生物酶工程
生物学中的生物催化与酶工程
生物学中的生物催化与酶工程生物学是关于生命的科学，而生物催化和酶工程则是生物学中非常重要的分支领域。
本文将介绍生物催化和酶工程的基本概念、应用以及未来的发展方向。
一、生物催化的概念与应用生物催化是指利用活体催化剂（生物催化剂）提高化学反应速率的过程。
生物催化剂主要包括酶和酵母等，它们能够在温和的温度和压力条件下催化特定的化学反应。
生物催化在工业上有重要的应用，如在食品工业中用于酿造酒精、制作乳制品；在制药工业中用于合成医药中间体或活性成分；在能源领域中用于生物燃料电池等。
二、酶工程的概念与应用酶工程是利用化学、生物学和工程学相结合的方法对酶进行研究和改造的过程。
通过酶工程，可以改变酶的特性，使其适应不同的工业生产需求。
常见的酶工程方法包括基因工程、蛋白质工程以及进化工程等。
酶工程在制药、食品、能源等方面有广泛的应用，例如通过改造酶的催化活性和稳定性，提高工业反应的效率和产率。
三、生物催化与酶工程的发展随着分子生物学和蛋白质研究的进步，生物催化和酶工程正处于快速发展的阶段。
近年来，大规模测序技术的发展为发现和筛选新的生物催化剂提供了更多的可能性。
同时，酶的催化机制和结构也得到了更深入的研究，为酶的改造和优化提供了更多的理论基础。
未来，生物催化与酶工程有望在以下几个方面取得突破和进展：1. 多功能酶的设计与合成：通过理性设计和合成，开发具有多种催化能力的酶，实现复合反应的高效催化。
2. 酶的固定化与稳定性提升：提高酶的稳定性和抗脱活性，降低生物催化反应的成本和能耗。
3. 酶的高效发酵与生产过程优化：通过工程菌株优化、发酵工艺改进等手段，提高生物催化反应的产率和效率。
4. 酶与纳米技术的结合：利用纳米材料的特殊性质，对酶进行修饰和包覆，提高酶的稳定性和催化活性。
综上所述，生物催化与酶工程是生物学中一门重要的分支领域。
随着科学技术的不断进步，生物催化和酶工程在工业应用和基础研究领域将发挥更为重要的作用，为人类带来更多的福祉和发展。
生物催化与酶工程
生物催化与酶工程生物催化，即利用生物催化剂（酶）对底物进行特异性催化转化的过程，是一种绿色环保、高效可持续的化学合成方法。
酶工程作为生物催化的关键领域，研究了酶的选择和设计，以提高催化效率和底物特异性。
本文将重点讨论生物催化与酶工程的原理、应用和发展前景。
一、生物催化的原理生物催化是利用酶的特异性催化底物的化学反应。
酶是一种生物大分子，由氨基酸组成，具有复杂的三维结构。
其活性位点与底物结构互补配对，通过形成酶底物复合物，使底物发生催化反应，生成产物。
生物催化具有高效选择性、温和条件、可逆性和不产生污染等优点。
二、酶工程的应用1. 医药工业：酶工程在药物的合成、转化和纯化过程中发挥着重要作用。
通过对酶的改造和优化，可以生产出具有更好活性和稳定性的药物。
例如，利用酶催化合成酶抑制剂，可以有效治疗多种疾病。
2. 食品工业：酶工程在食品加工中广泛应用。
例如，利用改造的淀粉酶可以提高面包的质量和口感，利用改造的蛋白酶可以提高奶酪的风味和质量。
3. 生物燃料工业：酶工程在生物质转化为生物燃料的过程中发挥着重要作用。
通过改造酶的底物特异性和催化活性，可以提高生物质的转化率和产物选择性。
4. 环境保护工业：酶工程在废水处理、废弃物降解等环保领域有广泛应用。
通过利用酶的催化特性，可以高效降解废水中的有机污染物，实现废水的净化和资源化利用。
三、酶工程的发展前景酶工程作为一门新兴的交叉学科，具有广阔的发展前景。
随着基因工程和蛋白工程等技术的不断进步，酶工程的研究和应用将会得到进一步的提升和拓展。
未来，可以通过对酶的高通量筛选和智能设计，开发出更高效、更稳定的酶催化剂。
同时，酶工程还可以与其他领域相结合，如纳米技术、材料科学等，开创出更多新的研究和应用领域。
