水稻原生质体细胞核及原生质体融合体的 简易染色观察法
综合实验一：植物原生质体的分离、融合与培养
综合实验一：植物原生质体的分离、融合与培养植物原生质体融合和培养在理论和实践上都有很大的意义,在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景。
它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，它不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍，也可克眼传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远缘基因导入栽培种中，原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一。
植物原生质体培养方法起源于植物单细胞的培养方法。
1954年，植物单细胞培养才获得成功。
Mllir培养的万寿菊及烟草悬浮细胞植入到长有愈伤组织的培养基上得到了它们的单细胞克隆，并建立了看护培养的方法；I960年Jones等建立了微室培养法。
同年，Cocking 应用酶法分离原生质获得成功，从而在实验条件下很容易获得大量的原生质体。
随着多种适用于原生质体分离的商品酶的出现，原生质体的培养方法也得到了不断地改进，现在常用的原生质体培养方法有：液体浅层培养法、双层培养法、琼脂糖包埋法、琼脂岛培养法以及使用条件培养基或饲喂培养等。
实验目的了解植物原生质体分离、融合和培养的基本原理及其过程实验原理植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞。
是开展基础研究的理想材料。
其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。
许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法。
高Ca高pH法和电融合法：PEG作为一种高分子化合物，20〜50%的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高Ca高pH法进行清洗.使原生质体融合得以完成。
PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醛键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可昨为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。
各种显微镜下的细胞图像整理(含出处)
1.从科研文献中找出各类显微镜的细胞图像，截图说明图像科学含义，并列出参考文献一.普通光学显微镜细胞生物学杂志第26卷第3期水稻原生质体细胞核及原生质体融合体的简易染色观察法向太和* , 王利琳( 杭州师范学院生命科学学院, 杭州3 1 0 0 3 6 )二.暗视野显微镜微生物学报ActaMicrobiologicaSinica 50(10) :1366 －1372; 4 October 2010 ISSN 0001 －6209; CN 11 －1995 /Q分离自蜜蜂(Apismellifera)的三株螺原体的基本特性回丽静，钟志平，胡冰，杨冰，纪燕玲，于汉寿* (南京农业大学，农业部环境微生物工程重点开放实验室，南京210095)三.荧光显微镜中华医院感染学杂志2010 年第20 卷第11期乙胺丁醇耐药基因embB突变的杂交荧光显微观测陈庆海1 , 黄君富1 , 府伟灵1 ,张雪2 , 匡红1 , 王珂1( 1.第三军医大学第一附属医院检验科, 重庆400038; 2.解放军第452医院检验科, 四川成都610021)四.激光共聚焦显微镜激光生物学报第16卷第1期2007年2月不同应变对骨髓间充质干细胞系细胞骨架影响的研究*赵红斌1, 2, 张西正1*, 吴金辉1, 郭勇1, 毛雁1(1 .军事医学科学院卫生装备研究所, 天津300161;2 . 兰州军区总医院, 甘肃兰州730050 )五.相差显微镜华西口腔医学杂志第28 卷第 4 期2010 年8 月West China Journal of Stomatology Vol．28 No.4 Aug.2010小鼠增强型绿色荧光蛋白-过氧化物酶体增长因子活化受体γ2融合表达重组腺病毒的构建及表达廖丽姿1 肖金刚1 杨苗苗1 孔子任1 孙钦策2 田卫东1 （1.口腔疾病研究国家重点实验室，四川大学，四川成都610041；2.四川大学生命科学学院，四川成都610064）六.微分干涉显微镜植物生理学报植物生理学报Plant Physiology Journal Plant Physiology Journal 2013, 49 (10): 1082~1088多胺生物合成抑制剂D-精氨酸对拟南芥幼苗根系生长的影响高红, 陈春丽* 华中农业大学生命科学技术学院, 武汉430070七.扫描电镜昆虫天敌NATURAL ENEMIES OF INSECTS第26 卷第 4 期2004 年12 月侧沟茧蜂触角感觉器的扫描电镜观察陈新芳1 高燕2 章潜才1( 1.