第6章 转基因技术

4、精子载体法
将成熟的精子与外源DNA进行预培养 之后，使精子有能力携带外源基因进入卵 子，从而使外源基因整合于宿主基因组中。 这种方法具有简单有效的特点。
基因转移除了上述方法以外，又发展起来一 些 新的 方法 ，如 人工 酵母 染色 体 (yeast artificial chromosome,YAC)法、电 括以下几个方面：
➢ 基因表达与调控的研究 ➢ 改造动物个体遗传性状 ➢ 抗病转基因动物育种 ➢ 制作人类疾病及遗传病的转基因动物模型 ➢ 肿瘤发生机理研究及肿瘤预防和治疗方面
的应用 ➢ 利用转基因动物作为“生物反应器”生产
目的蛋白
1、基因表达与调控的研究
利用外源基因在转基因动物中的特异表达， 研究外源基因在动物体内的活动规律，从而弄清真 核细胞的基因调控方式。
但原核显微注射法技术难度比较大，不仅 需要昂贵的仪器，而且需要一定的操作技巧。
基因原核注入 显微图像
2、逆转录病毒感染胚胎法
将外源基因重组到DNA病毒或RNA病毒上， 再用重组的DNA病毒或RNA病毒去感染着床前后 的胚胎，随着病毒基因插入到宿主胚胎基因组中， 外源基因也自然整合到胚胎基因组中。
2、外源基因的导入
即基因转移，利用显微操作或其它方 法把外源基因注入到动物早期胚胎中，再 把胚胎植入到动物子宫内，发育成的个体 不仅能表达注入基因决定的性状，而且能 把该基因传到第二代。
3、外源基因整合与表达的检测
转入的基因一般是随机整合到宿主动物 基因组，但并非所有的外源基因都能整合到 动物基因组，而整合的基因也并非都能表达。 通过显微注射将外源基因导入后，大部分基 因在细胞经过几次分裂后就丢失，只有一少 部分DNA得以整合。
这项技术对家禽病的防治很有意义。
4、制作人类疾病及遗传病的转基因动物模型
将产生某些疾病或遗传病的基因作为外源基 因转移，构建出人类遗传病的转基因动物模型， 用以研究某些疾病或遗传病的致病机理及治疗方 法等。
目前已经构建的模型有乙型肝炎和高血压转 基因动物模型，-地中海贫血病转基因动物模型是 一种遗传病动物模型。
DNA
显微注射 电脉冲法 YAC法
受精卵
4-cell
DNA
DNA转染、电转移 反转录病毒感染
胚胎干细胞
显微注射
囊胚
原肠胚
精 精子
子 载 体
法 DNA
卵子
反转录病毒感染
DNA
转基因 动物
几种转基因方法及其与受精卵不同发育阶段的关系
三、转基因动物的理论和实践意义
自从转基因动物技术出现以来，各国政府 纷纷投资开展这项工作，现已建立了转基因小 鼠和大鼠，转基因兔、猪、牛、羊等。这不仅 因为转基因动物具有重要的理论意义，而且还 具有实用价值，能够创造巨大的经济效益。
5、肿瘤发生机理研究及肿瘤预防和治疗方面的应用
将可能激发肿瘤的基因导入小鼠受精 卵中，制作出具有肿瘤倾向的肿瘤转基因 动物模型，使人们可以在整体水平上系统 地研究不同癌基因在细胞分化、增殖中的 作用，同时也为肿瘤药物的测试和筛选提 供了良好的实验材料。
6、利用转基因动物作为“生物反应器”生产目的蛋白
1987年，美国科学家首先从转基因小鼠的乳汁中 获得了治疗急性心肌梗塞最好的溶血栓药物t-PA（组织 纤维蛋白溶酶原活化因子）。
近几年来，已有数百种产品在小鼠乳腺获得高效表 达，其中数种重要医用产品已在大动物乳汁中生产出来， 即将投放市场，如山羊乳腺表达抗凝血酶Ⅲ(AT Ⅲ)、tPA均达到6 g/L，绵羊乳腺表达抗胰蛋白酶（AAT）达到 35 g/L，家兔乳腺表达葡萄糖苷酶达到10 g/L，猪乳腺 表达蛋白Ｃ达到1 g/L、第八因子（F-Ⅷ）达到3 g/L， 奶牛乳腺表达乳转铁蛋白达到3.5 g/L。
二、转基因动物的技术方法
目前，动物转基因的方法已发展成许多种，其中 主要方法如下：
原核显微注射法 逆转录病毒感染胚胎法 胚胎干细胞法 精子载体法
1、原核显微注射法
