酶分子定向进化
酶定向进化
天然酶的稳定性差,活性低使催化效率很低,还
缺乏有商业价值的催化功能
天然酶的局限性源于酶的自然进化过程.
现代生物工程的要求
能具备长期稳定性和活性 能适用于水及非水相环境 能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底 物 能够在特殊环境中合成和拆分制作新药物或药物 的原材料 如何利用相对简单的方法以达到对天然酶的改造 或构建新的非天然酶就显得非常有研究意义和应 用前景.
1.平板筛选法
平板筛选法所依据的重组细胞的表型包括细
胞生长情况、颜色变化情况、透明圈情况。 1）依据细胞生长情况筛选突变基因 在提高酶的热稳定性、抗生素耐受性、pH稳 定性和对其他极端环境条件的耐受能力等方 面有广泛应用。
2）依据颜色变化筛选突变基因
片断 （lacZ′）插入到噬菌体DNA的间隔区域中，当它 感染了相应的大肠杆菌宿主细胞时，在含有IPTG和 底物X－gal的平板培养基上可以形成蓝色噬菌斑。 （2）在对磷酸酯酶进行定向进化的过程中，可以在 平板培养基中加入硝基酚磷酸，接种重组细胞培养 一段时间后，有些重组细胞周围出现黄色（硝基 酚）。
二、突变基因的筛选
（一）定向选择环境条件的设定 （1）提高酶的稳定性，高温筛选重组细胞，每一次 突变－筛选的循环中逐步提高重组细胞的培养温 度。 （2）如果定向进化的目的是提高β－内酰胺酶的活 性，从而提高对β－内酰胺酶类抗生素的耐受性， 可以通过在含有一定浓度的β－内酰胺酶类抗生素 的培养基中培养重组细胞，并在每一次突变－筛 选循环中逐步提高抗生素的浓度。 （二）高通量筛选技术P217表8－2
特点 正突变的概率低，突变基因较大，筛选的工作量大，一般适用于较小基因的定 向进化。
实例
枯草杆菌蛋白酶:洗涤剂合成、鞣革和医药领域的重 要工业酶制剂。 Chen 等采用易错PCR 对该酶进行了体外进化研究。 他们通过降低反应体系中dATP 的浓度, 对编码该酶 从第49 位氨基酸到C 端的DNA 片段进行易错PCR , 经筛选得到的几个突变株在高浓度的二甲基甲酰胺 (DMF) 中酶活性明显提高 突变体PC3 在60 %的DMF 中, 酶活力是野生型的 256 倍。将PC3 再进行两个循环的定向进化, 得到的 突变体13M酶活力比PC3 还要高3 倍。
第八章酶分子的定向进化概要
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三、发展阶段
易错PCR(error-prone PCR)和DNA改组方 法成功开发标志着酶分子定向进化技术的成 熟。 在酶分子的定向进化改造中，易错PCR和 DNA改组技术配合使用通过随机突变和优势 重最早使用的载体系统，在载体本身的设计方面
已经相当成熟。 优点：
插入片段的载容量大，适合于大片段的克隆。 感染效率高、鉴定容易，有较好的质量控制指标。 基因质量高、代表性好，稳定性好，适合长期
▪ 酶分子的定向进化（directed evolution）即属于 蛋白质的非合理设计。
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三、发展方向
酶催化的精确性和有效性往往并不能满足通常的工业 化要求，天然酶通常缺乏有商业价值的催化功能及其 他性质。因此，对天然酶分子水平上的改造，显得十 分重要。
酶分子仍具有巨大的进化潜力，是酶的体外定向进化 的基本先决条件。
关于外显子在蛋白质进化中的作用有两种观点：
“原生内含子”假说：认为当前所有的蛋白质都 经过外显子改组；
“后生内含子”假说：认为外显子改组仅出现在 真核细胞中，以提高这些生物基因的韧性。
两种假说都承认外显子改组是蛋白质进化的重要 机制，因此人为模拟此自然进化过程定向进化酶 分子将是获得新酶的颇具吸引力的途径。
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七、突变库的构建及应用（一）构建理想的基因要考虑的因素1.基因的质量
（1）基因的代表性中包含的DNA分子应能完整地反映来源基因
（2）突变基因片段的序列完整性中重组或突变DNA片段应尽可能完整地反映出天然 基因的结构。
酶工程_酶分子定向进化.
