实验六_植物原生质体分离及融合
植物原生质体的分离及融合
植物原生质体的分离及融合生93沈睿2009012372同组：古梦婷实验日期：2011年11月2日一．实验原理1.原生质体分离原生质体指包被在植物细胞壁内的生活物质。
细胞壁的主要成分是纤维素和果胶质，它们分别经纤维素酶和果胶酶处理即可分解，从而脱去细胞壁，得到原生质体。
2.原生质体融和诱导原生质体融合的方法有多种，譬如物理法（电场刺激，激光，显微操作等）、化学法（聚乙二醇结合高钙高pH法）和生物法（仙台病毒法等）。
本实验用PEG诱导原生质体融和。
PEG是聚乙二醇的英文缩写，相对分子质量在200-6000之间的均可用作细胞融合剂，20-50%的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连。
PEG诱导融合的机理可能是由于其含有醚键而具负极性，与水、蛋白质、碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键。
当PEG分子足够长时，可作为相邻原生质体表面之间的分子桥而使之粘连。
PEG也能连接Ca2+等阳离子。
Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。
在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱，这将引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原生质体融合。
高钙、高pH洗液清洗则增加了质膜的流动性，因而大大提高了融合频率，洗涤时的渗透冲击对融合也可能起作用。
普遍认为PEG分子能改变各类细胞细胞膜的结构，由于两细胞相接处质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，两细胞接触点处细胞膜的脂类分子发生疏散和重组。
PEG法诱导的优点是取材方便、操作简易、效率高且效果稳定，缺点是对细胞有毒性。
二．实验步骤1.原生质体的制备（1）将新鲜的剑兰（唐菖蒲）花瓣洗干净，用吸水纸吸干表面水分；将小平皿洗净，用蒸馏水冲洗后晾干或擦干。
（2）向小平皿中加入适量酶液，用尖头镊剥取剑兰花瓣的上、下表皮，27o C恒温振荡1h 左右。
（3）镜检细胞的酶解情况，若酶解效果不佳，可延长酶解时间，并用吸管吹吸。
（4）将酶解好的原生质体混合液经300目尼龙网过滤到10ml离心管，去除未被酶解的大块组织，用洗涤液冲洗平皿若干次，收集冲洗的液体。
植物原生质体的分离与融合
实验六植物原生质体的分离与融合一、实验目的：1、掌握原生质体分离的方法；2、了解并掌握利用PEG原生质体融合的原理和方法。
二、实验原理：PEG为一种高分子化合物，能与水、蛋白质、和碳水化合物等一些基团能形成氢键。
普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。
该方法的优点是：用法简单，容易获得融合体，融合效果好。
三、实验材料：（1）韭菜或大蒜叶；（2）红辣椒四、实验步骤：Ι 植物原生质体的分离与纯化1、酶解：将撕去表皮的植物叶片和果肉置于酶液（PH 5.4_5.8,去表皮面接触酶液），在适宜温度条件下，避光酶解数小时。
2、过滤：用350目网过滤除去未完全消化的叶片等残渣。
3、原生质体收集：在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清液。
红辣椒800转/分离心5分钟。
4、洗涤：弃上清液，留沉淀约1ml，加入4ml13%CPW洗液，相同条件下再离心，弃上清液。
弃上清液，留沉淀约1ml，混匀呈悬浮备用。
5、纯化：**蔗糖漂浮法去除碎片法：（1）用细口吸管吸20%蔗糖溶液约3ml，小心插入盛有原生质体悬液的离心管底部，缓缓将蔗糖溶液挤出，由于比重不同，蔗糖溶液与原生质体悬液中间有一明显界面。
或者（1*）换一洁净离心管加入20%蔗糖溶液约3ml，然后小心将原生质体悬液平铺于离心管表面。
（以上任一方法皆能看到明显界面）(2)离心5分钟（1000转/分，辣椒800转/分），此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面处(3)用细管吸取漂浮在上下界面处的健康原生质体，转入干净的离心管中。
