微生物 显微镜和显微技术 -文档资料
显微技术
显微技术显微技术是微生物检验技术中最常用的技术之一。
显微镜的种类很多，在实验室中常用的有：普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。
而在食品微生物检验中最常用的还是普通光学显微镜。
一、普通光学显微镜的结构和基本原理：1.结构：光学显微镜是由光学放大系统和机械装置两部分组成。
光学系统一般包括目镜、物镜、聚光器、光源等；机械系统一般包括镜筒、物镜转换器、镜台、镜臂和底座等。
（图３－１）标本的放大主要由物镜完成，物镜放大倍数越大，它的焦距越短。
焦距越小，物镜的透镜和玻片间距离（工作距离）也小。
油镜的工作距离很短，使用时需格外注意。
目镜只起放大作用，不能提高分辨率，标准目镜的放大倍数是十倍。
聚光镜能使光线照射标本后进入物镜，形成一个大角度的锥形光柱，因而对提高物镜分辨率是很重要的。
聚光镜可以上下移动，以调节光的明暗，可变光阑可以调节入射光束的大小。
显微镜用光源，自然光和灯光都可以，以灯光较好，因光色和强度都容易控制。
一般的显微镜可用普通的灯光，质量高的显微镜要用显微镜灯，才能充分发挥其性能。
有些需要很强照明，如暗视野照明、摄影等，常常使用卤素灯作为光源。
图３－１光学显微镜结构图2.原理：显微镜的放大效能（分辨率）是由所用光波长短和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率，可见光的光波幅度比较窄，紫外光波长短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接观察。
所以利用减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的，提高数值口径是提高分辨率的理想措施。
要增加数值口径，可以提高介质折射率，当空气为介质时折射率为1，而香柏油的折射率为1.51，和载片玻璃的折射率（1.52）相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。
显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。
二、普通显微镜的使用方法1、低倍镜观察先将低倍物镜的位置固定好，然后放置标本片，转动反光镜，调好光线，将物镜提高，向下调至看到标本，再用细调对准焦距进行观察。
微生物显微技术的发展及应用
微生物显微技术的发展及应用化生系生物技术11 麦柳明学号：2011111778微生物显微技术主要包括标本的制作技术、显微镜技术、显微摄影技术以厦摄影后的图像处理技术等四个方面。
(一)微生物显微技术的历史回顾1676年，列文虎克利用自制的单式显微镜首次发现了细菌，这标志着人类开始了微生物学领域的研究；同时也标志着微生物显微技术的诞生。
伽利略发明了望远镜后，人们受到启发，将它倒过来制成了第一台复式显微镜。
l850年，在显微摄影技术极低困难重重的情况下，科赫拍摄了至今还能清晰辨认的细菌照片，这一成果被视为显微摄影史上的奇迹之一；他于l877年第一个制作了可以永久保存的、用美蓝染色的干细菌膜标本。
l934年，马顿制造了第一架电子显微镜；1 941年，马德等发表了第一批细菌细胞的电镜照片。
电镜的发明以及引入了计算机技术标志着显微技术进入了新的历史发展阶段，它不仅使微生物研究进入了分子水平，以至电子水平，进而促使微生物显微技术向着快速、准确和自动化方向发展。
(二)微生物显微技术的发展现状概述新技术、新理论的不断引进逐步充实和完善了微生物显微技术，其发展主要表现在以下四个方面：1、标本制作技术(即切片技术)及其设备：近代物理学、化学和生物学等学科的发展为标本制作技术奠定了坚实的理论和技术基础，使切片技术逐渐成熟形成了体系。
生物种类(动物、植物和微生物)的切片技术主要包括整体标本制作、超薄切片制作和冷冻切片技术等。
切片技术改进的一个突出例子是x射线显微分析超薄冰冻切片上的可扩散元素。
在元素浓度低(如lOOnm 厚的切片中)，X射线显微分析只能在直径为l OOnm 范围内进行；在元素浓度高(如在厚度为1—2 m的无机包含物切片中)，X射线显微分析可在直径小至25am范围内进行；在元素浓度高，具有良好的冰冻干燥设备，并采用严格的冰冻切片技术，x射线显微分析可在直径小于25nm范围内进行，从而在不同试验条件和不同超微结构水平上研究细胞化学成分。
微生物纯培养和显微技术
● 扫 描 隧 道 显微镜（STM） ：利用隧道效 应，通过扫描 样品表面，获 取样品表面的 形貌和结构信 息。 ● 原子力显微镜（AFM）：利用原子力显微镜探针与样品表面的相互作用，通过扫描样品表面，获取样品表面的形貌和结构
谢过程。
纯培养的应用： 在医学、生物 学、食品工业 等领域都有广
泛的应用。
纯培养的方法： 包括稀释法、 平板划线法、 液体培养法等。
培养基制备：制备适合微 生物生长的培养基
培养：在适宜的温度、湿 度和光照条件下培养微生
物
分离：将不同种类的微生 物分离开来，如使用划线
法、涂布法等
取样：从环境中采集微 生物样品
电子探针（EPMA）：利用电子束激发样品表面，通过分 析电子信号获得样品的化学成分和结构信息。
电子能谱仪（ESCA）：利用电子束激发样品表面，通过 分析电子信号获得样品的化学成分和电子结构信息。
