徽农业科学》2014年第12期摘要[目的]优化玉米和拟南芥原生质体的制备条件及瞬时表达体系。
[方法]以不同时期玉米叶片和拟南芥为材料分离原生质体，通过对不同酶浓度，解离时间和渗透压的研究，优化最佳分离原生质体体系；原生质体再经PEG介导的转化，通过GFP基因表达百分比鉴定原生质体活性和转化效率。
[结果]玉米和拟南芥原生质分离的最佳条件为：纤维素酶1.5%，离析酶0.5%；拟南芥酶解4 h，甘露醇浓度0.4 mol/L；玉米酶解6 h，甘露醇浓度0.45～0.50 mol/L。
最佳生长时期为：拟南芥6～8片叶；玉米二片叶。
用去内毒素质粒经PEG（玉米30% PEG，拟南芥40% PEG）诱导转化置于黑暗下培养，原生质体活性和转化效率较高，原生质体中可以观察到明显的GFP荧光。
[结论]玉米和拟南芥原生质体的制备受酶浓度，解离时间和渗透压的影响，在原生质体转化过程中，质粒DNA纯度，PEG浓度等是影响转化效率的关键因素，与拟南芥原生质体相比玉米原生质体要稳定性差一些。
关键词玉米；原生质体；拟南芥中图分类号S513；Q819文献标识码A文章编号0517-6611（2014）12-03479-04基金项目国家转基因生物新品种培育重大专项（2011ZX08003-002）。
作者简介赵苏州（1988-），男，山东临沂人，硕士研究生，研究方向：植物转录因子。
*通讯作者，研究员，博士，从事植物基因沉默研究。
植物原生质体是指植物细胞通过机械或酶解等特殊方法脱去细胞壁后，留下的裸露、具有生活力、被细胞膜所包围的原生质团。
原生质体由于没有细胞壁，可相对容易摄取外源DNA、质粒、病毒颗粒等外源遗传物质，是进行遗传转化的理想受体；同时，原生质体也是获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料；还可通过诱导形成杂种细胞，为创造新杂种开辟了途径。
PEG介导拟南芥叶片原生质体瞬时表达方法
PEG介导拟南芥叶片原生质体瞬时表达方法1.B5培养基上萌发拟南芥种子，待根长至1-3厘米时即可移栽到土里，温室培养，光照12h/12h，150μE。
2.准备好一个90mm培养皿，称1.82克D－甘露醇于20ml双蒸水中。
培养皿的盖子用来切叶片。
3.取4周后未抽台前的叶片，约90片。
切成1mm宽的长条，置于甘露醇溶液中。
可以一边切一边从植株上取。
4. 配酶解液，100ml三角瓶，15ml酶解体系。
5. 将步骤3中细条捞出，置于酶解液中。
黑暗，23℃，40-50rpm酶解3小时。
6. 酶解液过100-200目的筛子，将过滤后的绿色混合物置于15ml离心管（直径约1cm）中，均分为两管。
4℃，60 g，15min，brake 设为4-5。
7. 弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，每管4ml。
4℃，100 g，1min，brake 设为4-5。
8. 弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，每管4ml。
冰上放置30min。
9. 23℃，100 g，1min，brake 设为4-5。
弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg重悬。
（本步骤及以下操作均在23℃。
）10. 取约10-20ug 质粒于1.5ml EP管中，加100ul 步骤9中的原生质体。
用200ul 枪头（剪去前端）轻柔混匀。
11. 加入110ul PEG/Ca 溶液，轻柔混匀。
放置20-30min。
12. 加入0.44ml W5 溶液，来回颠倒混匀。
23℃，100 g，1min，brake 设为4-5。
13. 弃上清，加100ul W5，混匀。
加900ul W5，混匀。
14. 上述混合液体置于六孔板内，23℃，弱光，孵育6-18小时。
15. 荧光观察，观察之前100g，常温，离心2分钟，终体积控制在50ul左右。
Solution RecipesEnzyme solution1ml 15％cellulase R10 (RS is too strong)1ml 4.5％macerozyme R10 (Yakult Honsha, Tokyo, Japan)1.09 g mannitol1ml 0.3M KCl1ml 0.3M MES, pH 5.7Heat the enzyme solution at 55oC for 10 min (to inactivate proteases and enhance enzymesolubility) and cool it to room temperature before adding1ml 0.15M CaCl21ml 0.75mM β-mercaptoethanol1ml 1.5% BSAPEG solution (40%, v/v)1 g PEG4000 (Fluka, #81240) **Very Important!!0.75 ml H2O0.625 ml 0.8 M mannitol0.25 ml 1M CaCl2W 51000 ml154 mM NaCl 9.0 g125 mM CaCl2 18.4 g5 mM KCl 0.37 g5 mM glucose 0.9 g0.03% MES 0.3 gpH to 5.8 with KOHautoclave 20 minutes in 125 bottlesMaMg solution100 ml15 mM MgCl2 1.5 ml 1M MgCl20.1% MES 0.1 g0.4 M mannitol 7.3 gpH to 5.6 with KOHautoclave 20 minutes in 125 ml bottlesReferences1. Sheen, J. 2002, A transient expression assay using Arabidopsis mesophyll protoplasts./sheenweb/2. Doelling & Pikaard. 