原生质体制备
原生质体的制备
原生质体的制备一、原生质体是什么呢？嗨，小伙伴们！今天咱们来唠唠原生质体的制备。
原生质体啊，就像是细胞的一个小核心部分，它把细胞壁给去掉了，只剩下细胞膜包裹着里面的细胞质和细胞核这些东西呢。
想象一下，就好像给细胞做了个小手术，把外面那层“衣服”（细胞壁）脱掉啦。
这原生质体在很多科学研究里可都是超级重要的呢。
二、原生质体的制备原料要制备原生质体，咱们得先选好原料呀。
一般呢，植物细胞是比较常见的制备原生质体的原料。
不过呢，这植物细胞也不是随便选的哦。
得找那些细胞状态比较好的，就像是挑水果一样，要挑那种新鲜又健康的。
比如说一些嫩叶细胞就比较合适，它们的细胞壁相对薄一些，就比较好处理啦。
当然啦，除了植物细胞，微生物细胞有时候也能用来制备原生质体，不过这就更复杂一些啦。
三、原生质体的制备方法那具体怎么制备原生质体呢？这可有点小复杂呢。
首先得有一种东西能把细胞壁给溶解掉，这个东西就叫酶啦。
就像是用魔法药水把细胞壁这个小城堡的城墙给融化掉一样。
一般会用到纤维素酶和果胶酶，这两种酶就像是一对小搭档，纤维素酶负责分解纤维素，果胶酶负责分解果胶，这样细胞壁就慢慢消失啦。
然后呢，我们还得控制好环境条件。
温度得刚刚好，不能太热也不能太冷，就像我们人感觉最舒服的温度那样，大概25℃到30℃就挺合适的。
还有溶液的酸碱度也很重要呢，pH值一般在5.5到6.5左右比较好。
要是这些条件没控制好，那原生质体可能就制备不出来啦，或者质量不好。
四、原生质体的分离当细胞壁被溶解掉之后呢，原生质体就和其他的细胞碎片混在一起啦，这时候就得把原生质体给分离出来。
可以用过滤的方法，就像我们泡茶的时候用滤网把茶叶渣给过滤掉一样。
用那种很细的滤网，把那些大的细胞碎片给挡住，让原生质体流过去。
还有一种方法就是离心啦，把混合液放在离心机里转一转，原生质体就会因为重量的不同和其他的东西分开啦。
五、原生质体的纯化分离出来的原生质体可能还不是特别纯呢，里面可能还混着一些酶或者其他的杂质。
原生质体制备
拟南芥原生质体制备转化方法选取开花前生长良好情况的拟南芥（Columbia型）叶片，用刀片切成0.5-1 mm宽的叶条；浸于配置好的酶解液中（每5-10 mL酶解液约10-20片叶子）；暗箱抽真空，30 min；转移至室温，继续黑暗酶解3-5 h；当酶解液变绿时轻轻摇晃培养皿促使原生质体释放；加入等量的W5溶液稀释酶解液；用60-100目筛子（W5溶液润湿）过滤酶解液；将滤液转移至30 mL eppendorf管，500-700 g离心1-2 min，弃上清；加入10 mL预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体；放于冰上静置30 min；保持室温在23℃以下；500 g离心8-10 min，弃上清；加入1 mL MMG溶液重悬原生质体（使其终浓度约在2×105个/mL）；即得到原生质体溶液。
用移液器吸取100 L的以上原生质体溶液于1.5 mL eppendorf管，加入10L DNA（10-20 g的质粒DNA），轻柔混合后，加入110 L PEG溶液，轻柔拍打eppendorf管使其混合完全；室温下诱导转化5-15 min；加入400-440 L W5溶液稀释转化混合液，轻柔颠倒，使之混合完好以终止转化反应；500 g离心2 min，弃上清；加入1 mL W5溶液悬浮清洗，500 g 离心2 min，弃上清；再用1 mL WI溶液轻柔重悬原生质体；室温（20-25℃）下，诱导载体表达18小时以上。
相关溶液配制PEG4000溶液（现用现配）组分用量PEG4000 1 g1 M CaCl20.25 mL0.8甘露醇0.625 mL水0.75 mL纤维素酶解液试剂15 mL酶液体系1-1.5 % Cellulase R10 (YaKult Honsha) 0.225 g 纤维素酶0.2-0.4 % Mecerozyme R10 (YaKult Honsha) 0.045 g 果胶酶0.4 M 甘露醇 1.09 g甘露醇干粉20 mM KCl 1 mL 0.3 M KCl20 mM MES, pH5.7 1 mL 0.3 M MES，pH5.7加水10 mL55℃水浴加热10 min，冷却至室温后加入以下试剂10 mM CaCl2 1 mL 0.15 M CaCl20.1% BSA 1 mL 1.5 % BSA5 mM β-巯基乙醇1mL 75 mM β-巯基乙醇用0.45 m滤膜过滤后即可使用。
