苹果根原生质体分离条件的研究
植物鉴定与培育的分子遗传学特征和细胞生物学特性的研究方法和技术
植物鉴定与培育的分子遗传学特征和细胞生物学特性的研究方法和技术植物是我们生态环境中的重要组成部分，不仅为我们提供了重要的食物和药物，同时也在调节气候、净化空气等方面发挥着重要作用。
随着人们对植物的需求不断增加，植物鉴定和培育的研究也越来越受到重视。
其中，分子遗传学和细胞生物学特性的研究方法和技术也非常重要，下面将对这些内容进行详细介绍。
一、分子遗传学特征的研究方法和技术分子遗传学是对机体遗传信息的分子水平的研究，它可以揭示基因的结构和功能，还可以研究生物体的遗传变异和进化等方面。
在植物鉴定和培育中，分子遗传学可以帮助我们准确地鉴定植物物种、评估植物种质资源的遗传多样性、优化育种方案等。
1、DNA提取和PCR扩增DNA提取是首先需要进行的步骤。
在DNA提取前，需要选取适合的材料，通常选取的是新鲜叶片、芽、根尖等组织，同时还需要使用优质的DNA提取试剂盒。
接下来就是PCR扩增，PCR扩增技术可以扩增出我们感兴趣的基因片段。
对于不同的分子标记，常用的PCR技术包括RAPD、AFLP、SSR等，这些技术都可以应用于植物鉴定与遗传多样性分析中。
2、序列分析和DNA指纹图谱构建序列分析可以帮助我们解读PCR扩增产物的序列信息，确定所扩增的基因区域有无变异。
除此之外，还可以通过构建DNA指纹图谱来研究植物株指纹图谱的遗传多样性，为后续的育种和良种繁殖提供重要依据。
二、细胞生物学特性的研究方法和技术细胞生物学是对细胞结构、功能和代谢等方面的研究，也是一项极其重要的研究领域。
在植物鉴定和培育中，细胞生物学特性的研究可以帮助我们了解细胞的生长和分化规律、植物的新陈代谢特性等，这些都是植物鉴定和培育中不可或缺的要素。
1、原生质体制备原生质体是指细胞膜外的细胞质和液泡等细胞组分，是细胞生物学研究中不可或缺的工具。
制备原生质体的过程主要涉及到细胞壁和细胞膜的破坏，一般采用酶解和物理破碎两种方法。
2、染色体学的研究染色体学是对染色体的形态、数量和结构等方面的研究。
植物原生质体培养
第六章：植物原生质体培养请问同学们你知道哪些植物育种的方法？（杂交育种、诱变育种、多倍体育种、单倍体育种、基因工程育种、植物组织培养、植物体细胞杂交、动物细胞核移植等。
）自1999年11月20日中国的神舟飞船首飞获得成功后，2012年6月16日18时许中国的载人航天飞船“神舟九号”发射成功，6月29日10时许，神九载人飞船返回舱在内蒙古主着陆场安全着陆，这次发射验证了空间交会对接技术，首次实现地面向在轨飞行器进行人员和物资的往返运输与补给，我国的载人航天工程的“空间实验室”工程有望实现。
2002年12月30日凌晨“神舟”四号发射升天，一起带入太空的还有一批特殊的乘客——100粒牡丹花种子。
有着“牡丹城”之称的洛阳，将牡丹种子送上太空进行育种，是洛阳城“牡丹战略”的一个重要组成部分。
经过太空环境的各种重粒子、强辐射等作用，相当一部分种子的性状会发生较大的变异，也许牡丹花开的会更大更鲜艳。
“神舟四号”共搭载了几百种的植物种子、组织胚胎试管苗、生物菌种等。
此外，太空环境还是一个微重力环境。
中科院（上海生命科学研究院植物生理生态研究所和中科院上海生物化学细胞生物学研究所）的科研人员，分别将精心培育了10年的不同品系的烟草细胞，小白鼠淋巴细胞和骨髓瘤细胞也带入太空，进行了太空细胞电融合实验（由于重力沉降现象消失，不同的细胞更容易融合，提高融合率和细胞存活力），以期获得新品种。
这就是这则新闻提到的动植物细胞举行的“太空婚礼”。
自然条件下，植物间遗传物质的交换可以通过有性生殖来实现，保持物种稳定性的同时，也推动了物种的进化。
但物种间存在的生殖隔离，制约了物种间的遗传信息的交换和整合，也限制了通过杂交进行的作物遗传改良。
因此，人们就想方设法，从其它的途径寻找突破口。