部分DNA Shuffling技术的研究成果
类 型 示 例 蛋 白 绿色荧光蛋白 重组蛋白RecA 抗 体 人源抗体 特 性 荧光强度 重组率 亲和性
生物的自然进化
进化过程：
突变→自然选择→遗传后代
进化结果：
基因多样性：为完成同一功能所表现出的
多个 基因或同一个基因 (同源性) 代谢途径的多样性：同样产物，多条途径 代谢产物的多样性：同一底物，不同产物
生物多样性：整个生态系统中的生物
酶的定向进化
• 酶分子的合理设计(rational design)
提高耐热性
易于观察的菌落表型（如菌落颜色等）
营养缺陷型的辅助筛选
噬菌体展示、细胞表面展示
根据所需要的胞表面）的表现特征进行筛选，获得提高目的底 物亲和力的突变子。减少筛选工作量突变→大的突变子库→小的突变子库→ 单克隆
Nhomakorabea• 酶分子的定向进化(directed evolution)
酶的合理 设计
体外定向进化的意义
• 理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力， 很多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化 的基本先决条件。 • 所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化， 属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶 的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊 的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组 和自然选择)，在体外改造酶基因，并定向选 择出所需性质的突变酶。 • 酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工 程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理 设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能研 究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和 医药等领域逐渐显示其生命力。
What happens after DNA shuffling
酶分子定向进化
3）依据透明圈情况筛选突变基因
依据透明圈情况筛选突变基因是在平板培养 基中加入目的酶的作用底物，然后接种重 组细胞，在一定条件下进行培养，培养一 段时间后，在一些重组细胞的菌落周围会 出现较大的透明圈。
第四节 酶定向进化的应用
一、提高酶的催化效率 二、增加酶的稳定性 三、改变酶的底物特异性
小基因 的定向进化。
二 DNA重排技术
• 概念片断，经过不加引物的多次PCR循 环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基 因突变的技术过程。
• 细胞定向进化是在细胞水平上进行定向进 化的过程，以各种细胞为进化对象，目的 是改良细胞的各种特征，主要包括微生物 细胞的定向进化、动物细胞的定向进化、 植物细胞的定向进化等。 • 随机突变方法有全基因组重排技术。 • 基因组重排技术通过把诱变与细胞融合技 术相结合，对细胞进行基因组重排，从而 大幅度增加细胞的正突变频率。
一 平板筛选法
• 平板筛选法所依据的重组细胞的表型包括 细胞生长情况、颜色变化情况、透明圈情 况。 1）依据细胞生长情况筛选突变基因 在提高酶的热稳定性、抗生素耐受性、pH稳 定性和对其他极端环境条件的耐受能力等 方面有广泛应用。
2）依据颜色变化筛选突变基因
片断 （lacZ′）插入到噬菌体DNA的间隔区域中，当 它感染了相应的大肠杆菌宿主细胞时，在含有 IPTG和底物X－gal的平板培养基上可以形成蓝色 噬菌斑。 （2）在对磷酸酯酶进行定向进化的过程中，可以在 平板培养基中加入硝基酚磷酸，接种重组细胞培 养一段时间后，有些重组细胞周围出现黄色（硝 基酚）。
分子定向进化
• 分子定向进化是在分子水平上进行定向进 化的过程。 • 分子定向进化首先要通过从细胞内提取或 者通过PCR等方法获得目标分子的基因，在 体外采用易错PCR 、ＤＮＡ重排、基因家 族重排等技术进行人工突变，然后进行定 向选择而获得所需突变体。
酶定向进化的原理和步骤
酶定向进化的原理和步骤
酶定向进化（enzyme directed evolution）是一种通过人为引
导的、基于自然选择原则的酶改造方法，可以用于提高酶的活性、稳
定性、底物范围等性质，以满足特定需要。
其原理和步骤如下：原理：
1. 酶定向进化是基于自然选择的原理。
通过引入随机突变和筛选操作，筛选出具有所需性质的变体酶，再通过重复这一过程，逐步改进和优
化酶的性能。
步骤：
1. 随机突变：通过诱发突变（例如随机突变、DNA Shuffling等）引
入酶的突变，得到一组具有多样性的突变体酶库。
2. 筛选/选优：通过选择性试剂、高通量筛选系统等手段，筛选
出表现出所需性质的突变体酶。
这一步骤需要对酶的目标特性进行准
确的定量、定性检测。
3. 特异突变体筛选：从筛选中得到的酶变体中，选出表现最佳
的数个突变体。
4. 突变组合：根据选出的突变体酶，通过多种方式（例如DNA Shuffling等）进行突变位点的组合，产生更多的突变体酶。
5. 筛选与优化：通过筛选和优化，选出具有更好性质的突变体酶。
6. 反馈循环：重复上述步骤，逐步优化酶的性质，直到满足所需。
总体来说，酶定向进化是通过不断引入突变和选择操作来改良酶
的性能，然后通过逐步筛选和优化的方式，在突变体酶库中逐渐筛选
出具有所需特性的酶。
第八章酶的定向进化
结果对单基因进化得到的突变酶中，对头孢羟羧氧胺的抗性最高的增加了8倍，而用家族同源重组进化的方法使抗性比其中两种微生物 来源的天然酶提高270倍，比段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱因与载体重组，再转入 适宜的细胞或包装成重组λ黏粒载体
➢ 转化 ➢ 噬菌粒载体
➢ 转导