一株内生真菌的原生质体制备及再生过程研究
一株内生真菌的原生质体制备及再生过程研究
材料准备：
内生真菌菌株
无菌工作台和器具（如培养皿、显微镜片、移液器等）无菌培养基（如琼脂、乳糖酸钠琼脂培养基等）
无菌培养液（如培养基溶液）
去离子水或无菌PBS缓冲液
培养基制备：
根据内生真菌的要求配制适宜的无菌培养基。
煮沸溶液中加入琼脂，并搅拌至溶解。
转移至培养器并加盖，进行高压灭菌。
菌种处理：
在无菌条件下，将内生真菌分离出来。
用无菌培养液或去离子水洗涤菌株，去除杂质。
原生质体制备：
将清洗后的菌株转移到含有少量无菌培养液的培养皿中。
用显微镜检查，确保菌株没有受到污染。
在无菌条件下，用移液器将菌株转移到新的培养皿中。
将培养皿置于振荡器中，以帮助分离真菌的原生质体。
过一段时间后，观察原生质体的形成情况。
原生质体再生：
将形成的原生质体转移到含有适宜培养基的培养皿中。
在适宜的温度（一般为25-30摄氏度）下，进行培养。
定期观察并记录原生质体再生的过程。
根据需要，可以进行进一步的培养和分离。
生物药物综合实验----植物原生质体的制备
实验原理
植物原生质体是指包在植物细胞壁内的生活物质， 植物原生质体是指包在植物细胞壁内的生活物质， 可通过混合酶液消化细胞壁而获得。 可通过混合酶液消化细胞壁而获得 。 原生质体经适宜的培 养能合成新壁，并进行细胞分裂， 养能合成新壁 ， 并进行细胞分裂 ， 经特殊诱导可生成完整 植株。 除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是 植株。 除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞” 开展基础研究的理想材料。 开展基础研究的理想材料 。 其中酶解法分离原生质体是一 个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、 个常用的技术 ， 其原理是植物细胞壁主要由纤维素 、 半纤 维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、 维素和果胶质组成 ， 因而使用纤维素酶 、 半纤维素酶和果 胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。 胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。
思考题名
1、简述植物原生质体制备的方法步骤； 简述植物原生质体制备的方法步骤； 按镜下观察绘制原生质体。 2、按镜下观察绘制原生质体。
实验结果
注意事项
1、从理论上讲，植物体的任何一部分都可以通过酶解作 从理论上讲， 用去除细胞壁而得到原生质体。但在实际操作中， 用去除细胞壁而得到原生质体。但在实际操作中，只有 幼嫩的组织才能完成去壁的过程。所以， 幼嫩的组织才能完成去壁的过程。所以，为了制备健康 的原生质体，一般选用根尖、茎尖、 的原生质体，一般选用根尖、茎尖、嫩叶及对数生长期 的愈伤组织为材料， 的愈伤组织为材料，一旦细胞具有木质化或次生加厚的 外壁，则不能被酶降解。因此， 外壁，则不能被酶降解。因此，取材成为实验成功与否 的首要问题。 的首要问题。 2、在离心过程中一定要注意转速。 在离心过程中一定要注意转速。
实验方法
1.材料称取与质壁分离 材料称取与质壁分离 称取0.5g材料，撕去叶下表皮，先切成大块， 0.5g材料 称取0.5g材料，撕去叶下表皮，先切成大块，蒸馏水 冲洗4 加入12%甘露醇，质壁分离0.5h 12%甘露醇 0.5h， 冲洗4-5次。加入12%甘露醇，质壁分离0.5h，滤去甘露醇 将材料用镊子夹取转入放有滤纸的培养皿中， ，将材料用镊子夹取转入放有滤纸的培养皿中，吸干叶片 表面水分，将材料切成0.5cm2 0.5cm2小块备用 表面水分，将材料切成0.5cm2小块备用
原生质体制备的方法
原生质体制备的方法嘿，朋友们！今天咱就来唠唠原生质体制备的那些事儿。
你想想看啊，原生质体就像是一个小小的神秘世界，等着我们去探索和解锁呢！要制备它呀，就好像是一场精心策划的冒险。
咱先得选好材料，这就好比是要踏上征途得先选好一匹好马呀！不同的材料就像是不同性格的马，各有各的特点和脾气。
