拟南芥原生质体制备转化操作
拟南芥（Arabidopsisthaliana）遗传转化实验技术原理
拟南芥（Arabidopsisthaliana）遗传转化实验技术原理拟南芥是植物领域应用较为广泛的模式生物。
由于具有较小的基因组（135 Mbp），生命周期短，可以在多种环境下生长，一直被视为研究植物遗传学、进化、种群遗传学和植物生长发育的系统。
农杆菌介导的蘸花法是目前相对成熟、应用较为广泛的拟南芥稳定遗传转化方法。
转化步骤大致如下：拟南芥（T0代）的花序浸没在一定浓度的含有目标转化质粒的根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）（常用的根癌农杆菌菌株为GV3101）悬浮液中，然后放在一定条件下进行培养（图1 a-e）。
待植物成熟后收集T0代植物的种子，将这些种子放在含有特定抗生素的培养基上进行生长筛选（图1f），获得阳性植株。
与其他植物转化方法相比，蘸花法需要较少的人力和专用试剂，所需设备相对简单且转化效率较高（在优化的条件下大于1%）（1）。
图 1. 拟南芥蘸花法简要过程（2）。
拟南芥瞬时转化常用的有农杆菌介导的叶片转化、基因枪轰击和聚乙二醇(PEG)介导的原生质体转化等方法。
拟南芥的瞬时转化为研究启动子活性、蛋白的亚细胞定位和蛋白相互作用等提供了支撑。
参考文献：Ghedira R.; et al.(2013) The ef f iciency of Arabidopsis thaliana f loral dip transf ormation isdetermined not only by the Agrobacterium strain used but also by the physiology and the ecotypeof the dipped plant. Moecular Plant Microbe Interaction, 26(7), 823-832.Zhang, X.; et al.(2006). Agrobacterium-mediated transf ormation of Arabidopsis thaliana using thef loral dip method. Nature Protocols, 1(2), 641-645.。
原生质体制备
拟南芥原生质体制备转化方法选取开花前生长良好情况的拟南芥（Columbia型）叶片，用刀片切成0.5-1 mm宽的叶条；浸于配置好的酶解液中（每5-10 mL酶解液约10-20片叶子）；暗箱抽真空，30 min；转移至室温，继续黑暗酶解3-5 h；当酶解液变绿时轻轻摇晃培养皿促使原生质体释放；加入等量的W5溶液稀释酶解液；用60-100目筛子（W5溶液润湿）过滤酶解液；将滤液转移至30 mL eppendorf管，500-700 g离心1-2 min，弃上清；加入10 mL预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体；放于冰上静置30 min；保持室温在23℃以下；500 g离心8-10 min，弃上清；加入1 mL MMG溶液重悬原生质体（使其终浓度约在2×105个/mL）；即得到原生质体溶液。
用移液器吸取100 L的以上原生质体溶液于1.5 mL eppendorf管，加入10L DNA（10-20 g的质粒DNA），轻柔混合后，加入110 L PEG溶液，轻柔拍打eppendorf管使其混合完全；室温下诱导转化5-15 min；加入400-440 L W5溶液稀释转化混合液，轻柔颠倒，使之混合完好以终止转化反应；500 g离心2 min，弃上清；加入1 mL W5溶液悬浮清洗，500 g 离心2 min，弃上清；再用1 mL WI溶液轻柔重悬原生质体；室温（20-25℃）下，诱导载体表达18小时以上。
