植物细胞原生质体制备方法
原生质体的制备
原生质体的制备一、原生质体是什么呢？嗨，小伙伴们！今天咱们来唠唠原生质体的制备。
原生质体啊，就像是细胞的一个小核心部分，它把细胞壁给去掉了，只剩下细胞膜包裹着里面的细胞质和细胞核这些东西呢。
想象一下，就好像给细胞做了个小手术，把外面那层“衣服”（细胞壁）脱掉啦。
这原生质体在很多科学研究里可都是超级重要的呢。
二、原生质体的制备原料要制备原生质体，咱们得先选好原料呀。
一般呢，植物细胞是比较常见的制备原生质体的原料。
不过呢，这植物细胞也不是随便选的哦。
得找那些细胞状态比较好的，就像是挑水果一样，要挑那种新鲜又健康的。
比如说一些嫩叶细胞就比较合适，它们的细胞壁相对薄一些，就比较好处理啦。
当然啦，除了植物细胞，微生物细胞有时候也能用来制备原生质体，不过这就更复杂一些啦。
三、原生质体的制备方法那具体怎么制备原生质体呢？这可有点小复杂呢。
首先得有一种东西能把细胞壁给溶解掉，这个东西就叫酶啦。
就像是用魔法药水把细胞壁这个小城堡的城墙给融化掉一样。
一般会用到纤维素酶和果胶酶，这两种酶就像是一对小搭档，纤维素酶负责分解纤维素，果胶酶负责分解果胶，这样细胞壁就慢慢消失啦。
然后呢，我们还得控制好环境条件。
温度得刚刚好，不能太热也不能太冷，就像我们人感觉最舒服的温度那样，大概25℃到30℃就挺合适的。
还有溶液的酸碱度也很重要呢，pH值一般在5.5到6.5左右比较好。
要是这些条件没控制好，那原生质体可能就制备不出来啦，或者质量不好。
四、原生质体的分离当细胞壁被溶解掉之后呢，原生质体就和其他的细胞碎片混在一起啦，这时候就得把原生质体给分离出来。
可以用过滤的方法，就像我们泡茶的时候用滤网把茶叶渣给过滤掉一样。
用那种很细的滤网，把那些大的细胞碎片给挡住，让原生质体流过去。
还有一种方法就是离心啦，把混合液放在离心机里转一转，原生质体就会因为重量的不同和其他的东西分开啦。
五、原生质体的纯化分离出来的原生质体可能还不是特别纯呢，里面可能还混着一些酶或者其他的杂质。
04-植物原生质体的制备及融合-卢文
原生质体的制备及融合生31 卢文2003012377一、实验目的：a)学习植物原生质体的分离制备技术，观察原生质体形态。
b)学习植物原生质体的融合技术，观察融合原生质体时其形态及变化。
二、实验原理：详见讨论。
三、实验用品：显微镜、擦镜纸、剪子、镊子、小平皿、吸管、直式漏斗、300目尼龙网、10ml离心管、载玻片、盖玻片。
四、试剂：a)洗涤液：甘露醇0.6MCaCl2·2H2O 8mMNaH2PO4·H2O 2mMpH=5.6b)酶混合液：纤维素酶1%果胶酶0.5-0.7%甘露醇0.6MCaCl2·2H2O 8mMNaH2PO4·H2O 7mMMES 3mMpH=5.6c)PEG溶液：PEG-6000 40%CaCl2·2H2O 3.5mMKH2PO4·H2O 0.7mM葡萄糖0.3mMpH=5.8d)高Ca，高pH洗涤液：CaCl2·2H2O 100mMTris 50mM山梨醇100mMpH=10.5e)蔗糖溶液：20%五、实验步骤：a)原生体的制备i.将新鲜花瓣用蒸馏水洗干净，用滤纸吸干表面水分。
ii.用尖头镊剥去木料的下表皮或将其剪成小细条，加入几滴酶液恒温振荡半小时。
iii.酶解好的原生质体混合液经300目尼龙网过滤到10ml离心管，加入少量洗涤液定容至4ml，此时，未被酶解的大块组织留在尼龙网上。
iv.500rpm离心5分钟，弃去上清液，加洗涤液至约2ml吹打均匀。
500rpm5min重复离心一次，彻底去除酶液。
v.加8滴洗涤液，悬浮原生质体。
vi.镜检，检察原生质形态和浓度，看看是否有碎片，本试验中碎片较少，故未做蔗糖漂浮。
b)PEG融合：i.在小平皿内各滴三滴原生质体悬液，静置沉淀。
ii.各缓缓滴加一滴PEG在其中两滴原生质体悬液上，iii.在另一滴上滴加一滴高Ca2+高pH洗液。
iv.镜下观察，1-2分钟后，在原先加入PEG的一滴悬液上加入一滴高Ca2+高pH洗液。
原生质体的制备
原生质体的制备
目的要求
掌握植物原生质体的分离制备
技术，观察原生质体的形态。
实验原理
分离原生质体常采用酶解法。其原理是根据由
纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶配制而成的溶液对
细胞壁成分的降解作用，而使原生质体释放出来。 原生质体的产率和活力与材料来源、生理状态、酶 液的组成、以及原生质体收集方法有关。酶液通常 需要保持较高的渗透压，以使原生质体在分离前细