选对了，后面的路就好走多啦。
然后呢，就是处理环节啦。
这可得小心翼翼的，就跟雕刻一件艺术品似的，不能太用力也不能太轻了。
得掌握好那个度，不然可就前功尽弃喽！你说要是不小心给弄砸了，那得多懊恼呀！接着就是酶解啦。
这酶就像是一把神奇的钥匙，能打开原生质体这个神秘世界的大门。
可要选对酶哦，不然门打不开，咱不就白忙活啦！在这个过程中，时间和温度都很关键呢，就好像煮汤一样，火候得把握好。
等酶解完了，就得过滤啦。
这就好像是把沙子和金子分开，要把我们想要的原生质体给筛选出来。
这一步也不能马虎呀，得仔仔细细的。
然后呢，就是洗涤啦。
把那些杂质都洗掉，让原生质体干干净净的。
这就像是给宝贝洗澡一样，得温柔点，可别把它弄疼了。
最后呀，就是培养啦。
给原生质体创造一个舒适的环境，让它能好好地生长发育。
这就像是给小树苗找了个好地方种下去，得精心呵护着。
哎呀呀，制备原生质体可不是一件容易的事儿呀，但只要咱一步一步认真去做，就一定能成功！你说是不是？这过程虽然有点麻烦，但当你看到那一个个可爱的原生质体的时候，你就会觉得一切都值得啦！就像你辛苦种的花终于开了一样，那种喜悦呀，真的是没法形容！所以呀，别害怕困难，大胆去尝试吧！让我们一起在原生质体制备的世界里畅游，去发现更多的惊喜和奥秘！。
李春强PEG原生质体制备
尖孢镰刀菌PEG转化材料与方法质粒：pCT74，含有真菌Pyrenophora triticirepentis的ToxA启动子和潮霉素B磷酸转移酶基因（hygr）。
培养基：LB培养基：酵母提取物5 g、蛋白胨10 g、NaCl 10 g、琼脂15 g、水1000 mL、pH 7.0 ；PDB培养基：马铃薯200 g、蔗糖20 g，水1000 mL；PDA培养基：马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂粉l5 g、水1000 mL；再生半固体培养基：马铃薯200 g、山梨醇182 g、琼脂9 g、水1000 mL。
酶制剂：崩溃酶 (Drislase，购自Sigma公司)，溶壁酶 (Lysing Enzyme，购自广东微生物所)。
(50)裂解液：0/20 mg·mL-1崩溃酶和20 mg·mL-1溶壁酶，酶液用冷的0.8 mol·L-1的NaCl配置，28 ℃，70 r·min-1轻微振动溶解30 min，用0.22 μm的微孔过滤器过滤，除去杂质稳渗剂：0.8 mol·L-1 NaC1，山梨醇溶液 [STC，含1.2 mol·L-1山梨醇、10 mmol·L-1Tris-HCl (pH 7.5)、50 mmo1·L-1 CaCl2]，PTC溶液 [含40% PEG4000、10mm Tris-HCl (pH 7.5)、50mm CaCl2]抗生素：氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)，潮霉素B(hygromycin B，HmB)。
原生质体制备：（预备实验：50ml离心管中孢子需要多少转才能沉淀下来）从培养皿上挑取少量菌丝于250 mL三角瓶里摇床培养2d（48h）。
三层擦镜纸过滤除去菌丝，获得孢子悬浮液，浓度约为1×107 cfu·mL-1。
(从固体培养平板上挑起菌落，置入灭有无菌蒸馏水的200毫升试剂瓶中（瓶中加玻璃珠），剧烈振荡，把菌块打碎，释放孢子；三层擦镜纸过滤，滤液放在2个菌4个50ml 离心管里，然后离心，把孢子离心下来，倒去一部分无菌水，对孢子悬浮液进行浓缩) 取1-2 mL孢子悬浮液到盛有100 mL PDB培养基的250 mL三角瓶中，28 ℃，120-150 r·min-1摇床培养12-14 h。
原生质体的制备
原生质体的制备
目的要求
掌握植物原生质体的分离制备
技术，观察原生质体的形态。
实验原理
分离原生质体常采用酶解法。其原理是根据由
纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶配制而成的溶液对
细胞壁成分的降解作用，而使原生质体释放出来。 原生质体的产率和活力与材料来源、生理状态、酶 液的组成、以及原生质体收集方法有关。酶液通常 需要保持较高的渗透压，以使原生质体在分离前细
胞处于质壁分离状态，分离后不致膨胀破裂。渗透
剂常用甘露醇，山梨醇，葡萄糖或蔗糖。酶液中还 应含一定量的钙离子，来稳定原生质膜。游离出来
的原生质体可用过筛法收集。