电子束诱导电流（EBIC）：利用电子束激发样品表面，通 过分析电流信号获得样品的电学性质和结构信息。
缺点：需要较高的 技术水平和设备， 操作难度较大
优点：可以观察到 微观世界的动态变 化，如细胞分裂、 生长、死亡等
缺点：需要较长的 时间进行观察，需 要耐心和细心
显微镜的种类和 原理
光学显微镜的种类：普通光学显微镜、荧光显微镜、相差显微镜、偏光显微镜等
光学显微镜的原理：利用光的折射和反射原理，通过透镜将微小物体放大
观察微生物生长： 通过光学显微镜可 以观察到微生物的 生长过程、生长速 度等特征。
观察微生物繁殖： 通过光学显微镜可 以观察到微生物的 繁殖方式、繁殖速 度等特征。
观察微生物形态：电子显微镜可以清晰地观察到微生物的形态、大小和结构，为微生物分 类和鉴定提供依据。
生物显微技术的研究及应用
生物显微技术的研究及应用在当今科技发展的时代，各种高科技设备和技术应用不断涌现。
而其中，生物学领域所涉及的显微技术就是一种十分重要的技术。
生物显微技术的应用领域非常广泛，从医学、生命科学到环境科学都有着重要的应用。
在本文中，我们将会探讨生物显微技术的研究及其应用。
一、生物显微技术的发展生物显微技术的起源可以追溯到公元前1600年左右的时候，当时的古埃及医生就使用放大镜来观察红血球。
而到了17世纪初，荷兰科学家安东·范·李文虎克发明了一种高性能显微镜，从此开始了显微技术的快速发展。
在19世纪，生物显微学渐渐被人们所熟知，并且开始被广泛应用于医学领域。
20世纪初期，生物显微技术经过几十年的发展，推陈出新，取得了重大进展。
除了普通荧光显微镜、共聚焦显微镜等传统显微镜外，出现了许多高级显微镜，如STED、SIM等。
这些高级显微镜不仅在空间分辨率上有了很大的突破，而且能够在吸收谱、荧光谱、周迴光谱等方面进行分析和检测。
这种深层次的研究和应用，对生物领域中的科学研究和技术发展起到了重要的推动作用。
二、生物显微技术的应用领域1.医学领域生物显微技术在医学领域中有着广泛的应用，医学工作者可以利用显微镜分析和研究生物样本，以帮助诊断疾病。
在医学诊断中，常见的生物样本包括血液、尿液、组织等。
通过生物显微技术对这些生物样本的分析，可以快速、准确地诊断出一系列疾病。
例如，在肿瘤相关的研究中，生物显微技术被广泛运用。
科学家们可以利用高性能显微镜观察肿瘤的详细构成，以了解肿瘤形成的机制，并发展新的治疗方法。
此外，生物显微技术还可以被应用于显微外科手术，通过显微镜引导医生进行手术操作，极大地提高了手术的准确性和成功率。
2.生命科学领域在生命科学领域中，生物显微技术可以被用来研究生物发育、基因表达等生物过程。
科学家们可以在显微镜下观察到细胞分裂、蛋白质交互作用、基因调控等生物过程中的微观结构和变化，通过这些观察和分析，科学家们可以深入了解生物过程的机理，发现新的生物机制，并进一步深化生命科学领域的理解。
微生物 显微镜和显微技术 课件(稻谷书苑)
详细课资
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光学显微样品制备－－染色观察
用途：微生物的细致形态和结构 染色前需要对样品固定. 常用固定方法：酒精火焰加热、化学固定
详细课资
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1)、简单染色法：涂片→干燥→固定→染 色→水洗→干燥→镜检
活菌
简单染色
鉴别染色
详细课资
革兰氏染色、鞭毛染色、芽孢染色
美蓝染色
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光学显微镜样品制备－－活体观察
特点：避免染色对细胞结构的破坏，用于运动性、 摄食特性、生长繁殖过程中形态变化等观察
（1）压滴法：菌悬液滴于载玻片上，加盖 玻片，观察。
（2）悬滴法：盖玻片中央加一小滴菌悬液， 翻转置于特制的凹载玻片上，观察。
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2、扫描电子显微镜
大肠杆菌扫描电镜图
扫描电子显微镜
工作原理：电子束扫描，激发样品表面放出二次电子，电子产生多 少与标本表面立体形貌有关。电子经探测器收集，经光电倍增管和 放大器，产生样品立体图像于荧光屏上。
主要用于：样品表面结构
详细课资
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扫描 电子 显微 镜原 理
详细课资
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详细课资
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负染色法观察的鞭毛
详细课资
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投影 法
在真空条件下，用电子散射能 力强的重金属原子来喷镀样品 表面，这样在样品和没有喷镀 的区域形成了较强的反差，而 没有喷镀的部分成了样品的投 影，根据投影了解样品的立体 形状、高度。
详细课资
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用途：观察细菌的 鞭毛或病毒的颗粒