细胞融合技术为克服这一障碍提供了一条新的途径。
而植物细胞是有细胞壁包裹的，实现细胞融合，首先要突破细胞壁的障碍。
6.1 原生质体的概念和研究进展6.1.1原生质体的概念原生质体(protoplast)：我们把除去细胞壁、裸露的、有生活力的原生质团或是说一个被质膜所包围的裸露细胞，称为原生质体。
苹果抗病育种研究进展
赫
苹果抗病 育种研究进展
田 永 强
山西省 太谷 农业 科 学院果 树研 究所 ． ０ ３ ０ ８ １ ５ 苹 果病 害是 制约 苹果产 业 可持续 发展 的重 要 因素 ．抗 病 育种作 为提 高苹果 抗病性 的有 效 途 径 ．其研 究 日益受 到苹果 育 种和果 树病 理工 作者 们 的重 视 。本文 综述 了苹果 抗病 育种 的意 义和 方法 、我 国苹果 抗病 育种 中存在 的 问题 以 及今 后 的工作 方 向 做 为 主要 的选 育 目标 。 ２ ． ２ 生物 技 术 抗 病 育种 生 物技 术 育 种 包 括
３ 今 后 的 工作 方 向
苹果 抗病育 种 的工作 任重 而道 远 ．解 决 苹 果病 害危 害 的难题要 靠分 子 生物学 、植 物病 理
种： 杂 交育种是获得具 有双亲优 良特 性 的新 品种 的最有 效方法 ： 自然变异 特别 是优 变较少 。 为 获 得 大量优秀 的 目标性 状 ． 常采用人工诱 变方法 。 传 统 的苹果 育种方 法 中有关 抗病 育种 的报 道很 少 ． 选育 目标 大 多为 果 实风 味 、 果个大小 、 果面颜 色 、 成熟 期等 经济性 状 ， 不 排 除选育 成功 的部分 新 品种具 有抗 病性状 ，但 也并 没有 将其
一
２ 苹果抗病育种 的现状 与存在 的问题
２ ． １ 传统 的 苹果 育种 方法 包 括实 生选 种 、 芽 变选种 、 杂交 育种和诱变育种 。实生选种是 最简 单、 原 始 的育种 方法 ， 我 国原产的果树 品种 绝大 多数源 于 自然实生 ． 其不 足之处是要求保 持原有 的优 良特性 。 变异范 围小 ， 类 型少 ； 芽变选 种是通 过芽 分生 组织 细胞 的变 异进而 培育 新 品种 的方 法． 生产 中人 们通过该途径 选育 出不 少优 良新 品
珠眉海棠根原生质体分离条件研究
醇 ， ｍ ＬＬＣ Ｃ２ １ｍ ｏ ＬＭｇ １ ２ ｎｎｌＬ葡 聚 ２ｍ ｏ／ ａ １ ｍ ｌ Ｃ２ ｕｏ ， ／ ， ／
糖硫 酸钾 。用 Ｍｅ 一 ｓ ｓ 调节 ｐ Ｈ为 ５ ５ ．。水 浴振荡
器中 （５ ±１ ，０～６ ｒｎ ２℃ ℃ ４ ０ｒ ｎ ）酶解 １ ～１ 。 ／ｉ ２ ６ｈ 共设 ２ 酶处理 浓 度组 合 ： ｅ ｕ ｓ ０种 Ｃｌ ｌ ｅＲ一１ ｌａ ０浓
前 对苹果 根 系 原 生质 体 分 离 的研 究 国 内外 鲜 见 报 道 ｌ ｌ ， 响 了以原 生质 体 为试 验对 象 的苹 果 细胞 ９。 影 ｌ。 学 及新种质 创造 的进 程 。 因此 ， 文 以苹 果 属植 物 本 珠 眉海棠为试 材 ， 对影 响其 根 系原 生 质体 分 离 效果
先将 根段置 于酶解液 １ ， 中 在水 浴振荡 器 中（５ ２
摘 要 ：以苹果 属 珠 眉 海 棠（ ａｕ ｕ ａ ） 为 供 体进 行 原 生质 体 分 离条 件 的 研 究 ， Ｍ ｌ ｍｉ ｔ 根 ｚ Ｍ ｉ 结果 表 明 ， 解 过程 中酶 酶
液浓度、 酶液渗透压、 酶解时间均对原生质体 分离效果 产生重要影响。对于珠眉 海棠， 一步酶 解法， 两步 酶解法 皆
１ ｙｉ（Ｈ ５ ８ 。 ｕ ｓ ｐ ．） ｌ ｎ
酶解液 ２ 在酶 基 础液 中加 入 Ｃ ｌ ｌ ｅＲ ， ｅ． ： ｅｕａ Ｓ Ｐｃ ｌｓ
ｔ ａｅＹ一 ３ 调节 ｐ ｏ ｓ ２ ， ｌ Ｈ为 ５ ８ ．。
１ 材 料 和方 法
１ Ｉ 原 生质体 的分 离 ．