胞处于质壁分离状态，分离后不致膨胀破裂。渗透
剂常用甘露醇，山梨醇，葡萄糖或蔗糖。酶液中还 应含一定量的钙离子，来稳定原生质膜。游离出来
的原生质体可用过筛法收集。
实验用品
一、 材料
菠菜 二、器材
显微镜，擦镜纸，剪子，镊子，小平皿，吸管四 支，直式漏斗，300目尼龙网，10ml离心管，载 玻片，盖玻片。
三、试剂 1.洗涤液：甘露醇 0.6 M；CaCl2·2H2O 8 mM
NaH2PO4·H2O 2 Mm，pH 5.6
2.酶液：
实验方法
1、酶液的制备 2、材料准备 3、酶解
4、洗涤
观
察
纯 化 后 的 原 生 质 体
胚性愈伤组织亦是原生 质体分离的主要材料
思考题1、何为原生质体 Nhomakorabea2、分离得到的原生质体可有哪些用途？
3、为什么酶解材料时，酶解液要保持较 高的渗透压？
植物原生质体的制备原理
植物原生质体的制备原理
植物原生质体的制备原理是利用生物学方法将植物细胞的质膜和细胞壁打破，使得细胞质与细胞器分离，获得纯净的细胞质。
具体制备原理如下：
1. 选择新鲜的植物组织，例如嫩叶片、根尖等，并将其切碎。
2. 将切碎的组织置于适当的缓冲液中，缓冲液中含有维持细胞渗透压的某些成分，如蔗糖。
3. 经过一定时间的培养，细胞内的质膜和细胞壁会被渗透液逐渐分解，从而使细胞质暴露在外。
4. 使用过滤纸或细孔滤网将悬浊液过滤，以去除细胞壁碎片和其他杂质。
5. 对滤液进行离心，以分离更纯净的细胞质。
6. 最后，将分离得到的细胞质保存在低温条件下，或进行后续的实验操作。
通过上述步骤，就可以制备得到植物原生质体，供后续的生物学研究和实验使用。
原生质体融合操作方法
原生质体融合操作方法
原生质体融合是将两个或更多的细胞融合在一起，以形成单一的细胞。
在实验室中，原生质体融合可用于合成杂交细胞或研究细胞膜蛋白质交互作用。
以下是一种常用的原生质体融合操作方法：
1. 制备原生质体：收获新鲜的植物细胞并环绕其周围的细胞壁。
用酶类解除细胞壁以获得原生质体。
2. 制备混合物：在离心管中将两种原生质体混合并加入缓冲液。
3. 让细胞融合：通过高渗透压或电脉冲使膜破裂或局部破损，让细胞形成互通。
4. 分离融合物：将融合物分离出来，并放在一个合适的培养基上培养。
5. 检测融合结果：使用显微镜观察细胞是否真正融合，或使用特定的抗体标记来检测融合后的细胞表面分子。
需要注意的是，原生质体融合需要谨慎操作，避免损坏细胞结构或引入杂质。
在实验中，需要仔细选择不同类型的原生质体，以确保它们能够融合。
原生质体制备的原理
原生质体制备的原理原生质体啊，简单来说，就是把植物或者微生物细胞外面那层细胞壁给去掉之后剩下的部分。
那为啥要去掉细胞壁来制备原生质体呢？这就像给细胞做了个“脱壳手术”，让细胞变得更“赤裸裸”，这样就方便我们对细胞进行各种研究啦。
对于植物细胞来说，细胞壁是由纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的。
就像一个坚固的小房子，把细胞里的原生质给围在里面。
那怎么把这“小房子”拆掉呢？这就用到了一些特殊的酶。
比如说纤维素酶，它就像一个小小的拆迁队队员，专门针对细胞壁里的纤维素，把纤维素的化学键给切断。
还有果胶酶呢，它也没闲着，负责把果胶分解掉。
这俩酶就这么齐心协力，一点一点地把细胞壁给瓦解掉，原生质体就被释放出来啦。
微生物细胞也类似哦。
不过微生物的细胞壁成分和植物不太一样。
像细菌的细胞壁有肽聚糖，这时候就需要用溶菌酶这样的酶来对付它。
溶菌酶就像一个精准的小剪刀，找到肽聚糖里合适的地方，“咔嚓”一下剪断化学键，细胞壁就开始破掉啦。
原生质体的制备啊，还有很多小讲究呢。
比如说酶的浓度很重要。
如果酶的浓度太低，就像拆迁队的人手不够，拆细胞壁拆得慢吞吞的，效率特别低。
可要是酶的浓度太高呢，就有点像一群莽撞的工人，可能会对原生质体本身造成伤害，把原生质体里面的一些重要结构也给破坏掉了，这可就不好了。
温度也是个关键因素。
就像人干活的时候，温度合适干活才舒服。
对于酶来说也是一样的，不同的酶有它最适宜的工作温度。
在这个温度下，酶的活性最高，拆细胞壁的速度最快，效果也最好。
要是温度不合适，酶可能就会偷懒，不好好干活啦。
而且啊，制备原生质体的时候，还得注意渗透压。
细胞里面是有一定渗透压的，当把细胞壁去掉之后，如果外面的渗透压不合适，原生质体就会像一个被捏扁或者胀大的气球一样。
要是外面的溶液浓度太高，原生质体里的水就会被吸出去，原生质体就会皱缩起来；要是外面溶液浓度太低，水就会大量涌进原生质体，原生质体就可能会胀破。