1993, Transient expression in Arabidopsis thaliana protoplasts derived from rapidlyestablished cell suspension cultures. Plant Cell Reports 12: 241-244Enzyme solutionPrepare 20 mM MES (pH 5.7) containing 1.5% (wt/vol) cellulase R10, 0.4% (wt/vol) macerozyme R10,0.4Mmannitol and 20mMKCl.Warm the solution at 55 ℃for 10 min to inactivate DNAse and proteases and enhance enzyme solubility. Cool it to room temperature (25 ℃) and add 10mM CaCl2, 1–5 mM β-mercaptoethanol (ptional) and 0.1% BSA. ▲CRITICAL :Addition of 1–5 mM β-mercaptoethanol is optional, and its use should bedetermined according to the experimental purpose. ▲CRITICAL Before the enzyme powder is added, the MES solution is preheated at 70 ℃for 3–5 min. The final enzyme solution should be clear light brown. Filter the final enzyme solution through a 0.45µmsyringe filter device into a Petri dish (100x 25mm2 for 10 ml enzyme solution).▲CRITICAL The enzyme solution should be prepared fresh.WI solutionPrepare 4 mM MES (pH 5.7) containing 0.5 M mannitol and 20 mM KCl. The prepared WI solution can be stored at room temperature (22–25 ℃).W5 solutionPrepare 2mM MES (pH 5.7) containing 154mM NaCl, 125mM CaCl2 and 5 mM KCl. The prepared W5 solution can be stored at room temperature.MMG solutionPrepare 4 mM MES (pH 5.7) containing 0.4 M mannitol and 15mMMgCl2. The preparedMMG solution can be stored at room temperature. PEG–calcium transfection solution Prepare 20–40% (wt/vol) PEG4000 in ddH2O containing 0.2 M mannitol and 100 mM CaCl2. ▲CRITICAL Prepare PEG solution at least 1 h before transfectionto completely dissolve PEG. The PEG solution can be stored at room temperature and used within 5 d. However, freshly prepared PEG solution gives relatively better protoplast transfection efficiency. Do not autoclave PEG solution.Protoplast lysis bufferPrepare 2.5 mM Tris–phosphate (pH 7.8) containing 1 mM DTT, 2 mM DACTAA, 10% (vol/vol) glycerol and 1% (vol/vol) Triton X-100. The lysis buffer should be prepared fresh.MUG substrate mix for GUS assayPrepare 10 mM Tris–HCl (pH 8) containing 1 mM MUG and 2 mM MgCl2. The prepared GUS assay substrate can be stored at –20 ℃PRO CEDUREPlant growth _ Timing 3–4 weeks生长3-4周1| Grow Arabidopsis plants on either Metro-Mix 360 or Jiffy7 soil in a greenhouse or anenvironment-controlled chamber with a relatively short photoperiod (10–13 h light at 23 ℃/11–14 h dark at 20℃) under low light (50–75 µE m–2 s–1) and 40–65% relative humidity.较短的光照时间(10-13小时光照23℃/11-14小时黑暗20℃) 40-65%的相对湿度.▲CRITICAL STEPCol-0 and Ler have been extensively tested in our lab. In general, Arabidopsis plants are very sensitiveto all kinds of environmental changes (e.g., drought, flooding, extreme temperature and constant mechanical perturbation). Try to maintain aconstant environment as much as possible.注意:经过我们实验室的反复验证,总的来说拟南芥对各种环境变化非常敏感(如干旱,水淹,极端温度和不停地机械性干扰)。