两 步酶解法应 用 三种 酶 处理 ， 用 三 因素 四水 采 平 正交设 计法 。
原生 质体进行 细胞融合 ， 以实现远缘 遗传重 组 ， 可 创
2021年高考生物真题训练19 生物技术实践(原卷版)
专题19 生物技术实践1．（2020年山东省高考生物试卷（新高考)·20）野生型大肠杆菌可以在基本培养基上生长，发生基因突变产生的氨基酸依赖型菌株需要在基本培养基上补充相应氨基酸才能生长。
将甲硫氨酸依赖型菌株M和苏氨酸依赖型菌株N单独接种在基本培养基上时，均不会产生菌落。
某同学实验过程中发现，将M、N菌株混合培养一段时间，充分稀释后再涂布到基本培养基上，培养后出现许多由单个细菌形成的菌落，将这些菌落分别接种到基本培养基上，培养后均有菌落出现。
该同学对这些菌落出现原因的分析，不合理的是（）A．操作过程中出现杂菌污染B．M、N菌株互为对方提供所缺失的氨基酸C．混合培养过程中，菌株获得了对方的遗传物质D．混合培养过程中，菌株中已突变的基因再次发生突变2．（2020年浙江省高考生物试卷（7月选考)·19）下列关于微生物培养及利用的叙述，错误的是（）A．利用尿素固体培养基可迅速杀死其他微生物，而保留利用尿素的微生物B．配制培养基时应根据微生物的种类调整培养基的pHC．酵母菌不能直接利用糯米淀粉发酵得到糯米酒D．适宜浓度的酒精可使醋化醋杆菌活化3．（2020年江苏省高考生物试卷·16）甲、乙两个实验小组分别进行了“酵母细胞固定化技术”的实验，结果如下图所示。
出现乙组实验结果的原因可能为（）A．CaCl2溶液浓度过高B．海藻酸钠溶液浓度过高C．注射器滴加速度过慢D．滴加时注射器出口浸入到CaCl2溶液中4．（2020年江苏省高考生物试卷·18）某同学在线提交了在家用带盖玻璃瓶制作果酒和果醋的实验报告，他的做法错误．．的是（）A．选择新鲜的葡萄略泇冲洗，除去枝梗后榨汁B．将玻璃瓶用酒精消毒后，装满葡萄汁C．酒精发酵期间，根据发酵进程适时拧松瓶盖放气D．酒精发酵后去除瓶盖，盖一层纱布，再进行醋酸发酵5．（2020年江苏省高考生物试卷·19）为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌，培养结果如图所示。
2023届黑龙江省哈尔滨市第三中学高三上学期第一次验收考试(9月)生物
哈三中2022—2023学年度上学期高三学年第一次验收考试生物试卷一、单项选择题（本大题共50小题，1-10每题2分，11-50每题1分，共60分）1.从生命系统的角度理解，人体的结构层次为（）A.原子、分子、细胞器、细胞B.细胞、组织、器官、系统C.元素、无机物、有机物、细胞D.个体、种群、群落、生态系统2.如图所示的四个方框代表细菌、衣藻、木耳和蓝藻，其中阴影部分表示它们都具有的某种物质或结构。
下列各项不可能出现在阴影部分中的是（）A.DNA C. RNA3.绿藻被认为是21世纪人类最理想的健康食品，螺旋藻（属蓝细菌）特有的藻蓝蛋白能提高淋巴细胞活性，增强人体免疫力。
下列相关叙述错误的是（）C.绿藻有核膜，而螺旋藻没有D.二者都能光合作用，这与它们含有叶绿体有关4.人类食用奶制品、豆制品、肉类等富含蛋白质的食物消化后主要是为了吸收（）5.如图是由3个圆所构成的类别关系图，符合这种类别关系的是（）A. I脱氧核苷酸、II核糖核苷酸、III核苷酸B.I多糖、II几丁质、III麦芽糖C.I固醇、II胆固醇、III维生素DD. I蛋白质、II酶、III抗体6.下列物质中所含元素不同于其它各项的是（）7.生物大分子是由许多单体连接而成的多聚体。
下列有关叙述正确的是（）A.有的多聚体在胞内合成、胞外发挥作用8.《氾胜之书》是西汉晚期农学著作，是中国现存较早的一部农学著作，书中提到收获的粮食要“曝使极燥”，降低粮食的含水量后才入仓储存。