注意下步镜检决定是否需要:加入3～4ml13%CPW洗液离心，离心5分钟（1000转/分，辣椒800转/分），收集沉淀，最终原生质体体积控制在0.5ML左右。
Ⅱ细胞融合1．不同的原生质体各300μl与带盖离心管中，另加入300μl 40% PEG液，30℃水浴中温浴15min；2．融合液一滴于载玻片上(注意保持一定湿度，不能太干)，轻轻盖上盖玻片，显微镜观察。
04-植物原生质体的制备及融合-卢文
原生质体的制备及融合生31 卢文2003012377一、实验目的：a)学习植物原生质体的分离制备技术，观察原生质体形态。
b)学习植物原生质体的融合技术，观察融合原生质体时其形态及变化。
二、实验原理：详见讨论。
三、实验用品：显微镜、擦镜纸、剪子、镊子、小平皿、吸管、直式漏斗、300目尼龙网、10ml离心管、载玻片、盖玻片。
四、试剂：a)洗涤液：甘露醇0.6MCaCl2·2H2O 8mMNaH2PO4·H2O 2mMpH=5.6b)酶混合液：纤维素酶1%果胶酶0.5-0.7%甘露醇0.6MCaCl2·2H2O 8mMNaH2PO4·H2O 7mMMES 3mMpH=5.6c)PEG溶液：PEG-6000 40%CaCl2·2H2O 3.5mMKH2PO4·H2O 0.7mM葡萄糖0.3mMpH=5.8d)高Ca，高pH洗涤液：CaCl2·2H2O 100mMTris 50mM山梨醇100mMpH=10.5e)蔗糖溶液：20%五、实验步骤：a)原生体的制备i.将新鲜花瓣用蒸馏水洗干净，用滤纸吸干表面水分。
ii.用尖头镊剥去木料的下表皮或将其剪成小细条，加入几滴酶液恒温振荡半小时。
iii.酶解好的原生质体混合液经300目尼龙网过滤到10ml离心管，加入少量洗涤液定容至4ml，此时，未被酶解的大块组织留在尼龙网上。
iv.500rpm离心5分钟，弃去上清液，加洗涤液至约2ml吹打均匀。
500rpm5min重复离心一次，彻底去除酶液。
v.加8滴洗涤液，悬浮原生质体。
vi.镜检，检察原生质形态和浓度，看看是否有碎片，本试验中碎片较少，故未做蔗糖漂浮。
b)PEG融合：i.在小平皿内各滴三滴原生质体悬液，静置沉淀。
ii.各缓缓滴加一滴PEG在其中两滴原生质体悬液上，iii.在另一滴上滴加一滴高Ca2+高pH洗液。
iv.镜下观察，1-2分钟后，在原先加入PEG的一滴悬液上加入一滴高Ca2+高pH洗液。
植物细胞融合(实验)
Potato plants growing in a test tube
Phenotype of intraspecific diploids of S. tuberosum
US-W9310.3 Somatic hybrid US-W9545.99
在原生质体细胞膜与膜紧密接触的部 位，膜内蛋白质颗粒易位并凝聚。接着可 能是相邻的剥去蛋白质的细胞膜间的类脂 质与类脂质反应。继之，类脂质分子的扰 动和重排导致接触的细胞膜局部发生融合， 形成很小的细胞质桥，之后它逐渐扩大， 两个原生质体最终融合。
使用化学促融剂时，Ca2+是必需的。 关于Ca2+的作用机理，有的认为是Ca2+和 PO43-形成不溶于水的配合物，成为细胞间 的钙桥，由此引起融合。也有解释为Ca2+ 结合到带负电磷脂的电离基上，使磷脂分 子在膜上相互分离，由此引起融合。
Putative somatic hybrid plants
A fertile somatic hybrid
Phenotype of somatic hybrids clearly shows characteristics of both parents
S. brevidens somatic hybrid S. tuberosum
电融合法原生质体的融合结果
原生质体成串（40×）
原生质体融合（图1）
电融合法原生质体的融合结果
原生质体融合（图2） 原生质体融合（图3）
植物原生质体的分离与融合
实验七植物原生质体的分离与融合一、实验目的：1、掌握原生质体分离的方法；2、了解并掌握利用PEG原生质体融合的原理和方法。
二、实验原理：PEG为一种高分子化合物，能与水、蛋白质、和碳水化合物等一些基团能形成氢键。
普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。
该方法的优点是：用法简单，容易获得融合体，融合效果好。
三、实验材料：（1）韭菜或大蒜叶；（2）红辣椒四、实验步骤：Ι 植物原生质体的分离与纯化1、将撕去表皮的植物叶片和果肉置于酶液（PH 5.4_5.8,去表皮面接触酶液），在25℃黑暗条件下，酶解0。