总结：生物催化与酶工程作为一种绿色可持续的催化方法，在医药工业、食品工业、能源工业和环境保护等领域有广泛的应用前景。
随着酶工程技术的不断发展和创新，我们可以更好地利用酶的催化特性，解决许多现实中面临的难题，并推动工业生产和科学研究的发展。
酶工程与生物催化
酶工程与生物催化酶工程是一门利用生物催化技术对酶进行研究、应用和开发的科学。
生物催化是利用酶作为催化剂来促进和加速化学反应的过程。
在现代生物技术的推动下，酶工程和生物催化已经成为生物制药、食品加工、环境保护等领域中重要的研究和应用方向。
一、酶工程的基本概念与原理酶是生物催化过程中起关键作用的大分子催化剂，能够在温和的条件下加速化学反应的速率，提高反应的选择性和效率。
酶工程的基本概念是指通过改变酶的结构和性质，使其在特定条件下具有更高的催化活性和稳定性。
酶工程主要包括两个方面的内容：一是通过基因工程技术改变酶的基因序列，使其具有更好的性能；二是对酶进行物理化学性质的调控，提高酶的稳定性和催化效率。
酶工程的原理是通过对酶进行定向进化和有针对性的改造，提高酶的催化活性和选择性。
定向进化是利用自然选择的原理，在实验室中对酶进行多次重复的遗传突变和筛选过程，筛选出表现出更高活性和稳定性的突变酶。
有针对性改造是通过改变酶的结构和特性，使其适应特定反应条件，提高催化效率和产物选择性。
二、酶工程在生物制药中的应用1. 酶在药物合成中的应用酶催化合成药物的方法相对传统化学合成方法更加温和、高效和环保。
通过酶工程技术可以改变酶的催化性能，使其适应特定反应条件，提高反应产物的选择性和纯度。
同时，酶工程还可以提高酶的稳定性和催化活性，延长酶的使用寿命，降低生产成本。
2. 酶在生物催化合成药物中的应用利用酶催化合成药物可以降低合成工艺的复杂性和成本，提高产物的纯度和选择性。
在生物催化合成药物中，酶通过催化底物的转化，生成所需的目标产物。
酶工程技术可以有效提高酶的催化效率和选择性，降低反应副产物的生成，从而提高合成药物的产量和质量。
三、酶工程在食品加工中的应用1. 酶在食品加工过程中的应用酶在食品加工过程中有广泛的应用，例如面包、啤酒、乳制品、果汁等的生产中都涉及到酶的应用。
酶可以促进面团发酵、提高啤酒的醇味、改善乳质口感和提高果汁的澄清度。
生物酶工程技术的研究及应用
生物酶工程技术的研究及应用近年来，随着生物科技的不断发展，生物酶工程技术的研究和应用也越来越广泛。
生物酶工程技术是将生物化学、分子生物学、微生物学等科学原理和技术应用于酶工程领域，以开发、改良、生产和利用各种酶类为核心的一种技术。
在制药、食品工业、环保等领域都有着广泛的应用。
本文将从酶的应用、酶的类型、酶工程技术和酶的市场前景四个方面对生物酶工程技术进行探讨。
一、酶的应用酶是一种天然的催化剂，具有高效、选择性和温和的反应条件等优势，因此在生物学、化学、医药、食品和环保等领域均有着广泛的应用。
以医药领域为例，酶的应用涉及到检测、治疗和预防等多个方面。
在检测方面，酶可以用于制造试剂盒和诊断试剂盒。
在治疗方面，酶可以用于制造抑癌剂、抗生素和疫苗等药物。
在预防方面，酶可以用于生物反应器的生产和酶活性控制等方面。
二、酶的类型酶的种类繁多，可分为生物酶和工业酶两类。
其中，生物酶主要分为氧化酶、水解酶、转移酶和异构酶等。
这些酶在代谢、运动和调节等过程中起到重要作用。
而工业酶主要包括纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖氧化酶和活性炭酶等。
这些酶在生物质转化、食品加工、纺织和制浆等工业领域中发挥着至关重要的作用。
三、酶工程技术酶工程技术是将基因工程、分子生物学和生物化学等科学原理和技术应用于生物化工领域，采用生物反应器、分离纯化和酶代谢等技术，以改良、开发和生产各种酶类为主要的技术。