华南农业大学测试中心 2.华南农业大学资源环境学院广州510642)八.透射电镜昆虫学报ActaEntomologicaSinica，August 2013，56( 8) : 960 －964粉尘螨生殖系统超微结构的透射电镜观察王月明1，2，刘晓宇1，黄礼年2，孙新3，刘志刚1，* ( 1．深圳大学医学院过敏反应与免疫学研究所，广东深圳518060; 2．蚌埠医学院第一附属医院呼吸科，安徽蚌埠233000; 3．蚌埠医学院寄生虫学教研室，安徽蚌埠233000)九.冰冻蚀刻1 9 8 9年12月复旦学报（自然科学版）第82 卷第4 期菠菜类囊体膜的亚微结构和功能张克荣孙鸿乔高国肖吴成军苗玉渠吕美筱(生物化学系) 陈仲宜蔡同润胡德珍王子斌(分析测试中心)2.以《DNA时代——老化与死亡》为例，举出科学家用哪些研究手段开展了细胞衰老的研究？思考开展科学研究可分为几个阶段步骤？分别做什么？研究手段：访谈、个案研究、实验法、观察法阶段步骤：1.提出问题：根据一些现象提出问题2.作出假设：根据自己已有的知识和生活经验对问题的答案作出假设3.制定计划：设计探究的方案，包括选择材料、设计方法步骤等4.实施计划：按照探究方案进行探究，得到结果5.得出结论：分析所得的结果与假设是否相符，从而得出结论．。
原生质体培养及融合
主要方法： 漂浮法、界面法和沉降法等。
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A. 漂浮法：使用的飘浮剂有蔗糖、Percoll（珀可，是由聚乙烯
吡咯烷酮包被的SIO2颗粒的无菌胶体悬液）、Ficoll（菲可，水溶 性聚蔗糖）。
原理：采用比原生质体比重高的渗透溶液，使原生质体漂浮在 溶液表面，具体方法为：
子叶/叶片 下胚轴
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五、原生质体培养
培养密度很重要（原因）：一般以104-105个/ml为宜。 常用的培养方法：液体浅层培养、固体平板培养、 固－液双层培养
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1) 原生质体的培养方法
液体浅层培养
将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进 行培养。
优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养 基和转移培养物。 缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现 象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个 细胞的发育情况。
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4、用于细胞器的分离与转移
由于原生质体没有细胞壁的障碍，可以进行亚细胞水平的操作 研究。如叶绿体、线粒体、细胞核、染色体等的摄取。在摄取细胞 器后进行培养，获得再生植株，根据再生植株的表现，即可进行遗 传分析，研究某种细胞器的功能或其所控制的性状。
也可以通过细胞器的转移，使物种获得相应的性状。
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胞质体( cytoplast ) ：不含细胞核，只有细胞质。 微小原生质体(microprotoplast)：只有1条或几条染色体的情况。
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细胞膜
细胞壁
原生质体
植物细胞
细胞核
染色体
微小原生质体 小原生质体 （核质体） 胞质体
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原生质体融合：也称为细胞融合或体细胞杂交。是指将植物的不同 种、属甚至科间的原生质体，通过人工方法诱导融合，然后进行离 体培养，使其再生成为杂种植株的技术。
第六章 原生质体融合
例如：
猴和小鼠 牛和大肠杆菌 苹果和番茄 马铃薯和番茄 人和小鼠细胞
二、原ห้องสมุดไป่ตู้质体融合的类型
1.依据所选用亲本原生质体的来源可分为：
①体细胞杂交：
双亲的体细胞原生质体进行融合
②配子－体细胞杂交：
融合亲本一个是体细胞原生质体，另一个为性 细胞原生质体。精卵细胞与体细胞原生质体融 合可获得三倍体杂种。
③融合阶段
原生质桥 扩展，融合完 成，形成球形 的异核体或同 核体。
4 电融合法
Senda 1979年首先利用此方法实现原生质体融合
电融合仪中有一个融合室，小室两端装有电极， 一定密度的原生质体悬浮液置于其中。在不均匀交变 电场的作用下，使原生质体彼此靠近、接触，排成一 条链，再给予一个点脉冲，使原生质膜发生可逆性电 击穿，从而导致融合。
植物+植物 植物+动物 动物+酵母
PEG法原理