相关溶液配制PEG4000溶液（现用现配）组分用量PEG4000 1 g1 M CaCl20.25 mL0.8甘露醇0.625 mL水0.75 mL纤维素酶解液试剂15 mL酶液体系1-1.5 % Cellulase R10 (YaKult Honsha) 0.225 g 纤维素酶0.2-0.4 % Mecerozyme R10 (YaKult Honsha) 0.045 g 果胶酶0.4 M 甘露醇 1.09 g甘露醇干粉20 mM KCl 1 mL 0.3 M KCl20 mM MES, pH5.7 1 mL 0.3 M MES，pH5.7加水10 mL55℃水浴加热10 min，冷却至室温后加入以下试剂10 mM CaCl2 1 mL 0.15 M CaCl20.1% BSA 1 mL 1.5 % BSA5 mM β-巯基乙醇1mL 75 mM β-巯基乙醇用0.45 m滤膜过滤后即可使用。
拟南芥原生质体的提取和转化
拟南芥原生质体的提取和转化(1)取4周后抽薹前的叶片，切成1mm宽的长条，置于甘露醇溶液（称1.82g D-甘露醇于20ml双蒸水中）；共需叶片约90片；(2)将步骤1中细条捞出，置于酶解液中；避光，23℃,40-50rpm摇床上酶解3小时；(3)酶解液过100-200目的筛子，收集滤液，置于15ml离心管中，均分为两管；于4℃，60g，离心15min；(4)原生质体用冰冷W5溶液轻柔洗涤，每管4ml；4℃，100g，离心1min；(5)弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔悬浮，每管4ml；冰上放置30min；(6)23℃，100 g离心1min；弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg重悬；以下操作均在23℃下进行：(7)取约10-20ug 质粒于1.5ml EP管中，加100ul 步骤6中的原生质体；用200ul 枪头（剪去前端）轻柔混匀；(8)加入110ul PEG/Ca 溶液，轻柔混匀；放置20-30min；(9)加入0.44ml W5 溶液，来回颠倒混匀；23℃，100 g，1min，brake 设为4-5；(10)弃上清，加100ul W5，混匀；加900ul W5，混匀；(11)上述混合液体置于六孔板内，23℃，避光，孵育6-18小时。
(1)酶解液：cellulose R10 15%Macerozyme R10 0.3%Mannitol 1.09gKCl 0.3MMES 0.3M调节pH值到5.7，55℃加热10min，冷却到室温再加入下列溶液CaCl20.15Mβ-巯基乙醇0.75mM(2)PEG溶液（40%，v/v）PEG4000 1g0.8M Mannitol 0.625ml1M CaCl2 0.25m(3)W5溶液154mM NaCl 9.0g125mM CaCl218.4g5mM KCl 0.37g5mM glucose 0.9g0.03%MES 0.3g用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌(4)MaMg溶液1M MgCl20.5ml0.1%MES 0.1g0.4M Mannitol7.3g用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌。
拟南芥培养及遗传转化
拟南芥待转化植株培养及遗传转化一实验目的：获得待转化拟南芥植株并进行花序浸润转化植株。
二实验材料：拟南芥种子（拟南芥的生态型最好是Col-0或者Ws-O，Nd-O，No-O），25cm3花盆，15ml离心管，10ml吸管，Agar，乙醇，次氯酸钠，利福平，Silwet L-77，营养液配方所需试剂，营养土，蛭石，塑料薄膜，托盘等。
三实验步骤：1 待转化植株培养⑴种子消毒：20μl种子装入1.5ml离心管内，加1ml 75% 乙醇消毒1分钟；吸去乙醇，加入1ml 1%次氯酸钠，震荡洗涤15-20分钟；稍离心使种子沉于下部，吸去次氯酸钠，加入无菌蒸馏水清洗（清洗3次，每次洗完后稍离心，吸净水分）；均匀撒播于MS培养基平板上，注意每次洗脱用V ortxe充分混匀。
⑵春化作用：将MS培养基放到4℃冰箱中放置2天。
⑶将MS培养基放置在23 0 C/20 0 C光照培养箱16h/8h培养，在有3~5片成熟叶片后，移栽生长良好的拟南芥幼苗至用营养液浇灌过的营养土和蛭石（4:6）中生长，营养土和蛭石分装在25cm3的小培养皿中，保湿7天左右，湿度为60%~80%。