下列说法错误的是（）A.“曝使极燥”后，细胞中自由水含量大幅度减少，细胞的代谢降低B.种子生长发育的不同时期，细胞内自由水与结合水的比值可能不同C.“曝使极燥”使种子细胞的丧失全部结合水，从而抑制种子新陈代谢D.种子萌发形成根系后，吸收的无机盐是溶解于水中形成的离子9.植物利用硝酸盐需要硝酸还原酶，缺Mn2+的植物无法利用硝酸盐。
据此，对Mn2+的作用正确的推测是（）A.调节细胞的渗透压，对维持细胞的形态有重要作用B.硝酸还原酶发挥作用需要被激活，Mn2+是该酶的活化剂C.Mn是植物必需的大量元素，Mn2+是硝酸还原酶的组成成分D.维持细胞的酸碱平衡，对硝酸还原酶发挥功能有重要作用10.生物界有许多发光生物，如发光真菌、萤火虫等。
植物细胞培养及原生质体培养
最大特点是细胞生长速率标准一致，新形 成的细胞补偿了被排出的细胞，系统内细胞密度、 生长速度、化学成分、细胞代谢活性都维持恒定。 可通过改变培养基及培养条件建立恒定系统。
恒化控制：通过营养液或某一成分
恒浊控制：比浊计测定浑浊度而进行流量 控制。
2. 固相化培养技术：
细胞固定在一定的惰性基质中，如琼脂、海藻 酸盐、聚丙烯酰氨纤维膜上，细胞不能运动，但营养 液可以在基质中流动。
1
(二) 植物细胞培养的营养需求及培养基
１. 营养需求： 植物细胞生长所需营养较微生物细胞复杂， 除水分外，其它营养成分可分为如下几类：
(1) 无机营养: 如N、 P、K、Ca、Mg、Fe、Cu、Mn、Zn、B、Mo、I 等；
(2)维生素：如维生素B1、B6、烟酸、肌醇、生物素、泛酸钙及叶酸 等；
(3) 悬浮培养特点：
培养过程中细胞总数不断增加，一定时间后产量达 最高点，生长趋于停止。然后进行移植继代培养，其过 程表现出严格可重复周期性变化，细胞增长规律与微生 物相同，有延迟期、对数生长期、减慢期及静止期等阶 段。植物细胞接种时要达到一定细胞浓度，通常为0. 25 x l0‘细胞／ml 一0. 5 x 10‘细胞／m1。
A. 悬浮培养物分散性好，细胞团较小，一般由 几十个以下的细胞组成。
B. 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。
C. 生长迅速，悬浮细胞的量一般2—3天甚至更
短时间便可增加一。
(2) 培养过程：
将愈伤组织、无菌苗、吸涨胚胎或外植体芽尖、根 尖及叶肉组织，经匀浆器破碎、纱布或不锈钢网过滤， 单细胞滤液作为按种材料，接种于液体培养基中振荡培 养。
植物组织培养学论文
Liaoning Normal University（20--级）植物组织培养题目：果树组培研究进展学院：----学院姓名：----20--年--月果树组培研究进展摘要:基于组培苗的植物微嫁接技术广泛地应用于果树学的各项研究中。
本文探讨了组培苗微嫁接技术在果树中的主要应用，以为今后的转基因及育种工作提供参考。
关键词:果树组织培养应用生物技术在社会科技进步中发挥着越来越重要的作用，而组织培养技术则是生物技术的基本手段【1】。
植物组织培养是对细胞、组织的生长、分化及器官形态建成的规律进行研究的手段，它有力地推动了植物生理学、生物化学、遗传学、细胞学、形态学和农林等各类学科的发展和相互渗透【2】。
主要作用在于保存和交换珍稀濒危植物种质资源；加速世代繁殖，缩短育种周期，获得新基因型；促进幼胚发育，克服远缘杂交中的不亲和不育性等【3】植物组织培养指用无菌方法使植物体的离体器官、组织和细胞在人为提供的条件下生长和发育的所有培养技术的总称，也称之为离体培养或试管培养【4】。
近年来其在果树育种上的应用取得了较大进展，尤其在优良树种的快速繁育、种质保存和品种选育等许多领域得到了广泛应用，显示出巨大的潜力。
19世纪30年代，德国植物学家施莱登和德国动物学家施旺创立了细胞学说，根据这一学说，如果给细胞提供和生物体内一样的条件，每个细胞都应该能够独立生活；1902年，德国植物学家哈伯兰特细胞全能性的理论是植物组培的理论基础。