拟南芥原生质体的提取和转化
拟南芥原生质体的提取和转化(1)取4周后抽薹前的叶片，切成1mm宽的长条，置于甘露醇溶液（称1.82g D-甘露醇于20ml双蒸水中）；共需叶片约90片；(2)将步骤1中细条捞出，置于酶解液中；避光，23℃,40-50rpm摇床上酶解3小时；(3)酶解液过100-200目的筛子，收集滤液，置于15ml离心管中，均分为两管；于4℃，60g，离心15min；(4)原生质体用冰冷W5溶液轻柔洗涤，每管4ml；4℃，100g，离心1min；(5)弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔悬浮，每管4ml；冰上放置30min；(6)23℃，100 g离心1min；弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg重悬；以下操作均在23℃下进行：(7)取约10-20ug 质粒于1.5ml EP管中，加100ul 步骤6中的原生质体；用200ul 枪头（剪去前端）轻柔混匀；(8)加入110ul PEG/Ca 溶液，轻柔混匀；放置20-30min；(9)加入0.44ml W5 溶液，来回颠倒混匀；23℃，100 g，1min，brake 设为4-5；(10)弃上清，加100ul W5，混匀；加900ul W5，混匀；(11)上述混合液体置于六孔板内，23℃，避光，孵育6-18小时。
(1)酶解液：cellulose R10 15%Macerozyme R10 0.3%Mannitol 1.09gKCl 0.3MMES 0.3M调节pH值到5.7，55℃加热10min，冷却到室温再加入下列溶液CaCl20.15Mβ-巯基乙醇0.75mM(2)PEG溶液（40%，v/v）PEG4000 1g0.8M Mannitol 0.625ml1M CaCl2 0.25m(3)W5溶液154mM NaCl 9.0g125mM CaCl218.4g5mM KCl 0.37g5mM glucose 0.9g0.03%MES 0.3g用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌(4)MaMg溶液1M MgCl20.5ml0.1%MES 0.1g0.4M Mannitol7.3g用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌。
棉花叶肉原生质体分离及目标基因瞬时表达体系的建立
作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014， 40（2）： 231-239http：///ISSN 0496-3490； CODEN TSHPA9E-mail： xbzw@本研究由国家自然科学基金项目（31171590）资助。
*通讯作者（Corresponding author）： 郭旺珍， E-mail： moelab@Received（收稿日期）： 2013-06-17； Accepted（接受日期）： 2013-09-24； Published online（网络出版日期）： 2013-12-05. URL： http：///kcms/detail/11.1809.S.20131205.1101.003.htmlDOI： 10.3724/SP.J.1006.2014.00231棉花叶肉原生质体分离及目标基因瞬时表达体系的建立李妮娜 丁林云 张志远 郭旺珍*南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室 / 教育部杂交棉创制工程研究中心， 江苏南京210095摘 要： 以棉花幼嫩子叶为材料， 分析影响棉花叶肉原生质体分离及目标基因转化的主要因素， 以棉花叶肉原生质体为受体， 建立了稳定、高效的目标基因瞬时表达与鉴定体系。
技术体系包括， 选择自然生长12 d 的棉花幼嫩子叶为材料， 混合1.5%纤维素酶、0.4%离析酶、0.5 mol L -1甘露醇、20 mmol L -1 KCl 、20 mmol L -1 MES 、0.1 mol L -1 CaCl 2和1.0 g L -1 BSA， 在28℃黑暗条件下振荡酶解8 h， 可游离出浓度达1.0×106 mL -1以上的纯净棉花叶肉原生质体。
利用该方法将棉花锌指蛋白基因GhZFP2整合到pJIT166-GFP 质粒载体， 构建了GhZFP2：GFP 融合载体， 采用40% PEG-4000介导转化， 获得高转化率的棉花叶肉原生质体。
大豆原生质体瞬时表达体系的建立及大豆隐花色素的亚细胞定位
中文摘要大豆原生质体瞬时表达体系的建立及大豆隐花色素的亚细胞定位隐花色素是植物体内的一类重要的蓝光受体，能够介导光信号调控植物的去黄化、开花、避荫反应等多种生长发育过程。
隐花色素在模式植物拟南芥中得到了较好的研究，而在大豆等主要作物中的研究较少。
原生质体瞬时表达体系能够快速、高效地实现目标蛋白的亚细胞定位分析。
本文希望利用大豆原生质瞬时表达体系对大豆隐花色素在黑暗和蓝光下的亚细胞定位进行分析，为大豆隐花色素的功能预测提供信息。
由于尚无大豆原生质体转化方法的报道，本文尝试利用酶解法裂解大豆叶片细胞壁获得了原生质体，并用PEG介导的方法成功将外源载体转入大豆叶片原生质体并表达。
进一步对酶解液组成、PEG分子量、叶片时期、质粒浓度和转化时间等影响因素进行分析，确定了大豆叶片原生质体提取和转化的最佳条件，建立了高效的大豆叶片原生质体瞬时转化体系，转化效率达50 %以上。
通过该体系将大豆7个隐花色素(GmCRYs)转入大豆叶片原生质体并观察了其在黑暗和蓝光下的亚细胞定位情况。
具体结果如下：1）最佳叶片时期：出土10天的真叶或刚展开的第一片三出复叶。
2）最佳裂解酶成分：1.0 %纤维素酶，0.2~0.4 %果胶酶。
3）最佳PEG分子量：4000。
4）最佳质粒浓度：大于或等于1 μg/μL。
5）最佳转化时间：15分钟。