PEG是一种带负电性的高分子化合物， 在原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以 使原生质体凝聚。在洗脱过程中，PEG将被 洗掉，导致质膜表面电荷重排。粘连的质膜 大面积紧密相连，电荷的重排队导致一个原 生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正 性电荷部位相连而导致融合。
③配子间原生质体融合：
融合亲本为精卵细胞，精卵细胞的体外融合成
功，标志着高等植物受精过程的研究从此可以
置于人工控制的离体条件下进行。
原生质体融合的类型
2.依据所选用亲本原生质体的来源是否相同：
自发融合（仅限同一物种之内）
诱导融合（指应用某种诱变剂导致原 生质体融合的方法）
诱导融合
对称融合：是指两个完整的原生质体融合， 在融合子细胞内含有两个融合亲本全套染色 体和全部的细胞质。
水稻原生质体分离与转化方法2014-01-20
水稻原生质体分离与转化方法（储成才 课题组 2014-01-20）【概述】原生质体是一种非常好的瞬时表达系统，现在已被广泛应用于植物生理生化和分子机制的研究，包括细胞信号转导过程，离子转运，细胞壁合成，蛋白质分泌以及细胞程序化死亡等生物学过程。
现在已有的基于原生质体的实验技术包括亚细胞定位，基因瞬时表达分析，启动子活性分析，离子吸收实验以及蛋白质相互作用验证（如BiFC和蛋白质免疫共沉淀）等。
本文主要阐述如何利用原生质体进行亚细胞定位，包括原生质体的制备与转化，定位载体的选择，共定位蛋白参照的介绍，荧光蛋白的性质和波长选择等问题。
一、实验的前期准备：1. 水稻材料：将露白的水稻种子(中花11或者日本晴均可)整齐的播种在营养土（最好混有蛭石，营养土与蛭石的比例为1:1）中，放在温室生长14-21天。
或者放在96孔PCR板上，萌发两天后，换成1×木村营养液培养7-10天。
注意如果采用水培苗必须每天更换营养液，否则水培苗纤维化程度较高，叶鞘部分不够肥厚，且不容易被酶液消化。
制备一次原生质体需要50-60棵水稻幼苗，可供转化质粒5-8个。
2. 质粒制备：转化原生质体对质粒的质量要求比较高，需要使用试剂盒大量提取。
通常大量提取一次需要100 mL菌液，使用Qiagen中量提取试剂盒可获得100-150 μg的高纯度无内毒素的质粒。
质粒提取完毕后需要定量，通常将质粒稀释到 2 μg/μL，一次原生质体转化需要5-10μg质粒。
二、试剂和耗材：1. 耗材：耗材准备如下表所示。
50 mL 蓝口瓶 1 否 用于配制酶液250 mL 三角瓶 2 是 用于盛放酶液和过滤原生质体A4打印纸 4-10 否 暂时盛放刀片切下的叶鞘薄片玻璃板 1 否 避免刀片划伤实验台50 mL Nalgen圆底有机玻璃管 2 是 用于离心收集原生质体2 mL离心管 6-10 是 用于原生质体转化双面刀片 8 否 用于切水稻茎和叶鞘0.22 μm滤膜 2-3 否 用于过滤酶液细胞培养板 1 否 用于培养转化的原生质体2. 试剂准备：(1) Enzyme solution0.6 M D-Mannitol (M=182.17) 2.74 g 5.47 g 10.93 g10 mM MES (M=195.24, pH=5.7) 0.0487 g 0.0975 g 0.195 g1.5% Cellulase R-10（w/v, Yakult）0.375 g 0.75 g 1.5 g0.75% Macerozyme（w/v, Yakult）0.1875 g 0.375 g 0.75 gD-Mannitol 和MES 在常温储存，Cellulase R-10和Macerozyme R-10在4度冰箱储存。
实验三 原生质体
. 重复上一步。 重复上一步。
. 从此，室温进行，每管沉淀用 从此，室温进行，每管沉淀用450µl MMG 重悬
5. 取25~50µg质粒于1.5ml离心管中，加100µl上一 质粒于1.5ml离心管中 离心管中， 质粒于 上一 步重悬过的细胞， 剪头200µl枪头轻轻吹匀。 枪头轻轻吹匀 步重悬过的细胞，用剪头 枪头轻轻吹匀。
.柱子加入空 管，向膜中加入 柱子加入空EP管 向膜中加入30µl Elution Buffer,室 柱子加入空 室 置2min
观察原生质体•源自下午观察上午制备的原生质体细胞， 下午观察上午制备的原生质体细胞， 用去头的枪头吸取静置后下层的细胞， 静置后下层的细胞 用去头的枪头吸取静置后下层的细胞， 制片， 制片，观察
1. 原生质体的制备
实验材料：继代7~8天的水稻悬浮细胞 天的水稻悬浮细胞, 实验材料：继代7~8天的水稻悬浮细胞, 20ml 实验试剂： 实验试剂：20ml
100ml 0.147g 纤维素酶RS NaOAc 甘露醇 pH 5.7 0.098g 离析酶R－10 11g 20ml 0.24g 0.12g
第二天，周六，3.17，地点实验楼，626 第二天，周六， ，地点实验楼， 1- 5 组观察 上午 9:00 10:00 6-10 组观察 10
实验目的 • 掌握水稻原生质体的制备方法； 掌握水稻原生质体的制备方法； • 掌握基因瞬时转化方法； 掌握基因瞬时转化方法； • 了解 了解GFP的发光原理； 的发光原理； 的发光原理 • 了解质膜蛋白的分选途径。 了解质膜蛋白的分选途径。
尽管450～490nm(蓝光)是 是GFP的副吸收峰,但由于长波 能量低,细胞忍受能力强, ,因此更适合于活体检测.