投影法观察的噬菌体
详细课资
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超薄切片法
微生物制片显微观察及检测技术
革兰氏染色图解
革兰氏染色试剂
步骤1：用蒸馏水滴瓶滴一小滴蒸馏水于洁净的载玻片上
步骤2：用无菌操作法取少许培养物于蒸馏水滴上
步骤3：用接种环将培养物涂布成一薄层
步骤4：风干
步骤5：在酒精灯火焰外层尽快的来回通过3-4次固定
步骤6：结晶紫染色1分钟
步骤7：用蒸馏轻轻冲洗玻片
步骤8：革兰氏碘液染色1分钟，再用蒸馏水轻轻冲洗
低倍镜操作方法
1.两眼从侧面注视 低倍物镜对准通光孔，使用粗调焦螺旋将镜筒 自上而下的调节，避免物镜镜头接触到玻片而损坏镜头和压破 玻片。当物镜镜头与载物台的玻片相距2～3mm时停止； 2.左眼注视 （注意右眼应该同时睁着），并转动粗调焦螺旋，使 镜筒徐徐上升，直到看清物象为止； 3. 再用微调焦螺旋调至清晰。 注意：粗调调焦螺旋只用于上调载物台，如观察显微镜时 ，用粗调节器调节，有压碎载玻片、损坏物镜的危险。因此， 用细调焦螺旋调节视野使其更清晰
微生物检测技术介绍
检测技术的重要性
一、微生物检验技术介绍
微生物检测
传统筛选系统 免疫凝集/免疫沉淀实验 Mini VIDAS筛选系统 实时荧光定量PCR 革兰氏染色镜鉴 按照标准进行 传统的生化反应鉴定 API试剂条 菌鉴定国际金标准
微生物鉴定
半自动细菌鉴定仪 （ATB Expression）
(二)细菌的革兰氏染色步骤
涂片→干燥→固定→初染→水洗→媒染→水洗→脱色→水洗→复染→水洗 →干燥→观察
1 ．取培养物分别做涂片、干燥、固定，方法均与简单 染色的相同。 2．用草酸铵结晶紫染色1min后水洗。 3．加碘液媒染1min后水洗。 4 ．斜置载玻片，滴加 95 ％乙醇脱色，至流出的乙醇不 现紫色 为止，大约需时20~30s，随即水洗。 5．用蕃红染液复染1min，水洗。 6．用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用 低倍镜观察，发现目的物后用油镜观察，注意细菌细 胞的颜色。
生物显微技术总结范文
随着科学技术的不断发展，生物显微技术在生物学、医学、环境科学等领域的研究中发挥着越来越重要的作用。
生物显微技术是通过显微镜观察和研究生物体微观结构的方法，它为我们揭示了生物体的奥秘，为人类健康和生物科学的发展提供了有力的技术支持。
以下是生物显微技术的总结。
一、生物显微技术的基本原理生物显微技术的基本原理是利用光学原理，通过放大微小物体，使其在视觉范围内被观察。
显微镜由光源、物镜、目镜和载物台等部分组成。
光源发出的光线经过物镜放大，再通过目镜观察，从而实现对微小物体的观察。
二、生物显微技术的分类1. 光学显微镜：光学显微镜是生物显微技术中最常用的显微镜，分为普通光学显微镜、荧光显微镜、相差显微镜等。
普通光学显微镜主要用于观察生物体的显微结构，荧光显微镜和相差显微镜则可以观察生物体的亚显微结构和动态变化。
2. 电子显微镜：电子显微镜利用电子束代替光束，具有更高的分辨率。
电子显微镜分为透射电子显微镜和扫描电子显微镜。
透射电子显微镜主要用于观察生物体的超微结构，扫描电子显微镜则可以观察生物体的表面形态。
3. 激光共聚焦显微镜：激光共聚焦显微镜利用激光聚焦和光学切片技术，实现对生物体的三维成像。
它具有较高的分辨率和空间分辨率，广泛应用于细胞生物学、分子生物学等领域。
4. 多模态显微镜：多模态显微镜将多种成像技术结合，如光学显微镜、电子显微镜、荧光显微镜等，实现对生物体的多方面研究。
三、生物显微技术的应用1. 生物学研究：生物显微技术广泛应用于生物学领域，如细胞结构、细胞功能、细胞代谢等方面的研究。
2. 医学诊断：生物显微技术可用于疾病的诊断，如肿瘤、感染等疾病的细胞学检查。
3. 环境科学：生物显微技术可用于环境监测，如微生物群落结构、生态系统的稳定性等方面的研究。
4. 生物工程：生物显微技术可应用于生物工程领域，如细胞培养、基因编辑、蛋白质工程等。
四、生物显微技术的发展趋势1. 高分辨率：随着显微镜分辨率的提高，生物显微技术将更加深入地揭示生物体的微观结构。
微生物大小的测定及显微镜直接计数法
微生物学实验报告题目：微生物大小的测定及显微镜直接计数法姓名：学号：年级班级：组别：同组者：时间：【目的要求】1．学习并掌握使用显微镜测微尺测定微生物大小的方法。
2．了解血球计数板的构造、明确其计数原理。
3．学习并掌握使用血球计数板测定微生物细胞或孢子数量的方法。
【基本原理】l．测微尺的构造：显微镜测微尺是由目镜测微尺和镜台接物测微尺组成目镜测微尺是一块圆形玻璃片，其中有精确的等分刻度，在5mm 刻尺上分50 份。
目镜测微尺每格实际代表的长度随使用接目镜和接物镜的放大倍数而改变，因此在使用前必须用镜台测微尺进行标定。
镜台测微尺为一专用的载玻片，中央有精确等分线将长为1mm 的直线等分成100 个小格，每格长10μm，专用于校正目镜测微尺。
2.球菌用直径表示大小；杆菌用宽和长来表示图一：测微尺的校正3．显微直接计数法：将小量待测样品悬浮液置于计菌器上，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。