在生长期间适当浇灌营养液，按需要没3-4周一次（或者时间更长）。
⑷为了在每个植株上得到较多的花芽，当大多数植株第一个花序形成后剪去第一个花序，解除顶端优势，促使多个次生花序的同步出现。
当大多数花序约1~10cm高（剪主序后4~8d）时准备浸润。
表1 MS培养基注意事项：①溶化琼脂：用粗天平分别称取琼脂5.5g、蔗糖20 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入750 mL蒸馏水，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。
然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至1000 mL，搅拌均匀。
②调节PH至5.7~5.8。
表2 营养液配方（无需调节PH）成分含量（mol/L）Ca(NO3)2·4H2O 1.01×10-3NH4H2PO4 1.30×10-4KNO3 5.10×10-3MgSO4·7H2O 4.98×10-4NaOH 3.13×10-5Fe-EDTA 2.24×10-5H3BO39.68×10-6Mncl2·4H2O 2.03×10-6CuSO4·5H2O 2.1×10-7MoO3 1.39×10-7Co（NO3）2·6H2O 8.59×10-8NH4NO3 2.93×10-52 农杆菌的培养取出保种的农杆菌菌液活化后，挑取农杆菌单菌落接入10mL无菌LB液体培养基中（一般含75mg/ L利福平、100mg/ L链霉素和100mg/ L卡那霉素），28℃恒温下250r/ min 振摇过夜培养。
拟南芥原生质体转化系统
拟南芥原生质体遗传转化1.目的●了解在拟南芥悬浮培养的细胞中瞬间表达目的基因的遗传转化方法。
●学习和掌握拟南芥原生质体的制备方法。
2.原理原生质体是除去细胞壁的裸露细胞。
由于消除了细胞壁的障碍，故原生质体是遗传操作、基因转化的好材料。
以植物原生质体为材料进行遗传转化，可以瞬间表达外源基因，也可以获得外源基因稳定表达的转基因细胞系或转基因植株。
常用的进行原生质体遗传转化的方法有电击法和PEG介导的转化法。
电击法利用高压电脉冲使细胞膜发生瞬间的可逆穿孔，从而使外源基因穿过细胞膜而进入细胞中。
这种方法操作简单，转化效率高，但是需要电击仪。
PEG（聚乙二醇）介导的转化方法是通过PEG处理改变细胞膜的通透性，从而使外源DNA易于进入原生质体。
此方法不需要特殊的仪器设备，实验结果比较稳定。
拟南芥原生质体可以从悬浮培养的细胞分离，也可以由新鲜叶片分离制备。
本实验是从拟南芥悬浮培养的细胞分离原生质体，然后进行遗传转化。
3.材料、试剂和仪器3.1 材料●拟南芥（Col-0）悬浮培养细胞●带GFP报告基因的质粒3.2 试剂●B5-0.28 M S(蔗糖)：MS盐（Duchefa M0222.0025） 4.4 g/l蔗糖0.28 M（96 g/l）用KOH调pH至5.5，抽滤灭菌。
●B5-0.34 M GM（葡萄糖, 甘露醇）：MS盐（Duchefa M0222.0025） 4.4 g/l葡萄糖30.5 g/l甘露醇30.5 g/l用KOH调pH至5.5，抽滤灭菌。
●酶解液：纤维素酶1% (0.5 g/ 50 ml)离析酶0.2% (0.1 g/ 50 ml)以上两种酶溶于B5-0.34 M GM中，低速搅拌30 min，用Whatmann滤纸过滤, 然后抽滤灭菌。
●PEG溶液：PEG 6000 25%甘露醇0.45 MCa(NO3)2 0.1 M用KOH调pH至9.0，抽滤灭菌。
●0.275 M Ca(NO3)2：Ca(NO3)2·4H2O 64.94 g/l抽滤灭菌。
拟南芥遗传转化实验报告
一、实验目的本实验旨在通过农杆菌介导法对拟南芥（Arabidopsis thaliana）进行遗传转化，将目的基因导入拟南芥基因组中，并通过筛选和鉴定得到转基因植株。