6）大豆隐花色素的亚细胞定位：GmCRY1a、GmCRY1b、GmCRY1c和GmCRY1d在黑暗下分布于细胞核和细胞质中，见蓝光后迅速在细胞质中形成类似光小体的结构。
GmCRY2a、GmCRY2b和GmCRY2c持续定位在细胞核中，见蓝光后没有观察到明显的光小体结构形成。
关键词：大豆，隐花色素，原生质体，亚细胞定位AbstractEstablishment of the Protoplasts Transient Gene Expression System and the Subcellular Localization of Cryptochromes in SoybeanCryptochromes are a kind of blue light receptors which mediate the regulation of growth and development in plants by mediating various light responses including de-etiolation of seedlings, flowering time, shade avoidance response, and so on. Many secret of cryptochromes have been revealed in Arabidopsis, however, it is little known about the cryptochromes in soybean. The transient gene expression system using protoplasts has provided a rapid and highly efficient way for the subcellular localization.We want to investigate the subcellular localization of soybean cryptochromes in darkness and under blue light using soybean protoplasts and provide information on the function of cryptochromes in soybean. There is little report about soybean protoplasts transformation, however, we have successfully isolated the protoplasts by enzymatic digestion of mesophyll cells from soybean and transformed the expression vector to the protoplasts for subsequent transient expression, which is mediated by PEG. Moreover, we optimized the main influencing factors including the suitable enzyme digestion system, the molecular weight of PEG, the different growth stages of leaves, the plasmids concentrations and the incubation time, and developed an efficient transient gene expression system using soybean mesophyll protoplasts whose transformation efficiency is over 50 %. We studied the subcellular localization of cryptochromes in soybean in darkness and under blue light using this system. The main results are showed as follows:1)The best growth stages of leaves: the 10-day-old unifoliolates afteremergence and the first trifoliolates which is just unfolding.2)The best enzyme digestion system: Celluase 1.0 %, Pectolase Y-230.2~0.4 %.3)The best molecular weight of PEG: 4000.4)The best plasmids concentrations: greater than or equal to 1 μg/μL.5)The best incubation time: 15 min.6)The subcellular localization of cryptochromes in soybean: The GmCRY1a、GmCRY1b、GmCRY1c and GmCRY1d are located in the nucleus and thecytoplasm of cells in darkness，and formed photobody-like structure incytoplasm while transferred to blue light. The GmCRY2a、GmCRY2b andGmCRY2c are always present in the nucleus, and it is difficult to observe thephotobody formation of the GmCRY2a、GmCRY2b and GmCRY2c.Keywords:Soybean, Cryptochromes, Protoplast, Subcellular localization中英文对照表英文缩写英文全称中文CRY Cryptochrome 