所以得找到合适的渗透压条件，让原生质体能够舒舒服服地待着。
植物原生质体的制备
在分离原生质体的酶溶液内，需加入一定量的渗透稳定剂，其作用是保持原生质体膜的稳定，避免破裂。
常用的两种系统为：①糖溶液系统：包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0．40～0．80mol／L。
本系统还可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂；②盐溶液系统：包括KCL、MgSO4和KH2PO4等。
其优点是获得的原生质体不受生理状态的影响，因而材料不必在严格的控制条件下栽培，不受植株年龄的影响，使某些酶有较大的活性使原生质体稳定。
另外，添加牛血清蛋白可减少或防止降解壁过程中对细胞器的破坏。
近年来多采用在盐溶液内进行原生质体分离，然后再用糖溶液作渗透稳定剂的培养基中培养。
通常在酶液中使用的等渗剂为0．55～0．6mol甘露醇。
原始pH值提高到7．0时生活的原生质体数量进一步增加，损伤的原生质体也少得多。
原生质体纯化常用过滤和离心相结合的方法，步骤大致如下：
1．将原生质体混合液经筛孔大小为40－100um的滤网过滤，以除去未消化的细胞团块和筛管、导管等杂质，收集滤液。
2．将收集到的滤液离心，转速以将原生质体沉淀而碎片等仍悬浮在上清液中为准，一般以500r／min离心15min。
用吸管谨慎地吸会上清液。
3．将离心下来的原生质体重新悬浮在洗液中（除不含酶外，其他成分和酶液相同），再次离心，去上清液，如此重复三次。
4．用培养基清洗一次，最后用培养基将原生质调到一定密度进行培养。
一般原生质体的培养密度为104～106／ml。
获得植物原生质体的方法
获得植物原生质体的方法
1. 酶解法，使用细胞壁水解酶来去除植物细胞的细胞壁，从而释放原生质体。
这种方法通常涉及将植物材料暴露在酶解液中，然后通过轻微的振荡或离心来分离原生质体。
2. 筛选法，通过筛选植物组织中的原生质体来获得。
这种方法通常涉及将植物材料通过筛网或离心过滤，以分离原生质体。
3. 离心法，利用离心技术来分离植物细胞的不同部分，包括原生质体。
这种方法通常需要使用不同离心速度和时间来分离不同密度的细胞组分。
4. 化学法，使用化学试剂来破坏细胞壁，释放原生质体。
这种方法可能包括对植物组织进行化学处理，如酸碱处理或有机溶剂处理。
5. 超声波法，利用超声波技术来破坏细胞壁，释放原生质体。
这种方法通常需要对植物组织进行超声波处理，以实现细胞壁的破坏和原生质体的释放。
总的来说，获得植物原生质体的方法可以根据实验需要选择合适的方法。
每种方法都有其优缺点，研究人员需要根据实际情况选择最适合的方法来获得高质量的原生质体。
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2. 取洗净擦干后并去除叶梗和粗脉的 100-200mg 鲜嫩植物组织样本用手术剪刀尽可能 剪碎，加入 500ul 提取液 A 充分混匀。
【注】： 加入提取液 A 后可以用匀浆机/匀浆器适当匀浆处理。
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400-8363-211
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产品说明书
培养细胞 1000g 条件下离心 5 分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞后用 PBS 洗 涤 2 次，然后直接加入提取液 A 重悬。
V2.16
BB-3621-1 50T 50ml 500ul 50ml 1
BB-3621-2 100T 100ml 1000ul 100ml 1
组份编号
36210A 36210B 36210C
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产品更新： 贝博会更新或升级产品，以优化和增强其使用性能，产品说明书会进行相应的 版本更新。使用产品时，只能参照随产品附带的说明书，不能参照网上下载的 说明书，可能是不同的版本。 需要最新电子版说明书时可以在收到产品后发邮件索取。
产品号 BB-3108 BB-3103 BB-3106 BB-3401 BB-3154 BB-3151 BB-3124 BB-3152 BB-3301 BB-3127 BB-3311 BB-3182 BB-3185 BB-3191