因此，酶工程技术在生物质转化、食品、医药、环保等领域具有广泛的应用。
在酶工程技术的研究中，也有着一些热门研究方向，如：酶的结构和功能的研究，酶的遗传调控和表达调节等。
这些研究方向为酶工程技术的进一步发展提供了宝贵的思路和方法。
四、酶的市场前景随着生物科技的不断发展，酶作为一种天然的催化剂，在生物化工、医药、食品、纺织和环保等领域均有着广泛的应用。
根据MarketsandMarkets的研究显示，全球酶市场的规模将在2022年达到105.89亿美元，其中亚太地区的市场规模最大。
酶工程生物技术
酶工程生物技术引言酶工程生物技术是一门综合了生物学、化学、工程学等多个学科的交叉学科。
通过对酶的研究、应用和工程化放大生产，酶工程生物技术在产业界有着广泛的应用，包括制药、食品、能源等众多领域。
本文将重点介绍酶工程生物技术的应用领域、关键技术以及未来发展趋势。
应用领域制药在制药领域，酶工程生物技术发挥了巨大的作用。
通过利用酶的特异性催化性质，可以合成特定的有机化合物，从而加快新药研发的速度。
同时，酶工程生物技术也可以用于制备药物中间体，提高药物合成的效率和纯度。
此外，酶工程还用于制药过程中的废物处理，从而减少环境污染。
食品在食品行业，酶工程生物技术被广泛应用于面包、啤酒、乳制品等食品的生产过程中。
例如，通过添加适当的酶制剂，可以改善面包的质地和口感；在啤酒酿造中，酶工程技术可以提高酒花中苦味物质的提取效率，改善啤酒的质量；在乳制品生产中，酶工程技术可以用于乳化和分离蛋白质，改进乳制品的质地和保存性能。
能源酶工程生物技术在能源领域也有着广泛的应用。
例如，通过利用酶的催化作用，可以将农业废弃物转化为生物燃料，实现可再生能源的生产。
此外，酶工程技术还可以用于生物柴油的合成、生物燃料电池的研究等领域，为能源产业的发展做出贡献。
酶的筛选和改造在酶工程生物技术中，酶的筛选和改造是关键的技术环节。
通过高通量筛选技术，可以从大量的菌株或基因库中筛选出具有特定催化活性的酶。
此外，利用蛋白工程技术，可以对酶的结构进行改造，从而提高酶的催化活性、热稳定性和抗蛋白酶性等性质。
反应工程反应工程是酶工程生物技术中的另一个重要环节。
通过合理设计反应体系、选择合适的底物和酶剂，以及优化反应条件，可以实现酶催化反应的高效进行。
此外，还可以通过反应工程的手段，实现酶的固定化，提高酶催化反应的稳定性和重复使用性。
在酶工程生物技术的实际应用中，过程控制是不可忽视的一环。
通过合理设计反应过程和制定严格的操作规程，可以保证酶催化反应的安全性和高效性。
生物化学领域中的酶工程研究
生物化学领域中的酶工程研究在生物化学领域中，酶工程被认为是一项重要的研究方向。
它是基于生物催化反应的科学技术，有助于人们更好地理解和应用酶催化反应的相关知识。
在本文中，我们将从以下几个方面探讨生物化学领域中的酶工程研究：酶的结构与功能、酶工程的概念与发展、酶工程与产业应用。
一、酶的结构与功能酶是生物体内的一种特殊的蛋白质，它们在许多生物催化反应中都扮演着重要的角色。
在酶分子的内部，通常包括一个或多个多肽链，这些肽链根据特定的序列排列，在特定的结构成分下，形成了酶的三维空间结构。
酶分子的构造与功能紧密相关，通过特殊的催化机制、酶和反应物分子间的相互作用改变反应物分子内部的能量状态和化学结构，从而加速生物催化反应的速率。
酶分子的空间结构与它们的活性有关，因此人们对于酶的结构与构造研究有助于更好地理解酶的功能及其在生物体内催化反应中的作用。
二、酶工程的概念与发展酶工程是一种基于生物学技术的研究方向，其主要是通过对酶分子的结构与功能进行探究，寻找出新的酶催化机制和新的酶功能，同时也包括对已有酶分子进行修饰，提高它们的催化效率以及更好地适应外界环境的能力。