【5】1958年，一个振奋人心的消息从美国传向世界各地，美国植物学家斯蒂瓦特等人，用胡萝卜韧皮部的细胞进行培养，终于得到了完整植株，并且这一植株能够开花结果，证实了哈伯兰特在五十多年前关于细胞全能的预言。
植物组培的简单过程如下：剪接植物器官或组织——经过脱分化（也叫去分化）形成愈伤组织——再经过再分化形成组织或器官——经过培养发育成一颗完整的植株。
植物组培的大致过程是：在无菌条件下，将植物器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）的一部分切下来，用纤维素酶与果胶酶处理用以去掉细胞壁，使之露出原生质体，然后放在适当的人工培养基上进行培养，这些器官或组织就会进行细胞分裂，形成新的组织。
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苹果根原生质体分离条件的研究1于立杰，王忆，许雪峰，李天忠，韩振海中国农业大学园艺植物研究所/北京市果树逆境生理与分子生物学重点实验室，北京（100193）E-mail：rschan@摘要：以苹果属珠眉海棠(Malu zumi Mati)根为供体进行原生质体分离条件的研究，结果表明，酶解过程中酶液浓度、酶液渗透压、酶解时间均对原生质体分离效果产生重要影响。
对于珠眉海棠，一步酶解法、两步酶解法皆可以分离根原生质体，但两步酶解法优于一步酶解法。
两步酶解法的最佳分离条件为：Cellulysin28 mg•mL-1+ 纤维素酶(Cellulase RS)15 mg•mL-1 + 果胶酶(PectolaseY-23)2 mg•mL-1。
关键词：珠眉海棠；根系；原生质体；分离中图分类号：S661.11.引言原生质体是指植物细胞中除去细胞壁的裸露部分[1]，质膜上存在许多跨膜蛋白，在离子转运中起着重要作用[2]。
原生质体在研究植物转基因、组织再生、跨膜离子转运中能够作为重要的材料[3]。
利用原生质体进行细胞融合，可以实现远缘遗传重组，创造新的遗传型；转移抗逆性状，改良作物品质；转移细胞质基因控制的性状。
原生质体还可以作为受体进行基因重组与转移，培养优质高产新品质，提高植物细胞中次级代谢物质含量[4,5]。
所有成功的原生质体培养都是采用酶解法分离原生质[6]。
膜片钳技术可以测定质膜离子通道，而在测定过程中原生质体的分离状况对测定起着至关重要的作用[7 ,8]。
目前对苹果根系原生质体分离的研究国内外鲜见报道[9,10]，影响了以原生质体为试验对象的苹果细胞学及新种质创造的进程。
因此，本文以苹果属植物珠眉海棠为试材，对影响其根系原生质体分离效果的诸因素进行研究，旨在确定获取高产优质原生质体的适宜条件，为利用原生质体研究苹果电转化和基因枪细胞中离子跨膜运输和转基因过程中转化等提供材料和技术基础。
2.材料和方法2.1原生质体的分离将珠眉海棠(M.zumi)水培3-6个月的幼苗的白色幼嫩初生根切成0.5-1.0 mm小段，按材料：酶液＝1：10的比例置于酶解液中。
酶解液经0.22 µm混合纤维素孔滤膜过滤灭菌。
在水浴振荡器中酶解。
酶解结束后，将原生质体连同酶解液经400目尼龙滤网过滤，以除去未酶解完全的细胞团或组织，将滤液转移至离心管中，用1000 r/min离心5 min，弃上清，留沉淀，再加入洗液，充分混匀后，离心5 min。
此过程重复3次，收集原生质体备用。
1本课题得到教育部博士点基金（20050019048）、国家自然科学基金（30671441）和北京市果树逆境生理与分子生物学重点实验室的资助。
2.1.1一步酶解法酶解液为：纤维素酶（Cellulase R-10），果胶酶（Pectolase Y-23），0.45 mol/l山梨醇，2 mmol/LCaCl2，1 mmol/LMgCl2，2 mmol/L葡聚糖硫酸钾。
用Mes-Tris调节pH为5.5。
水浴振荡器中(25±1 ℃，40-60 r/min) 酶解12-16h。