3、水稻悬浮细胞原生质体转化 水稻悬浮细胞原生质体转化
植物原生质体的融合
倒置显微镜的操作
1.开机：接连电源，打开镜体下端的电控开关。 2.准备：将待观察对象置于载物台上。旋转三孔转换器， 选择较小的物镜。观察，并调节铰链式双目目镜，舒适 为宜。 3.调节光源：推拉调节镜体下端的亮度调节器至适宜。 通过调节聚光镜下面的光栅来调源的大小。 4.调节像距：转三孔转换器，选择合适倍数的物镜；更 换并选择合适的目镜；同时调节升降， 以消除或减小图 像周围的光晕，提高了图像的衬度。 5.观察：通过目镜进行观察结果；调整载物台，选择观 察视野。 6.关机：取下观察对象，推拉光源亮度调节器至最暗。 关闭镜体下端的开关，并断开电源。旋转三孔转换器， 使物镜镜片置于载物台下侧，防止灰尘的沉降。 实验用品
原生质体的融合
融合法
高Ca高pH法和电融合法： PEG作为一种高分子化合物，20～50％的浓度能对 原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与 粘连，随后用高Ca高pH法进行清洗．使原生质体融合 得以完成。 PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极 性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形 成氢键，当PEG分子足够长时，可阼为邻近原生质表面 之间的分子桥而使之粘连。PEG也能连接Ca2+等阳离子， Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进 粘连。在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子 可被洗脱．这样将引起电荷的紊乱和再分布．从而引起 原生质体融合：高Ca高pH由于增加了质膜的流动性， 因而也大大提高了融合频率，洗涤时的渗透压冲击对融 合也可能起作用
植物原生质体 分离及融合
实验目的
实验原理 实验用品的原理， 掌握原生质体的分离及融合的操作方法。
原生质体融合的操作技术
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式。對植物來說，原生質體可說是扮演著一種可輕可重的角色：原生質體對植物 的生存和繁殖沒有任何關係；但在品種改良時，原生質體為主要基因的載體之 一，並可以利用原生質體的融合技術來組合不同的基因，造出新的性狀。 肆˙引註資料 .tw/~b0232/proto-chi.htm .tw/~lseduip/U-BET/ubet/F4/group2/page5.htm .tw/~forest/6.htm .tw/bio/b8-1.htm .tw/~forest/6.htm
如果我沒有親自參與這整個操作,我就永遠都不會體認到,「精準」的重要性。在 很多的實驗中,溶液的配置通常都要自己來,而要是在那五六樣,或是更多的原料 中,一不小心將某樣原料的試量配錯了,那整個溶液就要重配,那是一件很麻煩的 事。像很多的原料通常都不超過一克,在用特殊的天秤稱量時,往往手移動的一陣 風,或是僅僅一粒的粉末,量就會超過很多；更不可思議的是,有時候幾滴溶液加起 來,都不到一顆水珠大！所以當我們在用微量滴管吸取時試液時,幾乎都不相信自 己的眼睛,總會疑心：「微量吸管是不是調錯了？我到底有沒有吸到呢？」
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參˙結論 一.實驗照片、實驗發現 01.左圖：剛剪完的花葉 右圖：離心、過夜後的花葉
02.離心管
03.在原生質體的純化這個實驗中,一開始必須先過濾的目的是為了去除雜質,離 心後,原生質體會浮在溶液上層,而在經過一次次的離心後,離心管內的溶液以幾 乎和水一樣,呈半透明狀,只會在近液面處看到一團纏繞的絲狀物。 04.血球計數器是一種很簡單的測量器, 外型是一塊長方形板,中間有一塊正方形 全都是格子的區塊,我們就是利用那些很多的 1 ㎜的小格子來算原生質體的數目 的。這個儀器最特別的地方是－它的專用蓋玻片,雖然它比一般的蓋玻片還要薄, 但它卻是這個儀器最貴的地方呢！當計算原生質體的數目時,必須拿到顯微鏡下 一個一個算它的個數，此時就會看到有好多的小圈圈在格子上,除了在格子內的 圈圈要算外,還要再算任意兩邊的圈圈個數。如此反覆算三次,以確定正確無誤。 05.這一連串的實驗最有趣的部分要算是原生質體的融合了！在這一項實驗中,在 加入誘融劑後,將可以看到花與花的質體、葉與葉的質體、或甚至是花與葉的質 體,慢慢得朝彼此靠近,接著便漸漸地黏在一起了！而且有可能是幾個,也有可能