酶工程的发展可以追溯到20世纪50年代，那时候的研究人员通过创造基因重组技术，并将新的基因导入到原生质体中，实现对酶基因的修饰。
酶工程在随后的几十年间快速发展，随着生物技术的迅猛发展，人们不断实现酶的工程化生产与以酶为基础的新药物的研究与开发。
三、酶工程与产业应用随着酶工程研究的深入与发展，越来越多的研究成果被广泛应用于各个领域。
在生化项目中，酶工程具有极其重要的作用。
通过酶工程技术的应用，在细胞进行代谢刀出嫱链错误等方面的纠正，人体内某些巨大有害引物的代谢加速，制造工业原料和化学品，以及含糖酶对糖的分离提纯、酶对生物质的降解等方面的应用，这些都是酶工程在产业上应用的重要体现。
同时，酶工程在环保领域、农业领域、医药领域、食品加工领域等方面都具有潜在的应用价值，未来将会有更多的酶工程研究成果被应用于现实生活中。
生物酶工程名词解释
生物酶工程名词解释生物酶工程是将生物学和工程技术相结合的学科领域，旨在利用酶作为催化剂来进行各种生物过程的改进和优化。
下面是一些生物酶工程的常见名词解释。
1. 酶：酶是生物催化剂，能够在生物体内或体外催化化学反应，加速反应速率而不改变自身的化学性质。
酶具有高效、高选择性和环境友好等特点，因此被广泛应用于工业生产中。
2. 基因：基因是存在于生物体内的遗传信息单位，负责编码蛋白质的合成。
基因决定了生物体的遗传特征，并且可以通过改变基因序列来调控生物体的生理特征，从而实现对酶的改良和优化。
3. DNA重组：DNA重组是指通过人工手段将不同物种的DNA片段合并在一起，形成一条新的DNA链。
DNA重组技术可以用来改变酶的基因组成，增加其特定特征和催化效率。
4. 重组酶：重组酶是通过基因工程技术获得的，具有优化催化活性和功能的改良酶。
重组酶是生物酶工程领域的重要成果之一，可以广泛应用于医药、食品加工和环境保护等领域。
5. 催化活性：催化活性是酶的一种基本性质，指的是酶分子与底物分子结合后，在特定条件下促进底物转化成产物的速率和效率。
催化活性的高低直接影响酶的应用效果和工程价值。
6. 底物：底物是指酶作用的起始物质，是酶催化反应的反应物。
底物的种类和结构特征直接影响酶的选择性和催化活性。
7. 产物：产物是指酶催化反应过程中生成的物质，是底物经过酶催化转化后的终产物。
产物种类和产物比例直接反映了酶对反应的选择性和效率。
8. 底物特异性：底物特异性是指酶对底物的特异选择性，即酶只能催化特定结构和特定类型的底物转化。
底物特异性是酶选择性的重要表现，是酶工程中设计和优化酶的重要目标。
9. 反应温度：反应温度是指酶催化反应进行的温度条件，酶对温度的适应性直接影响着酶的活性和稳定性。
反应温度是酶工程中需要考虑的重要因素之一。
10. 反应pH值：反应pH值是指酶催化反应进行的酸碱条件，不同酶对于pH值的敏感程度不同。
调节反应pH值可以影响酶的催化速率和稳定性。
第九章生物酶工程
酶的筛选 分子筛选；基于序列的筛选。 基于基因的同源性，从已知酶蛋白出发，利用 PCR技术或southern杂交，分离克隆目的酶基 因。
宏基因组方法（metagenome） 土样—分离收集DNA片断—限制酶剪切—PCR 扩增—克隆到载体内—转化（大肠杆菌）—筛 选转化株—功能基因—新酶。
EcoRI 野 生 型DNA
单 链 的M13 重组分子
2.寡核苷酸诱导的定 点突变
AGTACGA
TCAGGCT
化学合成的CGA
利用带有预定突变序 列的寡核苷酸单链引 物，在体外与原基因 序列退火，诱导合成 少量完整的突变基因
DNA聚 合 酶 DNA连 接 酶
自然遗传修饰：用化学诱变剂或物理诱 变因素，作用于活细胞，使其基因发生 突变，从中筛选有用的突变体。