二、实验材料1. 拟南芥（T0代）植株2. 根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌株3. 目的基因质粒（含有荧光素酶基因）4. 抗生素：卡那霉素、氯霉素5. 培养基：MS培养基、N6培养基、再生培养基6. 仪器：离心机、PCR仪、荧光显微镜等三、实验方法1. 构建重组表达载体将荧光素酶基因插入到农杆菌转化载体pCAMBIA1300中，构建重组表达载体pC1300-FRT::GUS。
2. 农杆菌转化将重组表达载体转化根癌土壤杆菌GV3101菌株，通过平板划线法筛选阳性克隆。
3. 拟南芥转化将阳性克隆的农杆菌悬浮液与拟南芥（T0代）花序进行蘸花处理，将蘸花后的拟南芥放入MS培养基中培养。
4. 筛选和鉴定在含有卡那霉素的培养基上筛选转基因植株，通过PCR检测和荧光显微镜观察GUS 基因的表达情况，鉴定转基因植株。
5. 再生和繁殖将转基因植株移栽至N6培养基中培养，待植株生长稳定后，收集种子进行繁殖。
四、实验结果1. 构建重组表达载体成功构建了含有荧光素酶基因的重组表达载体pC1300-FRT::GUS。
2. 农杆菌转化通过平板划线法筛选到阳性克隆，表明重组表达载体已成功转化根癌土壤杆菌GV3101菌株。
3. 拟南芥转化蘸花处理后，部分拟南芥植株在含有卡那霉素的培养基上生长，表明转基因植株已成功筛选。
4. 筛选和鉴定通过PCR检测和荧光显微镜观察，发现部分转基因植株GUS基因表达阳性，荧光素酶活性明显。
5. 再生和繁殖将转基因植株移栽至N6培养基中培养，植株生长良好，繁殖成功。
五、实验讨论1. 本实验通过农杆菌介导法成功将荧光素酶基因导入拟南芥基因组中，获得了转基因植株。
2. 在实验过程中，农杆菌转化和拟南芥转化效果良好，表明该实验方法适用于拟南芥遗传转化。
花序浸染法转化拟南芥
花序浸染法转化拟南芥1 种植或者移栽拟南芥之前都需要提前一天泡土，泡土过程中要加足量的水。
营养土和蛭石1：1比例混合。
2 可以采取两种方法种植野生型拟南芥：一种是直接在大钵子里种八、九颗，小钵子里种四、五颗，等它稍微长大以后去掉长势不好的或者不能成活的，大钵子保留四颗，小钵子保留两颗，这种方法不用移栽；另一种是现在大钵子里种上几十颗（小钵子里相应的减少），等它们长成小苗后移栽（千万不要等它们长大了再移栽，因为这时它们的根会缠绕在一起，很不好移栽，而且还容易伤根），这种方法移栽比较麻烦，但是在移栽过程中能保证你要移栽的每一颗都是长势良好的拟南芥。
不管你采取哪种方法，在种下拟南芥后都需要浇水并盖膜，盖膜的目的是为了保持水分。
注意：移栽拟南芥后还需要盖3到4天的膜，因为刚移栽的苗子比较小。
总之盖膜时间自己灵活掌握。
3 转拟南芥一般用GV3101这个农杆菌，在你电转农杆菌，挑取阳性克隆检测后，先用2ml离心管少量摇菌，每管装1ml的LB，分装2管，摇8—10小时（时间灵活掌握，有时候需要摇更长的时间才能浑浊）待浑浊后再转移到500ml三角瓶（按1：100的比例装有200ml的LB）中大量摇菌8—10小时直到浑浊为止（有时候需要摇更长的时间才能浑浊）。
浑浊的标准是OD值为0.8，但是现在基本都不测OD值。
（在摇菌过程中所用的离心管和LB要灭菌，另外还要注意添加抗生素利福平，最好选用利福平和另外一种到两种抗生素以达到双抗或者三抗的效果，实际上双抗就可以了，理论上可以添加三种抗生素，一种是利福平，GV3 101农杆菌本身就是抗利福平的；另一种是农杆菌自身所携带的协助Ti质粒载体上的基因所抗的抗生素；还有一种就是T-DNA区内基因所对应的抗生素），接下来就是离心富集农杆菌（用离心瓶或者是50ml的大离心管，这个时候离心瓶或者50ml大离心管可以灭菌也可以不灭菌），然后用100ml的5﹪的蔗糖悬浮，蔗糖溶液中加入20微升表明活性剂，也就是浓度0.02%（此时的蔗糖溶液就不用灭菌了，因为以后的侵染也不在超净工作台操作）。
拟南芥转化
拟南芥的遗传转化（花序浸泡法）
1.培养基
YEP培养基：蛋白胨10g/L 酵母提取物10g/L
NaCl 5g/L 固体琼脂粉15g/L
2.拟南芥材料
培养拟南芥直到它们开始抽苔并产生花序（为了让植株产生更多不成熟的花序，需要推迟转化实验，将抽出的第一个苔剪去，以便于莲花座上腋芽分化出的第二花序的增值）。