实验用品
一、 材料
菠菜 二、器材
显微镜，擦镜纸，剪子，镊子，小平皿，吸管四 支，直式漏斗，300目尼龙网，10ml离心管，载 玻片，盖玻片。
三、试剂 1.洗涤液：甘露醇 0.6 M；CaCl2·2H2O 8 mM
NaH2PO4·H2O 2 Mm，pH 5.6
2.酶液：
实验方法
1、酶液的制备 2、材料准备 3、酶解
4、洗涤
观
察
纯 化 后 的 原 生 质 体
胚性愈伤组织亦是原生 质体分离的主要材料
思考题1、何为原生质体 Nhomakorabea2、分离得到的原生质体可有哪些用途？
3、为什么酶解材料时，酶解液要保持较 高的渗透压？
原生质体的制备
原生质体的制备
稳渗剂：0.6 mol/L甘露醇，121 ℃高温高压灭菌20 min后备用。
2%溶壁酶：在无菌操作台中称取溶壁酶（广东省微生物研究所生产），加入灭菌过的稳渗剂（甘露醇0.6 mol/L），最终使酶液浓度达到2%，再用0.22 µm 滤膜过滤除菌待用。
（观察锁状联合）乳酸石炭酸棉蓝染色液：石炭酸10 g，棉蓝0.02 g，甘油20 mL，乳酸10 mL，蒸馏水10 mL，将石炭酸加入蒸馏水中加热融化，之后加入乳酸和甘油，最后加入棉蓝，溶解备用。
原生质体制备
(1)将杏鲍菇菌丝接种于固体PDA培养基中，25℃培养5-7 d。
(2)活化后的菌丝接入液体PDA培养基中，25℃，120 rmp摇床培养5-6 d。
(3)将菌丝球倒入50 mL离心管中，10000 rpm 离心10 min，倒去上清液，再用无菌水、甘露醇各离心清洗一次。
(4)用灭菌滤纸吸干菌丝水分，称取0.2 g 菌丝放入10 ml 离心管中，再加入2 mL 2％浓度的溶壁酶，30℃水浴2-2.5 h，每隔1 h镜检破壁情况。
(5) 加入6mL甘露醇混匀，终止酶解。
800 rpm离心5 min，用移液枪小心转移上清酶液至新的10毫升离心管，再用0.6 mol/L甘露醇离心离心清洗一次（4000 rpm，15 min），液体再生培养基离心清洗一次（4000 rpm，15 min）。
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原生质体的制备：
1、选取3-4周长势良好的植株的展开叶片（通常选取第5~7片真叶）。
2、用新的锋利的刀子从叶片的中部切0.5-1 mm叶条，比较理想的情况下，每克新鲜叶片中大约含有107个原生质体（大约100-150个叶条在5-10 ml酶溶液中消化）。
对于常规实验，10-20个叶条消化在5-10 ml酶溶液中将得到0.5-1×106个原生质体，足够25-100个样品使用。
3、快速而温柔的转移叶条到准备好的酶溶液中（10-20叶条在5-10 ml酶液中），用平头镊子将叶条完全淹没。
4、用真空泵将叶条在黑暗中真空30 min。
5、室温下在黑暗中至少消化3 h（继续消化，不要摇晃）。
经过轻微转动后酶溶液应该变成绿色，这表明原生质体已经被释放。
6、用显微镜检查原生质体的释放（拟南芥叶肉的原生质体的大小大约为30-50μm）。
7、用等体积的W5溶液稀释酶溶液，通过过滤去除没有消化的叶片组织。
8、用水洗去75 μm尼龙过滤器中的酒精（通常浸泡在95%乙醇中）并去除过量的水，用W5溶液润洗过滤器后过滤原生质体。
9、将原生质体溶液转移到30 mL圆底离心管中，100×g离心5 min，尽可能的去除上清液。
10、用计数板进行细胞计数，每2×105个原生质体加入1 mL W5溶液，在冰，上静置30 min。
11、室温下沉降原生质体15 min，去除W5溶液，每2×105个原生质体加入1 mL MMG溶液重悬浮。
12、在2 mL离心管中分别加入10 mL DNA（5-10 kb的质粒DNA 10-20 mg）和100 mL原生质体（2×104个原生质体细胞），轻轻混匀。
13、加入110 mL PEG溶液，轻弹试管完全混匀。
14、室温下孵育转染混合物15 min（反应5 min足够）。
15、室温下，用400-440 mL W5溶液稀释转染混合物，轻轻摇动或倒置离心管混匀来停止转染过程。
16、室温下，100×g离心2 min，去除上清液。
17、在六孔板中，每孔用1 mL WI溶液重悬浮原生质体。
18、室温下（20-25℃）孵育原生质体一段时间。
19、重悬浮，通过100×g离心2 min收获原生质体。
20、去除上清液并观察GFP成像。