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● 冰箱
使用方法：
使用注意事项： 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
1. 提取液制备： 每 1000ul 冷的提取液 A 中加入 10ul 提取液 B，混匀后置冰上备用。
产品号 BB-3101 BB-3102 BB-3104 BB-3411 BB-3501 BB-3121 BB-3122 BB-3123 BB-3125 BB-3126 BB-3105 BB-3181 BB-3183 BB-3187
产品 磷酸化蛋白富集试剂盒 膜蛋白提取试剂盒 活性蛋白提取试剂盒 BCA 蛋白定量试剂盒 植物核蛋白提取试剂盒 细菌膜蛋白提取试剂盒 植物总蛋白提取试剂盒 植物膜蛋白提取试剂盒 蛋白酶抑制剂混合物 真菌蛋白提取试剂盒 磷酸酶抑制剂混合物 细菌蛋白提取盒（2D 电泳用） 酵母蛋白提取盒（2D 电泳用） 线粒体蛋白提取盒（2D 电泳用）
产品说明书
植物原生质体制备试剂盒
货号：BB-3621
试剂盒储存条件： 2-8℃保存。
开盖后组份按要求条件保存。
试剂盒组成：
产品组成 规格
试剂 A：提取液 A 试剂 B：提取液 B 试剂 C：原生质体保存液 C
使用说明书 各组份储存条件：
提取液 A 和 C 2-8℃保存； 提取液 B -20℃保存。
有效期： 一年。
使用安全： 使用时需要合适的实验室外套，一次性手套。避免皮肤或粘膜与试剂接触。如 果试剂不小心接触皮肤或眼睛，应立即用水冲洗。
质量控制： 贝博对每批产品进行严格测试以确保产品质量一致。
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本试剂盒适用于各种植物样本原生质体的制备，也可以用于常见的各种绿藻、金藻、硅 藻、甲藻、螺旋藻等单细胞、多细胞、丝状体、多核体等形态真核类藻类原生质体制备。
本试剂盒提取的原生质体组分仍保持其生化功能，适合各种下游分析。
试剂盒以外自备试剂耗材和仪器
● PBS
● 吸头、离心管
● 移液器 ● 冰盒
● 离心机 ● 涡旋振荡器
技术支持： 产品技术问题可发邮件至 bestbio@ 咨询。 如果您有任何关于产品性能或者新应用和技术的建议，欢迎您随时联系我们。
产品简介： 贝博 BBproExtraTM 植物原生质体制备试剂盒提供全套试剂，适用于从各种植物样本制备
原生质体。此试剂盒提供了一个系统，维持原生质体是分开和完整的。优化的试剂配方和程 序可以快速分离原生质体，而绝少交叉污染。
【注】： 也可用其他适当缓冲液重悬或直接用于下游实验。
7. 将上述原生质体样本置 2-8℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
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大约每 300ul 细胞压积中加入 1ml 提取液 A。
3. 将细胞悬液置振荡器上 37℃-55℃或室温振荡 1-3 小时。
【注】： 不同类型的植物样本需要处理的时间差异较大。 部分细胞壁较厚的植物类型可能需要处理更长时间。可以延长至 12 小时以上过夜处理以提 高原生质体得率。
4. 离心力 1000g 离心 5 分钟，收集沉淀，即为原生质体。 5. 用 PBS 洗涤原生质体一次。 6. 在原生质体沉淀中加入 1ml 试剂 C 重悬原生质体，混匀。
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知识产权： 贝博 TM BBproExtraTM 试剂盒及其使用方法包含专有技术。
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注意事项： ● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管 底，避免开盖时试剂损失。 ● 禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。 ● 样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。 ● 最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清 洗并彻底清除残留清洁剂。 ● 实验后完成后所有样品及接触过的器皿应按照规定程序处理。