共设20种酶处理浓度组合：Cellulase R-10浓度分别为5、10、15、20 mg•mL-1，Pectolase Y-23浓度分别为1、2、3、4 mg•mL-1。
2.1.2两步酶解法酶基础液：2 mmol/LCaCl2，1 mmol/L MgCl2，0.05 mg•mL-1牛血清白蛋白(BSA)，0.044 mg•mL-1抗坏血酸(VC)，0.5 mg•mL-1 PVP。
酶解液1：在酶基础液中加入28 mg•mL-1 Cellulysin（pH 5.8）。
酶解液2：在酶基础液中加入Cellulase RS，Pectolase Y-23，调节pH为5.8。
两步酶解法应用三种酶处理，采用三因素四水平正交设计法。
表1两步酶解法试验因素水平表Table1 Factors and Levels of the Test for the Two-step Method水平LevelACellulysin/mg·mL-1B果胶酶Pectolase Y-23/mg·mL-1C纤维素酶Cellulase R-10/mg·mL-11 21 152 28 2103 35 3154 42 420先将根段置于酶解液1中，在水浴振荡器中（25±1 ℃，100 r/min）酶解40 min，用100目尼龙滤网过滤，冲洗；而后将根段放入酶解液2（Cellulase RS、Pectolase Y-23(pH5.8)）中酶解100 min。
2.1.3不同渗透浓度和不同处理时间对原生质体分离的影响渗透调节剂采用山梨醇，处理浓度分别为0.35 mol•L-1、0.45 mol•L-1、0.55 mol•L-1、0.65mol•L-1、0.75 mol•L-1。
一步酶解法中处理时间：6、8、10、12、14、16 h两步酶解法中处理时间：第一步酶解进行20、30、40、50 min处理，第二步酶解进行1、1.5、2 h处理。
2.2 原生质体产量和活力的测定2.2.1原生质体产量测定将收集到的原生质体稀释2~5倍后，滴加在血球计数板上，计算原生质体数，每个样品计数6个重复，最后计算出原生质体产量。
2.2.2 原生质体活力的测定活力测定采用FDA染色法，以不染色的原生质体占总观察数的百分率，即存活率来表示。
重复3次。
3．结果与分析3.1 一步酶解法中酶浓度对原生质体分离的影响表2一步酶解法中纤维素酶和果胶酶对苹果根原生质体分离的影响Table2 Effects of cellulase and pectolase on root protoplasts isolation by one-step method纤维素酶Cellulase R-10 /mg·mL-1果胶酶Pectolase Y-23/mg·mL-1原生质体产量Yield/106•g-1 FW原生质体活力Viability/%5 110.2ij13.4jk5 222.1ef18.7ij5 317.5fgh17.9ij5 48.6j9.7k10 114.4ghij26.3gh10 224.5e57.4ab10 326.8de21.3hi10 411.6hij14.5jk15 118.2fg30.6fg15 248.6a62.3a15 342.1b46.7bc15 421.9ef37.6de20 114.5ghij21.8hi20 241.8b35.2ef20 332.5cd42.9cd20 417.7fgh22.6hi 注：不同字母代表有显著性差异P＜0.05表2表明，在试验浓度范围内，同一纤维素酶浓度下，随果胶酶浓度提高，原生质体产量和活力先升高再降低，其中以果胶酶2 mg·mL-1或3 mg·mL-1时产量高；4 mg•mL-1果胶酶的酶解物中存在大量碎片，这可能与高浓度果胶酶对分离的原生质体的毒害及破坏作用有关；而1 mg•mL-1的果胶酶由于浓度低，不足以酶解出足量的原生质体，从而造成产量下降。