显微注射法是通过显微操作仪将外源基因 直接注射到受精卵的原核中，该法是产生最早 且又最为有效的转基因方法，目前使用非常广 泛。
目前，利用转基因动物已进行了组织特异性 基因、发育调控基因的表达及增强子的定位研究。
2、改造动物个体遗传性状 主要应用于畜牧业，通过基因转移
改变动物的基因型，达到改良动物品种 的目的。
如转基因的瘦肉型猪、产奶量高的 牛等。
3、抗病转基因动物育种
先克隆出某种抗病基因，再将此基因 转入宿主动物受精卵中，培育出对某种疾 病具有抵抗力的转基因动物。
逆转录病毒感染胚胎法是近年来兴起的基因转 移方法，操作相对简单而且感染后基因的整合效率 高。
3、胚胎干细胞法
利用ES细胞被注射到宿主囊胚中可参与胚胎发 育形成嵌和体胚胎的特点，首先将外源基因导入ES 细胞，再将ES细胞注射到宿主囊胚中，参与宿主发 育形成转基因动物。
由于目前ES细胞的研究只有小鼠比较成功，所 以用ES细胞途径制作的转基因小鼠比较多，而其它 如牛羊等大型动物ES细胞研究尚未成熟，无法应用 ES细胞途径进行转基因动物制作。
本章内容到此结束
谢谢大家
（1）目的基因的获得：
✓ 利用限制性内切酶获取目的基因； ✓ 利用mRNA反转录出cDNA； ✓ 人工体外合成DNA片断； ✓ PCR法扩增特定基因片断。
（2）目的基因的克隆与重组：
要把基因转入宿主细胞，首先要把基因克 隆化，然后，给目的基因接上适当的启动子进 行重组，以使外源基因有效地整合和表达。目 前已经得到了若干真核细胞克隆化基因，如珠蛋白基因、TK基因等。
动物生物反应器(bioreactor)是指利用转基 因活体动物的某种能够高效表达外源蛋白的器官或 组织来进行工业化生产活性功能蛋白的技术，这些 蛋白一般是药用蛋白或营养保健蛋白。
国际上通常把目的基因在血液循环系统或乳腺 中表达的转基因动物称为“动物生物反应器”。其 中动物乳腺生物反应器是目前国际上惟一证明可以 达到商业化生产水平的生物反应器。
YAC法是以YAC作为载体进行基因转移，其优
点是可以用YAC携带大片段的基因(30～150万 bp)。
电脉冲法主要用于鱼类转基因研究，因为有些
鱼类的卵壳较硬，而且看不清受精卵原核， 所以用显微注射法进行转基因比较困难，而 将鱼的受精卵放入外源基因溶液内，并施以 一定的电脉冲，就可得到一定整合率的转基 因鱼。
第六章 转基因技术
转基因技术是把已知基因转移到真 核细胞，并整合到基因组中得到 稳定表达的技术。是改变物种遗 传性状的最根本途径。
转 基 因 技 术 是 1980s 初 兴 起 的 一 项 生 物高技术，1980年，Gordon将克隆的外 源基因导入小鼠受精卵的雄原核中，率先 获得了转基因动物。
目前，转基因技术在动、植物方面都 有开展，而且正以强劲的势头在发展。
通过人工操作的方式，将外源基因整合到 动物的基因组内，使该动物能稳定地将此基因 遗传给后代的实验技术就称为转基因动物技术。
转基因动物最早最成功的例子 是“超级小鼠”（supermouse） 的诞生。
这一成果的意义在于不仅为遗传 工程和遗传疾病的研究提供了模型， 而且也为加速经济动物的生长提供了 新的技术途径。
因此，需要对转基因动物进行严格的筛 选！
目前常用的检测手段是利用PCR方法结 合Southern blot杂交法来检测外源基因是否 整和并表达。
只有外源基因整和并表达的动物才是真 正的转基因动物。
转基因小鼠的制做过程图解
在转基因动物制作中，基因转移是影 响外源基因整合效率的十分关键的一个步 骤，也是技术难度最大的一个步骤，基因 转移需要熟练的操作技术和技巧。
讲授提纲
一、转基因动物的制作过程 二、转基因动物的技术方法 三、转基因动物的理论和实践意义
一、转基因动物的制作过程
转基因动物技术是一项复杂而且涉及内容 广泛的技术，其制作过程大致如下：
1、目的基因的获得、克隆与重组 2、目的基因的导入 3、目的基因整合与表达的检测
1、目的基因的获得、克隆与重组