5小时。
2、用200目网过滤除去未完全消化的叶片等残渣。
3、在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清液。
红辣椒800转/分离心5分钟。
加入3～4ml13%CPW洗液，相同条件下离心，弃上清液。
加1ml 13%CPW洗液悬浮。
4、蔗糖漂浮法去除碎片。
** 蔗糖漂浮方法：（1）用细口吸管吸20%蔗糖溶液约3ml，小心插入盛有原生质体悬液的离心管底部，缓缓将蔗糖溶液挤出，由于比重不同，蔗糖溶液与原生质体悬液中间有一明显界面(注意要有明显界面).(2)离心5分钟（1000转/分，辣椒800转/分），此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面处(3)用细管吸取漂浮在上下界面处的健康原生质体，转入干净的离心管中，加入3～4ml13%CPW洗液离心（镜检决定是否需要离心），离心5分钟（1000转/分，辣椒800转/分），收集沉淀，最终原生质体体积控制在0.5ML左右。
Ⅱ细胞融合1．不同的原生质体各300μl与带盖离心管中，另加入300μl 40% PEG液，30℃水浴中温浴15min；2．融合液一滴于载玻片上(注意保持一定湿度，不能太干)，轻轻盖上盖玻片，显微镜观察。
细胞生物学实验材料
实验一荧光显微镜的原理和使用实验二叶绿体的分离与荧光观察实验三线粒体的活体染色与观察实验四细胞膜的通透性实验五 DNA的细胞化学——Feulgen反应实验六植物染色体标本的制备和观察实验七细胞计数实验八植物细胞骨架的光学显微镜观察实验九植物原生质体的分离和活性鉴定实验十环境因素诱变染色体改组的观察实验一荧光显微镜的原理和使用一、实验目的了解荧光显微镜的构造及其维护方法；掌握荧光显微镜的使用方法和使用中的注意事项。
二、实验原理荧光显微镜是选择由高压汞灯或类似光源发出一定波长的激发光，激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，观察细胞某种特异成分的分布状态的显微镜。
与普通光学显微镜一样，荧光显微镜也有物镜、目镜、调焦装置、光源、聚光器、载物台、镜身等组成部分。
所不同的是，荧光显微镜增加了激发光源和滤片系统，它投射到样品上的是特定波长的激发光而不是普通的可见光。
在激发光的作用下，样品中的荧光物质产生图1荧光显微镜发射光（即荧光）。
因此，荧光显微镜观察到的是样品中能产生荧光的部分所呈现的荧光映象，普通光学显微镜则是整个样品的可见光透射和折射影像。
某些物质在—定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光。
若停止供能荧光现象立即停止。
有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光（或直接荧光），如叶绿素的火红色荧光和水质素的黄色荧光等。
有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光（或间接荧光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。
利用荧光显微镜对可发荧光物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。
因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照。
三、实验用品荧光显微镜、镊子、载玻片、盖玻片、解剖刀、0.01%吖啶橙染色液（acridine orange）、蒸馏水、水葫芦叶片四、实验内容与方法（一）荧光显微镜的构造1、基本装置荧光显微镜的基本装置是由普通光学显微镜加上一些附件（如荧光光源、激发滤片、二向色镜和阻断滤片等）的基础上组成的。
ch02植物原生质体的分离、融合及培养
五、影响原生质体活力的因素 原生质体活力？ 原生质体活力？ 有活力的原生质体数占所观察原生质体 总数的比例 1. 分离材料的生理状态 分离材料的生理状态 2. 酶解条件： 酶解条件： 酶质量、浓度、酶解温度、 酶质量、浓度、酶解温度、酶解时 间、酶溶液的渗透压
3. 分离条件： 分离条件： 离心次数、离心速度、纯化方法、 离心次数、离心速度、纯化方法、 分离持续时间 环境条件：操作环境的温度、光照、 4. 环境条件：操作环境的温度、光照、 分离用具的影响