➢ 射线（紫外线、X射线、γ射线等）
➢ 化学诱变剂（亚硝酸、羟胺、EMS、亚硝基胍 等）
选择性遗传修饰：按照预定的目标(突变 位点)，通过核苷酸的置换、插入或删除， 获得突变酶基因。
1.寡核苷酸置换的定点 突变法
某些酶待进化的性质不是其在生物体内 所涉及的。
定向进化的基本过程
通常分为3步 通过随机突变或（和）基因体外重组创 造基变子 。
2．定向进化的策略 ① 易错PCR技术 在扩增目的基因时，通过调整反应条件， 从而向目的基因中，以一定的频率随机 引入突变构建突变库，然后选择或筛选 需要的突变体。
(1)克隆酶：用基因工程技术大量生产酶；
(2)突变酶：修饰酶基因，产生遗传修饰 酶；
(3)新酶：设计新酶基因，合成自然世界 不曾有的新酶。
一、克隆酶 ① 动植物产生的酶 ② 有害的、未经批准的微生物产生的酶 ③ 不可培养微生物产生的酶
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定向进化＝随机突变＋选择
澄清一个事实：定向进化不是定点突变
定向进化：突变 筛选 突变位点是随机的，不确定的；
突变位点的数目也是不确定的； 突变的效应更是不可预知的； 理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的，
生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。 定点突变：
突变位点是确定的，突变的个数也是预知的； 突变的效应可能是已知的，也可能是未知的； 定点突变的方法一般是以PCR技术为基础的。
突变体分离
➢ 琼脂板涂布法 在特殊条件下培养突变菌，通过宿主菌的生长情况、培养基颜色、特定反应 的出现等判断是否具有目的基因。
➢ 微孔板悬浮法 在含生色底物平板上培养，挑取具有活性的克隆接种到96孔板上检测吸光度 。使用微流控芯片。
➢ 微球细胞固定法 与数字成像系统结合，将单个细胞附着在单个固体珠上，突变体进行分离和 筛选。
定义：利用有控制地对天然酶基因进行剪切、修饰或突变，从而改变这些酶的催化特性、 底物专一性或稳定性，使之更加符合人们的需要。
➢ 遗传修饰改变酶的性能大致有： （1）提高酶的活性 （2）提高酶的稳定性 （3）改变底物专一性 （4）改变酶的最适pH值 （5）改变酶对辅酶的要求 （6）改变酶的别构调节能力
（1）盒式诱变
原理：利用一段人工合成的具有突变序列的寡聚核甘酸片段（寡核甘酸盒，Oligonucleotide Cassette），取代野生型基因中的相应序列。
HindIII
EcoRI
+
HindIII
EcoRI
（2）寡聚苷酸引物诱变
原理：用化学合成的含有突变碱基的寡核甘酸短片段作为引物，启动单链DNA分子进行复制 ，生产出来的新链中目的基因的特定位点具有已经发生突变的碱基序列。
ATCGCTTCT
G
CTAA
A
G
G
A
A
T
转化
T
G
A
C
P标记筛选分离 突变体
（3）PCR诱变 定点诱变法 大引物诱变法
特点：可以在DNA区段的任何部位产生定点突变。
原理：在头两轮的PCR反应中，应用两个互补的并在相同部位具有相同碱基突变的内侧引物， 扩增形成两条有一端可彼此重叠的双链DNA片段，两者在其重叠区段具有同样的突变。故此 两条双链DNA片段经变性和退火处理，形成两种不同形式的异源双链分子。然后选用两个外 测寡核甘酸引物进行第三轮PCR扩增，可得到一种含有突变位点的突变体DNA。
functional lipase secreted by Recombinants screened with BMMY plates
SDS-PAGE analysis of lipase on expression and purification