显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如酵母、细菌、霉菌孢子等。
菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板或Hawksley计数板。
三种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。
而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。
血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。
中间较宽的平台，被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区。
计数区的刻度有两种：一种是计数区（大方格）分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。
计数区由400个小方格组成。
每个大方格边长为1mm，其面积为lmm2，盖上盖玻片后，盖载玻片间的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3。
使用血球计数板计数时，通常测定五个中方格的微生物数量，求其平均值，再乘以25或16，就得到一个大方格的总菌数，然后再换算成1毫升菌液中微生物的数量。
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借助于显微镜观察微生物的方法即显微技术， 显微技术是微生物检验技术中最常用的技术 之一。
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显微镜的种类和原理
显微观察样品的制备
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一、显微镜的种类和原理
普通光学显微镜 暗视野显微镜
(一)、光学显微镜 相差显微镜
荧光显微镜
现在的光学显微镜分辨的最小极限达0.2μm。
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普通光学显微镜的几个基本概念
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1、普通光学显微镜
由三部分构成 ①照明系统：包括光源和聚光器； ②光学放大系统：由物镜和目镜 组成，是显微镜的主体，目镜和 物镜都由复杂的透镜组构成； ③机械装置：用于固定材料和观 察方便
样品承载
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载玻片
调节电磁透镜的流向
调节电磁透镜的流
向金属网（通常为铜
网）
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二、显微观察样品 的制备
（一）光学显微 镜制样
活体观察 染色
压滴法 悬滴法 菌丝埋片法
死菌
活菌
简单染色
鉴别染色
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革兰氏染色、鞭毛染色、芽孢染色
美蓝染色
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光学显微镜样品制备－－活体观察
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（二）、电子显微镜的制样
样品在进行电镜观察前必须进行固定和干 燥，制样时一般采用重金属盐染色或喷镀， 提高在电镜下的反差。
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※1、透射电镜的样品制备
负染技术 投影技术 超薄切片技术 冰冻蚀刻技术
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负染 法
将样品的背景染色以凸现样品，所以称为负染法。
用高速电子束代替光束。放大倍数可达80万倍， 分辨的最小极限达0.2纳米。
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1、透射电子显微镜
目前TEM的分辨力可达 0.2nm。
用电子束作光源，用电磁场
作透镜。用于电镜的标本须制 成厚度约50nm左右的超薄切 片。放大倍数最高可达近百万 倍.由电子照明系统、电磁透镜 成像系统、真空系统、记录系 统、电源系统等5部分构成。
主要用于：样品表面结构
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扫描 电子 显微 镜原 理
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3、扫描隧道显微镜（STM）
扫11.1描2.2020隧道显微镜拍摄的7个铀原子团
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4 原子力显微镜
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油镜使用
光镜使用方法