3. 酚藏花红染色法 有活力－无色，无活力－ 有活力－无色，无活力－红色 4. 荧光增白剂染色法 结合细胞壁－绿色荧光，叶绿素－ 结合细胞壁－绿色荧光，叶绿素－红色 5. 伊凡蓝法 伊凡蓝不能穿过质膜， 伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到 严重损坏时，细胞才能被染色， 严重损坏时，细胞才能被染色，因而可以 通过细胞被染色与否确定活性。 通过细胞被染色与否确定活性。
3. 梯度离心法 利用比重不同的溶液， 利用比重不同的溶液，离心后使原生 质体处于两液相交界面，而杂质沉于管底。 质体处于两液相交界面，而杂质沉于管底。
四、原生质体活力检测
1. 目测法 在显微镜下观察，根据细胞形态、 在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确 定原生质体活力。 定原生质体活力。 2. FDA（fluorescein diacetate, 二乙酸荧光素） 二乙酸荧光素） （ 法 FDA是一种非极性物质，能自由地穿越细胞 是一种非极性物质， 是一种非极性物质 质膜，在活细胞内， 质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即发荧光 被酯酶裂解即发荧光 荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜， ），由于荧光素不能自由通过质膜 （荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜， 因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的 观察确定细胞活性。 观察确定细胞活性。
原生质体的分离与融合
02
单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，请尽量言简意赅地阐述观点。
诱导原生质体融合
03
杂种植株的再生与鉴定
选择融合体或杂种细胞
(一) 原生质体融合
原生质体融合（Protoplast fusion）是指不同种类的原生质体不经过有性阶段，在一定条件下融合创造杂种的过程。 自然融合（Spontaneous fusion） 来源于分裂旺盛细胞的原生质体，自发融合的频率较高。小孢子来源的原生质体融合率可高达50~70%。实际上自然条件下受精就是一种自发融合。
2.酶法
原生质体的分离
01
二、影响原生质体分离的因素
01
原生质体分离时主要考虑取材、酶的种类、纯度、酶液的渗透
02
压、酶解时间、温度等。
03
组织和细胞材料的生理状态
04
植物幼苗或新生枝的完全伸展叶片的叶肉组织是分离原生质体
05
的最方便、最合适的植物材料。叶肉细胞排列松散，酶试剂很
06
容易达到细胞壁。用于分离原生质体的愈伤组织或悬浮细胞应
添加标题
质杂种。
体细胞杂交
物种间生殖隔离阻碍了物种之间的基因交流，从而给作物育种带来很大的局限性。原生质体融合技术是实现基因重组的一条新途径，目前利用细胞融合已从很多物种、属间，甚至科间获得体细胞杂种，创造了一些自然界不存在的植物类型。
01
单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，请尽量言简意赅地阐述观点。
01
体细胞杂种的应用
一、体细胞杂种的应用潜力
添加标题
植物育种中的核质替换
添加标题
细胞质杂种的获得
添加标题
远缘杂交创造新物种
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
原生质融合
PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与 水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当 PEG分子足够长时，可作为邻近原生质表面之间的分子桥而使 之粘连。 PEG也能连接Ca2+等阳离子，Ca2+可在一些负极化基团
原生质体融合的作用：
(1) 可实现远缘杂交，获得种间杂种，克服有性 杂交配子不亲合性； (2) 可获得含另一亲本非整倍体杂种或胞质杂种， 且获得的遗传变异范围极广； (3)一次操作可实现两个以上亲本的融合作用 (4) 可获得呈现双亲个体基因型总和的杂种； (5) 可形成有性生殖障碍植物的种间杂种；