3.拟南芥的遗传转化
1)含有目的基因的双元载体转化农杆菌，并接种当菌斑到5ml含有
适当抗生素的YEP液体培养基中，28℃培养2天。
2)再将这一培养基内注入500ml带有适当抗生素的YEP液体培养
基，并在28℃条件下培养16-24小时，使用生长达到稳定期的细胞（OD=1.0-1.6）
3)室温下4000rpm离心10分钟，收集农杆菌细胞，然后加入新制的
5%蔗糖，轻轻悬浮细胞，使OD =0.6-0.8
加入Silwet L-77至浓度0.05%，立刻混匀。
将农杆菌悬浮细胞转移到大的平皿中，用于侵染。
注：Silwet L-77可能有毒，腰带手套保护皮肤。
4)倾斜植株，使所有的花序都浸泡在农杆菌溶液中，浸泡时间1.5-2
分钟，取出后轻轻煽动10秒，控干3-5秒，将植株横放，暗处培养16小时，再恢复光照。
5)为了提高转化效率，可以浸泡植株两次，中间相隔7天。
6)分株收种子，并在含有合适抗生素的MS培养基上萌发，筛选得
到T1转基因拟南芥。
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10 5 mM β-Mercaptoethanol
1ml 75mM β-Mercaptoethanol 母液
11 用 0.45μm 滤膜过滤后使用
过滤
2. PEG4000 溶液（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需 100μl PEG4000 溶液，可根据实验样品量调整溶液 配置总量）
采用基因枪轰击洋葱表皮观察了 GFP 的瞬时表达。
主要试剂
高渗培养液(MS 无机盐、40g/L 甘露醇)，高渗固体培养基(MS 无机盐、40g/L 甘露醇、0.7% agar)，无水乙醇，无菌去离子水，12.5 M CaCl2， 0.1 M 亚精胺，等渗培养基(MS 培养基)
主要设备
高速离心机，1.5 ml Ep 管，涡旋器，超净台，基因枪，气瓶，激光共聚焦显微镜
PEG4000
1g
水
0.75ml
0.8 Mannitol
0.625ml
1 M CaCl2
0.25ml
约 1.2ml
3. W5 溶液
W5（1000ml）
154mM NaCl
NaCl
9g
125mM CaCl2 5mM KCl
CaCl2.H2O KCl
18.4g 0.37g
5 mM glucose
glucose
(注：以 10 枪/3 mg 计算，具体实验可按比例进行换算，无水乙醇清洗处理好的金粉可继续用无水乙醇中-20℃长时间保存，实验中金粉沾 壁时，最好用超声波处理，不进行无菌培养的材料可以不需要严格的无菌操作)
3) DNA 包裹金粉微粒(具体实验可按比例进行以下操作) a. 取 50ul 金粉悬浮液(已分装好)，在连续涡旋振荡下按顺序加入 5ul 质粒 DNA (1ug/ul) 50 X12.5 M CaCl2 20 ul0.1 M 亚精胺 b. 涡旋振荡 3 min； c. 室温下离心 10，000 rpm 10 sec，尽可能去净上清； d. 加入 250ul 无水乙醇，涡旋振荡 1-2 min； e. 室温下离心 10，000 rpm 10 sec，尽可能去净上清； f. 加入 60ul 无水乙醇(可进行 4-8 次轰击)。
实验材料
洋葱内表皮
实验步骤
1. 瞬时表达载体构建
2. 基因枪轰击洋葱表皮观察 GFP 瞬时表达 1) 实验材料准备
撕取洋葱内表皮，置于高渗培养液(MS 无机盐、40g/L 甘露醇)中，室温 100 rpm 处理 4 hours；然后转入高渗固体培养基(MS 无机盐、40g/L 甘露醇、0.7% agar)。
主要试剂 1. 纤体制备转化操作 15ml 酶液体系
1 1-1.5﹪ Cellulase R10 (YaKult Honsha) 0.225g 干粉
2 0.2-0.4﹪ Mecerozyme R10 (YaKult Honsha) 0.045g 干粉
3 0.4M mannitol