体外随机引发重组
体外随机引发重组(random priming in vitro recombination, RPR)以单链DNA为模板，配合一套随机 序列引物，先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短DNA 片段中也会有少量的点突变，在随后的PCR反应中，它们互为引物进行合成，伴随组合，再组装成完 整的基因长度。
交错延伸
交错延伸(stagger extension process, StEP) 在PCR反应中把常规的退火和延伸合并为一步 , 缩短其反应时间，从而只能合成出非常短的新生链，经变性的新生链再作为引物与体系内同 时存在的不同模板退火而继续延伸。此过程反复进行，直到产生完整的基因长度。
定向进化是一个由构建突变体库，突变体表达，表达后筛选三个步骤组成的循环递进过程，需要： (1)大肠杆菌或酵母菌) 体内进行功能的表达; (3) 必须有一种灵敏的筛选方法,能反映出由一个氨基酸的置换而引起的预期性状的较小提高。
期通过液体培养或固体培养的方式得到大量的克隆纤维素酶。
技术路线1
A.bgpd
L.egpd
+
表达
V.vgpd
afp基因
载体
PEG介导转化
建立转化 体系
电激转化
农杆菌介导转化
Hale Waihona Puke 分子鉴定低温筛选低温筛选 体系建立
原生质体 或菌丝球
转化受体
技术路线2
分离纯化
液体 发酵
Cel基因工程 菌株的筛选
2. 突变酶
Advanced Enzyme Engineering 第九章 生物酶工程
Contents
一、生物酶工程的定义 Go
二、生物酶工程的内容 Go
三、生物酶工程的前景 Go
一、 生物酶工程
1. 定义 生物酶工程是酶学和以基因重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物，亦称高级酶 工程(Advanced Enzyme Engineering)。
（3）克隆酶对宿主的要求 （1）安全可靠，非致病菌； （2）外源基因在宿主内能够表达且不被分解； （3）有利于酶的分离和纯化； （4）能利用廉价的原料，发酵周期短，产量高； （5）容易培养和管理。
（4）克隆酶基因的表达系统
原核生物的基因表达系统 真核生物的基因表达系统
1. 酵母表达系统 2. 植物表达系统 3. 动物表达系统 4. 丝状真菌表达系统
噬菌体展示库的构建步骤：
利用靶分子，采用适当的淘洗方法（亲和→洗脱→扩增→亲和的循环步骤）肽或蛋白质表 达在噬菌体的表面，而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过噬菌体DNA 序列测序出来， 使得表达蛋白（表现型）和编码基因（基因型）之间完美地结合起来。
随机突变的策略
➢ 易错PCR技术(error-prone PCR) ➢ DNA改组(DNA shuflling)：由美国Stemmer 于1994 年首次提出 一项体外重组技术 ➢ 随机引发重组(RPR) 1998 年,Arnold 提出了一种有效的新方法 ➢ 交错延伸技术(StEP)：由Zhao 等 提出, 是一种简化的DNA shuffling 技术
成功实例
Zhengbing Jiang, Yitao zheng, Yu Luo, Gang Wang, Hongping Wang, Yushu Ma and Dongzhi Wei*. Cloning and Expression of a Novel Lipase Gene From Pseudomonas fluorescens B52. Molecular Biotechnology. 2005 ( 31), 095-102.