2、突变基因的筛选 （1）定向选择环境条件的设定 （2）高通量筛选技术
定向进化的特点 ➢ 适应面广； ➢ 目的性强； ➢ 效果显著。
定向进化的原理 ➢ 以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突
变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化 酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。 ➢ 定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。 ➢ 定向进化=随机突变+定向选择。
2、DNA重排技术为代表的有性进化 DNA重排技术：又称DNA改组技术，有性PCR片段，经过不加引物的 多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引 起基因突变的技术突变频率高，进化速度快。 ➢段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起 突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变 体。
定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。
改变四种底物浓度比等。
2、DNA重排技术为代表的有性进化 定义：将各种不同突变基因与载体重组，再转入适宜的细胞或包装成重组λ噬菌体的技术过程。 1、突变基因的构建 适用：较小基因的定向进化。
属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制。
酶分子的定向进化（directed evolution）：模拟自然进化过程（随机突变和自然选择），在体外进行酶基因的人段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起
酶工程_酶分子定向进化
DNA改组和外显子改组
DNA改组（DNA shuffling）又称有性
PCR(sexual PCR)，原理。 该策略的目的是创造将亲 本基因群中的突变尽可能组合的机会，导致更大的变 异，最终获取最佳突变组合的酶。通过DNA改组, 不 仅可加速积累有益突变，而且可使酶的2个或更多的 已优化性质合为一体。
• 酶分子的定向进化(directed evolution)
酶的合理 设计
体外定向进化的意义
• 理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力， 很多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化 的基本先决条件。 • 所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化， 属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶 的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊 的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组 和自然选择)，在体外改造酶基因，并定向选 择出所需性质的突变酶。 • 酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工 程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理 设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能研 究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和 医药等领域逐渐显示其生命力。
TLPs 的失活曲线
TLP-ste突变蛋白的三维结 构
酶拓扑结构的变化
蛋白质的耐热机制
• 天然耐热蛋白质特性：
减少内腔体积；引入盐桥束；减少表面积 /体积比； 除去氧化还原活性基；埋藏暴露的疏水基；除去 -支链氨基酸；除去能脱氨基的氨基酸。 所有耐热蛋白质的氨基酸同源性低至36%，最高不 超过75%。
• 分子进化耐热蛋白质特性：
邻-硝基苯酯酶（p-nitrobenzyl esterase）突变 体8g8的了稳定性提高了17C，但突变的氨基酸数 仅有13个，与天然酯酶同源性高达97%。
基因直接进化的步骤
酶定向进化的原理和步骤
酶定向进化的原理和步骤酶定向进化（Enzyme Directed Evolution）是一种模仿自然界生物进化机制的方法，用于创造或改良具有特定功能的酶。
这种方法通常涉及到以下几个关键步骤：
原理：
酶定向进化是基于达尔文的自然选择原理，通过迭代的方式筛选和优化酶的活性。
这个过程模拟了自然环境下生物进化的过程，但是速度快很多，可以在实验室条件下完成。
步骤：
1. 目标功能的确定：首先，研究人员需要确定希望改进或获得的酶的目标功能，例如催化特定反应的能力、耐受极端环境的稳定性等。
2. 构建突变库：接着，通过各种手段（如PCR、DNA合成错误、化学转化等）在酶的编码基因中引入随机突变，构建一个含有大量遗传变异的突变库。
3. 筛选和选择：将突变库中的所有突变酶进行表达，并通过高通量筛选技术检验它们的功能。
这可能包括在体外测试它们的催化活性，或者在宿主细胞内评估它们的表达水
平和稳定性。
4. 定向进化循环：挑选出表现最佳的突变酶，再次引入新的突变，然后重复筛选和选择过程。
每一轮的筛选都是针对之前未满足的特性进行的，以期望逐步逼近理想的酶功能。
5. 分析和优化：在定向进化的过程中，可以通过测序、X射线晶体学、核磁共振等技术来分析酶的结构和功能关系，以指导后续的突变策略。
6. 验证和应用：最后，经过多轮优化的酶将被验证其在实际应用中的性能，并可能被进一步开发作为商业产品。
酶定向进化技术已经成功应用于多种酶的改造，包括氨基酸转运蛋白、脂肪酶、淀粉酶等，并且在药物制造、生物燃料生产、食品工业等领域显示出巨大的潜力。