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2、暗视野显微镜
原理：聚光镜中央有挡光片， 使照明光线不直接进人物镜， 只允许被标本反射和衍射的 光线进入物镜，因而视野的 背景是黑的，物体的边缘是 亮的。 适用范围：生活细菌运动性 观察。
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特点:只能看到物体的存在 与运动,不能辨清其微细结 构。
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高尔基体的 TEM照片(伪 彩色)
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2、扫描电子显微镜
大肠杆菌扫描电镜图
扫描电子显微镜
工作原理：电子束扫描，激发样品表面放出二次电子，电子产生多 少与标本表面立体形貌有关。电子经探测器收集，经光电倍增管和 放大器，产生样品立体图像于荧光屏上。
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光学显微镜和电子显微镜的特点比较
特点
光学显微镜
电子显微镜
最高放大倍数 约1000-1500 10万以上
最佳分辨率 0.2微米
0.5纳米
辐射源
可见光
电子束
辐射源通过的媒介 空气
高真空
透镜类型
玻璃
电磁体
反差来源
光吸收的差异或特定波长 电子散射
聚焦机械
机械调节透镜位
改变放大倍数的方法 置 调换物镜或目镜
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光学显微样品制备－－染色观察
用途：微生物的细致形态和结构 染色前需要对样品固定. 常用固定方法：酒精火焰加热、化学固定
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1)、简单染色法：涂片→干燥→固定→染 色→水洗→干燥→镜检
2）、革兰氏染色法：涂片→固定→结晶紫 色染色→水洗→碘液媒染→水洗→酒精脱 色→番红复染→水洗→干燥→观察
特点：避免染色对细胞结构的破坏，用于运动性、 摄食特性、生长繁殖过程中形态变化等观察
（1）压滴法：菌悬液滴于载玻片上，加盖 玻片，观察。
（2）悬滴法：盖玻片中央加一小滴菌悬液， 翻转置于特制的凹载玻片上，观察。
（3）菌丝埋片法：无菌小块玻璃纸铺于平 板表面，涂布放线菌或霉菌孢子悬液，培养， 取下玻璃纸置于载玻片上，观察菌丝形态。
暗视野显微镜的使用
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3、相差显微镜
基本原理:把透过标本的可见光的光程 差变成振幅差，从而提高了各种结构间 的对比度，使各种结构变得清晰可见。
相差显微镜使用
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适用范围：对透明的活体进行直接观察
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微分干涉差显微镜DIC显 微镜下的硅藻形态
一般是采用电子密度高，本 身不会显示任何结构，又和 样品不起反应的物质，如磷 钨酸的钠盐将样品包围，同 时染色剂还会进入观察对象 的内部，这样，既能显示外 形，又可在一定程度上反映 样品的内部结构。
负染法原理
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用途：可以观察细菌细胞、病毒等。
负染色法观察的鞭毛
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4、荧光显微镜
原理：荧光素吸收紫 外线并放出部分波长 较长的可见光，发荧 光的物体会在黑暗背 景显现为光亮有色物 体
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绿色：铜绿假单胞菌 黄色：蜡样芽孢杆菌
绿色：微管 红色：微丝 蓝色：核
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透射电子显微镜
（二）电子显微镜
扫描电子显微镜
1931年在德国柏林由克诺尔和哈罗斯卡首先装 配完成的。
这是最常用的方法，可以观 察细胞或其它样品内部的细 微结构。 样品固定→脱水→包埋→切 片。 只有在20—100纳米厚度的 切片用透射电子显微镜才能 观察，所以一般细菌样品， 一个细胞要分割成10片到 50片。
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投影 法
在真空条件下，用电子散射能 力强的重金属原子来喷镀样品 表面，这样在样品和没有喷镀 的区域形成了较强的反差，而 没有喷镀的部分成了样品的投 影，根据投影了解样品的立体 形状、高度。
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用途：观察细菌的 鞭毛或病毒的颗粒
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投影法观察的噬菌体 40
超薄切片法