➢ 流式细胞计数法 细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，排成单行，逐个通过流式细胞计数 仪进行测定。
酶检测
➢ 通过酶促反应的特征 ➢ 加入底物显色 ➢ 荧光共振能量转移 ➢ 同位素标记底物 ➢ 通过检测底物消耗或产物生成进行终点检测
信号探测
Ø 分光光度计和荧光酶标仪 Ø 气相色谱和高效液相色谱 Ø 质谱和核磁
环境库和噬菌体展示库的构建
环境库的构建： （1）采集环境样品； （2）提取DNA，连接到合适的载体上； （3）转入合适的宿主菌。
噬菌体展示库的构建
噬菌体展示的基本原理：
在噬菌体衣壳蛋白基因中插入外源基因，形成融合蛋白表达在噬菌体颗粒蛋白的表面，被展 示的多肽或蛋白质可保持相对独立的空间结构和生物学活性。
（5） 克隆酶实例 纤维素酶基因工程菌的构建
❖ 纤维素酶
纤维素酶（cellulase）是能将纤维素水解为葡萄糖等简单糖类的一组酶的总称。
纤维素酶在食品、饲料、造纸、纺织等行业具有广泛的用途。但由于天然纤维素酶产量低、 来源有限而导致其大规模应用受到限制。
为此，通过基因工程技术，克隆福寿螺体内的纤维素酶基因，构建含有cel的基因工程菌，以
修饰酶基因的方法主要方法 （i）定位突变 （ii）体外定向进化
（i）定位突变
定位突变（site-directed mutagenesis）是根据酶的结构、功能和作用机制的信息，在基因水平上精 确改变酶分子中的氨基酸残基，对酶的性质和其催化特性进行改造，产生符合特定需要的酶。
Ø 方法：
盒式诱变 寡聚苷酸引物诱变 PCR诱变
定向进化示意图
诱发突变的因 素
随机突变+定向选择＝目标突变体 最适生长温度提高了！
细菌 最适生长温度为370C
突变体库
50 0C培养
选择压力（ 温度）
温度耐受型突变体
Strategies for the development of effective enzymes
定向进化
属于蛋白质的非合理设计，它不需要事先了解酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的 进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并 定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。
DNA改组 ➢ DNA改组(DNA shuffling)又称有性PCR (sexual PCR)，原理如图所示。
PCR扩增
体外 定向 进化
成功实例
Lipase genes (lipB52, lipB68) isolated from Pseudomonas fluorescens B52、B68 Genbank Accssion number AY623009、AY694785
易错PCR
易错PCR：是一种简单、快速、廉价的随机突变方法。 原理：利用TaqDNA聚合酶不具备3’-5’校正功能的特点通过改变PCR的条件，通常降低一种dNTP 的
量（降至5%-10%）使PCR易于出错，达到随机突变的目的。还可以加入dITP 来代替被减少的 dNTP，又会使下一轮循环中出现更多的错误。在PCR 缓冲液中另加入Mn2+，亦有利于提高突 变率。
同源扫描突变：几个同源酶PCR扩增，然后用内切核酸酶切割，不同的切割产物混合组合，Taq 聚合酶扩增，含有几个同源蛋白质的基因片段组成新基因，即为杂合基因，进而克隆与表达，产 生杂合酶。