隐花色素PHY Phytochrome 光敏色素Phot Phototropin 向光素PEG polyethylene glycol 聚乙二醇FAD Flavin Adenine Dinucleotide 黄素腺嘌呤二核苷酸SPA Suppressor of Phytochrome A 光敏色素A抑制子COP Constitutive Photomorphogenic 持续性光形态建成CIB cryptochrome-interactingbasic-helix-loop-helix 隐花色素互作bHLH转录因子BIC Blue-light Inhibitor of Cryptochromes 隐花色素的蓝光抑制子YFP Yellow Fluorescent Protein 黄色荧光蛋白DAE Days After Emergence 出土后天数目录第1章 绪论 (1)1.1 隐花色素 (1)1.1.1 隐花色素的发现 (1)1.1.2 隐花色素的结构 (2)1.1.3 隐花色素的功能 (3)1.1.4 植物隐花色素的光激活及光信号传递机制 (8)1.2 植物原生质体的基因瞬时表达体系 (12)1.2.1 原生质体的分离 (12)1.2.2 原生质体的转化 (13)1.2.3 原生质体的培养 (14)1.3 研究目的与意义 (15)第2章 材料与方法 (16)2.1 试验材料 (16)2.2 主要试剂的配制 (17)2.3 大豆原生质体瞬时表达体系的建立 (19)2.3.1 pA7-YFP质粒的扩繁与提取 (19)2.3.2 大豆叶片原生质体的提取 (22)2.3.3 大豆叶片原生质体的转化 (23)2.4 大豆隐花色素的亚细胞定位观察 (26)2.4.1 大豆隐花色素进化树及蛋白序列分析 (26)2.4.2 pA7-GmCRYs-YFP载体的构建 (26)2.4.3 pA7-GmCRYs-YFP载体转化大豆叶片原生质体 (29)2.4.4 大豆隐花色素亚细胞定位的观察 (29)第3章 结果与分析 (30)3.1 大豆原生质体的提取与转化 (30)3.1.1 大豆叶片裂解酶浓度的选择 (30)3.1.2 PEG分子量对大豆叶片原生质转化的影响 (31)3.1.3 叶片生长时期对大豆叶片原生质体化的影响 (31)3.1.4 质粒浓度对大豆叶片原生质转化的影响 (32)3.1.5 PEG处理时间对大豆叶片原生质转化的影响 (33)3.2 大豆隐花色素色素的序列分析及亚细胞定位 (33)3.2.1 隐花色素的蛋白序列比对和进化树分析 (33)3.2.2 大豆隐花色素（GmCRYs）的亚细胞定位 (35)第4章 讨论 (39)4.1 大豆叶片原生质体的转化 (39)4.2 大豆隐花色素的亚细胞定位 (40)第5章 结论 (43)参考文献 (44)作者简介 (53)致 谢 (54)第1章绪论1.1 隐花色素植物不能像动物一样移动，面对时刻变化的周边环境，它们只能通过调控自身生长来适应环境。
peg介导的原生质体转化原理
peg介导的原生质体转化原理
PEG介导的原生质体转化，是一种重要的生物技术手段，被广泛应用于基因工程、农业、医药等领域。
PEG介导转化的原理是利用高浓度的聚乙二醇（PEG）和电脉冲处理，使目标细胞可被外源性DNA转化为原生质体，进而实现基因转移。
PEG介导转化的过程分为两个主要步骤。
第一步是将目标细胞与外源性DNA混合，并加入高浓度的PEG。
PEG具有极强的渗透作用，能够破坏细胞膜结构，使DNA能够进入细胞内。
同时，PEG也能够保护DNA不被细胞内核酸酶降解，增加DNA转化的成功率。
第二步是利用电脉冲处理，以破坏细胞膜并形成孔道，使PEG和DNA能够进入细胞质。
这些孔道在电脉冲结束后自行修复，从而保证细胞的完整性。
此时，外源性DNA已经被转化为原生质体，可以整合进目标细胞的基因组中，产生新的表型。
PEG介导转化的优点是操作简单、成本低廉、转化效率高、适用范围广等，因此被广泛应用于生物学研究、基因工程、生物制药等领域。
但是，PEG介导转化也存在一些缺点，如转化后的细胞可能会受到伤害、转化效率受到转化细胞类型、外源性DNA大小和浓度等因素的影响，需要针对具体情况进行优化。
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采用PEG介导拟南芥叶片原生质体瞬时表达法。
具体方法如下：
1）在MS培养基上用无菌牙签点种拟南芥种子，萌发后待根长至1-3厘米（2周左右），移栽到营养土:蛭石为1:1的培养土中，置于培养箱，温度22℃，光照16h，湿度70%，培养2-3周；
2）配制酶解液，选10ml酶解体系，置于90mm培养皿中；
3）在长势良好且未抽薹的拟南芥植株上选取鲜嫩叶片10-15片，用洁净的手术刀在培养皿的盖子上将叶片切成1mm宽的细条；
4）将切好的细条均匀铺在含酶解液的培养皿中，可以一边切一边从植株上取；
5）将酶解液和细叶条真空抽滤30 min；
6）将培养皿取出，静置在黑暗中，23℃，酶解3小时；
7）酶解液过100-200目的筛子，将过滤后的绿色混合物置于2.0 ml离心管中，常温，100 g离心1 min；
8）弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，4℃，100 g，离心1min；
9）弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，冰上放置30min；
10）23℃，100 g，离心1min，弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg重悬（本步骤及以下操作均在23℃）；
11）取约10-20ug质粒于2.0 ml EP管中，加100ul 制备好的原生质体，用剪去前端的200ul 枪头轻柔混匀；
12）加入110ul PEG/Ca溶液，轻柔混匀，23℃静置5-30min；
13）加入800 ul W5 溶液，轻柔的颠倒混匀，23℃，100 g，离心1min；
14）弃上清，加100ul W5，混匀，再次再加100ul W5，混匀；
15）上述混合液体置于恒温加热器中，23℃，避光，孵育6-18小时。
16）荧光观察，观察之前轻柔混匀，吸取观察物所用的枪头必须剪去前端。