同一果胶酶浓度下，随纤维素酶浓度由5 mg•mL-1至20 mg•mL-1，产量和活力明显增加；在15 mg•mL-1纤维素酶与试验的几种果胶酶浓度配合时，产量及活力均达最佳；其中以15mg•mL-1纤维素酶与2 mg•mL-1果胶酶配合时效果最好。
试验中还使用其它的酶进行处理，低浓度半纤维素酶对分离根系原生质体影响不大，浓度高时酶解碎片增多，不易纯化。
5 mg•mL-1的蜗牛酶和1 mg•mL-1的崩溃酶也造成原生质体的伤害，产生大量碎片。
因此采用一步酶解法分离根系原生质体的最佳组合为纤维素酶15 mg•mL-1＋果胶酶2 mg·mL-1。
3.2 两步酶解法中酶浓度对原生质体分离的影响表3两步酶解法正交试验结果Table3 Results of Two-step Method by Orthogonal Test DesignA /mg•mL-1B/mg•mL-1C/mg•mL-1原生质体产量Yield/106•g-1 FW原生质体力Viability/%1 2 2 20.4ef 26.5fgh1 3 3 24.3e 43.8cd1 4 4 13.1gh 33.6ef2 1 2 11.3ghi 21.1hij2 23 52.1a 63.3a2 3 4 17.4fg 52.2b2 4 1 9.2hij 17.5ij3 1 3 32.5cd 47.9bc3 24 41.8b 53.1b3 3 1 5.6ij 15.4j3 4 2 34.4c 31.7efg4 1 4 8.2hij 24.5ghi4 2 1 10.6hi 42.3cd4 3 2 25.9de 38.6de4 4 3 13.4gh 29.3fg 注：不同字母代表有显著性差异P＜0.05从表3可以看出，在试验浓度范围内，同一Cellusysin浓度下，随果胶酶和纤维素酶浓度提高，原生质体产量和活力先升高再降低，其中以果胶酶2 mg•mL-1时产量和活力高，这可能是高浓度果胶酶致使原生质体产生大量碎片，而1 mg•mL-1的果胶酶由于浓度低，不足以酶解出足量的原生质体，从而造成产量下降、活力降低；在同一果胶酶浓度下，随纤维素酶浓度由5 mg•mL-1至20 mg•mL-1，产量和活力表现出明显的增加。
一定的纤维素酶和果胶酶浓度下，28 mg•mL-1 Cellulysin时原生质体产量和活力最高。
由此可见，以28 mg•mL-1Cellulysin +15 mg•mL-1纤维素酶+2 mg•mL-1果胶酶配合时两步分离法分离根质膜的效果最好。
3.3 渗透调节剂对原生质体分离的影响表4结果表明，在较低的渗透条件下(0.35 mol•L-1)，原生质体活力及产量均低；随渗透压升高，原生质体产量及活力均升高，渗透压为0.45 mol•L-1时产量和活力达到最高；以后随渗透压的提高，产量和活力降低，至渗透压升为0.75 mol•L-1时，产量和活力都很低。
表4 渗透压对原生质体分离的影响Table 4 Effect of osmotic pressure on the protoplast isolation山梨醇Sorbitol /mol•L-1原生质体产量Yield106•g-1 FW原生质体活力Viability/%甘露醇Mannitol/mol•L-1原生质体产量Yield/106•g-1FW原生质体活力Viability/%0.35 22.6c 41.7b 0.35 26.3b 39.4b0.45 38.6a 61.3a 0.45 33.7a 55.8a0.55 34.4b 45.9b 0.55 29.1b 32.6c0.65 13.6d 26.2c 0.65 11.3c 20.9d0.75 4.1e 8.3d 0.75 8.6c 7.8e 注：不同字母代表有显著性差异P＜0.05因此，适宜的苹果根原生质体分离的渗透压为0.45 mol•L-1。