4) 基因枪轰击操作(无菌条件下进行) a. 超净台紫外灯灭菌 20min； b. 载体膜、可裂膜、阻拦网等事先置于 70%乙醇中 1 min，灭菌滤纸上自然风干；将气瓶调节压力到 1300psi； c. 取 8-9ul 已用 DNA 包裹好的微粒悬浮液加到微粒载体膜中央，稍微晾干后马上进行轰击； d. 将可裂膜、阻拦网、涂有微粒载体膜安装进固体装置中，射击参数为：轰击微粒运行距离为 12cm，压力 1110psi，真空度 25mmHg； e. 轰击结束后的材料，转移到等渗培养基(MS 培养基)中培养一天一夜； f. 使用激光共聚焦显微镜 488nm 波长激发下，观察 GFP 的表达。
0.9g
0.03﹪ MES
MES
0.3g
pH to 5.8 with KOH，高温高压灭菌 20 分钟，室温保存。
4. MMG 溶液
MaMg 溶液（500ml）
15mM MgCl2 0.1﹪MES
MgCl MES
0.71g 0.5g
0.4 M mannitol
Mannitol
36.5g
用 KOH 调 pH 5.6，高温高压灭菌 20 分钟，室温保存。
1.09g 干粉
4 20mM KCl
1 ml 0.3 M KCl 母液
5 20mM MES,pH5.7
1 ml 0.3 M MES,pH5.7 母液
6
加入 10ml 水
7 55℃水浴加热 10 分钟，冷却至室温后加入以下试剂
8 10mM CaCl
1 ml 0.15M CaCl2
9 0.1﹪ BSA
1 ml 1.5﹪BSA（4℃保存）
5. WI 溶液
WI(200ml)
0.5M mannitol
mannitol
18.217g
4mM MES,pH5.7 20mM KCl
MES KCl 高温高压灭菌，室温保存。
0.3g 0.12g
实验步骤
1. 土培室播种种植拟南芥。 2. 生长良好情况下在未开花前用于取材叶片制备原生质体。 3. 剪取中部生长良好的叶片用刀片切成 0.5 -1 mm 宽的叶条。 4. 将切好叶条掷入预先配置好的酶解液中（每 5-10 ml 酶解液大约需 10-20 片叶子）。并用镊子帮助使叶子完全浸入酶解液。 5. 用真空泵于黑暗中抽 30 分钟。（此时可配制 PEG4000 溶液，200 和 1000 ul 枪头去尖使操作时吸打缓和。） 6. 在室温中无须摇动继续黑暗条件下酶解至少 3 个小时。当酶解液变绿时轻轻摇晃培养皿促使原生质体释放出来。（此时预冷一定量 W5 溶液） 7. 显微镜下检查溶液中的原生质体，拟南芥叶肉原生质体大小大约 30-50 um。 8. 在过滤除去未溶解的叶片前用等量的 W5 溶液稀释含有原生质体的酶液。 9. 先用 W5 溶液润湿 35-75 um 的尼龙膜或 60-100 目筛子，然后用它过滤含有原生质体的酶解液。 10. 用 30 毫升的圆底离心管 100g，1-2 分钟离心沉淀原生质体。尽量去除上清然后用 10ml 冰上预冷的 W5 溶液轻柔重悬原生质体。 11. 在冰上静至原生质体 30 分钟。 以下操作在室温 23℃下进行 12. 100g 离心八至十分钟使原生质体沉淀在管底。在不碰触原生质体沉淀的情况下尽量去除 W5 溶液。然后用适量 MMG 溶液（1m）重 悬原生质体，使之最终浓度在 2X105 个/ml。 13. 加入 10 ul DNA（10-20 微克约 5-10kb 的质粒 DNA）至 2ml 离心管中。 14. 加入 100 ul 原生质体（2x104 个），轻柔混合。 15. 加入 110 ul PEG 溶液，轻柔拍打离心管完全混合（每次大约可以转化 6-10 个样品）。 16. 诱导转化混合物 5-15 分钟（转化时间视实验情况而定，要表达量更高也许需要更高转化时间）。 17. 室温下用 400-440 ul W5 溶液稀释转化混合液，然后轻柔颠倒摇动离心管使之混合完好以终止转化反应。 18. 室温下用台式离心机 100g 离心 2 分钟然后去除上清。再加入 1ml W5 溶液悬浮清洗一次，100g 离心两分钟去上清。 19. 用 1ml WI 溶液轻柔重悬原生质体于多孔组织培养皿中。 20. 室温下（20-25℃）诱导原生质体 18 小时以上。 21. 激光共聚焦显微镜下观察 GFP 标签表达。 （以上实验可以根据自己实验情况适当调整）