5.沉淀中加入0.16M氯化钙溶液1—2ml于沉淀， 轻摇使之悬浮，用带长针头的注射器自离 心管底部轻轻地加入6—8ml 22%蔗糖溶液， 使之形成界面。 6.静置待原生质体形成一条带时弃去上、下 液及残渣，用吸管收集原生质体。 7.用.0.24M 氯化钙溶液洗涤一次，离心吸取 上清液。 8.沉淀中加入1—2ml.0.16M氯化钙溶液悬于 沉淀，用血球计数板计数，使原生质体密 度为200000个/ml。
实验六
植物原生质体分离及融合
实验目的
了解植物原生质体分离、融合基本原理。
掌握植物原生质体分离、融合基本过程。
实验原理
植物原生质体融合和培养在理论和实践上都有很大的 意义，它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，可望成 为作物改良的有力工具之一。
植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸
露细胞”，是开展基础研究的理想材料。其中酶解法分离原 生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维
9.取一滴于载玻片上，低倍镜观察原生质体 的纯度和完整性，也可用荧光显微镜检查。
（二）原生质体融合操作
1.取上述原生质体液两滴，间隔5mm滴于载玻 片上，静置10分钟，使原生质体沉淀在载 玻片上。 2.在两滴悬液之间加一滴30%聚乙二醇（PEG） 溶液，使3滴溶液相连，室温下（15℃— 20℃）。作用5—10分钟，在显微镜下观察 原生质体粘连情况。
双荧光素标记
实验方法
（一）原生质体的分离收集
1.取菠菜叶片撕去下表皮，称0.2g,切成小块 放到10ml酶液中，在26℃下酶解4—5小时， 或含酶量减半过夜，期间轻轻摇动几次。 2．用100目的过滤筛过滤。 3.用与滤液等体积的0.16M氯化钙溶液冲洗过 滤筛，使冲洗液冲入过滤液。 4.滤液用离心机100—300rpm，离心5分钟， 弃上清液。
原
生
质
体
的
融
合
图
示
图 细
一 胞
烟 原
草 生
叶 质
肉 体
细 融
胞 合
和 （
洋 葱 4 0 ×
根 ）
尖
图 胞
二 原
烟ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ生
草 质
叶 体
肉 的
和 异
洋 源
葱 融
根 合
尖
细
PEG法 原 生 质 体 的 融 合 图 示
图一烟草叶肉细胞和洋葱根尖 细 胞 原 生 质 体 融 合 （ 40× ）
图二烟草叶肉和洋葱根尖细 胞原生质体的异源融合
2. 0.16M氯化钙溶液（内含0.1%MES） Ph5.6。 3. 22%蔗糖溶液 4. 30%聚乙二醇（PEG）溶液 5. 高pH高钙洗脱液（Ph=9） 0.1M氯化钙 0.1M梨酶醇 0.5ml/100ml 1M Tris 6. 0.24M 氯化钙
纯化后的叶肉原生质体
原生质体融合
P E G 法
素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素
酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。
原生质融合
外界因素作用下，两个或两 个以上植物细胞合并成一个多核细 胞的过程称为植物细胞融合，或植 物体细胞杂交。
原生质融合
许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质
体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法
和PEG之间形成桥，因而促进粘连。在洗涤过程中，连接在原
生质体膜上的PEG分子可被洗脱．这样将引起电荷的紊乱和再 分布．从而引起原生质体融合：高Ca高pH由于增加了质膜的流
动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时的渗透压冲击对融
合也可能起作用。
实验用品
材料：
植物叶片（菠菜叶片）
用具： 倒置显微镜，离心机，过滤筛（100 目），漏斗，烧杯，吸管，长注射针，注 射器（5—10ml）等。 试剂： 1.纤维素酶2% ，果胶酶1% （在0.65M甘露醇，0.05M氯化钙和0.1%MES中， pH调至5.6—6.0）