凝胶渗透色谱
凝胶渗透色谱
GPC分离是基于样品分子的溶剂化体积
GPC 在色谱柱中的分离是基于分子在溶剂表现
出的体积而不是分子量
GPC分离原理
(1) 固定相是多孔填料，小分子样品可以进入孔 径内部
(2) 样品与固定相之间无作用力
(3) 迁样品移时间不同
填充物颗粒
大
中
孔穴
小
GPC分离原理示意图
solution
solvent
浓度检测器
体积大的分子先 被淋洗出来
体积小的分子后 被淋洗出来
GPC是如何工作的
GPC曲线
GPC曲线
浓度响应
W(M)
代代表表了了相分对子分量子的质大量小的--M大；小—M 浓度响应代表了了含含量量—--WW（(MM）)
样品制备的影响
样品浓度与分子量相关（分子量越大，浓度越低） 除非该样品可能会有剪切效应发生，聚合物溶液必须
过滤 为了增加样品的溶解，可轻微扰动（不要剧烈摇动或
1 凝胶色谱的任务
分子量的分布与高分子材料 的所有关键加工特性以及材料 性能紧密相关
聚合物的分子结构
PD = Mw / Mn
分子量分布
增加分子量
聚合物的各种平均分子量
用GPC测得的不同种平均分子量可对应于其他仪器所 测的值：
– Mn：用渗析计测出(Osmometry) – Mw：用光散射计测出(Light Scattering) – Mv：用粘度计测出(Viscometry) – Mz及Mz+1：用超速离心法测出(Ultracentrifuge) – Mw/Mn：为多分散性(Polydispersity) – Mn<Mv<Mw<Mz<Mz+1
凝胶过滤色谱法和凝胶渗透色谱法的区别
凝胶过滤色谱法和凝胶渗透色谱法是生物化学领域常用的两种分离和纯化方法。
它们在分子大小分离和蛋白质结构分析中发挥着重要作用。
今天，我们将深入探讨这两种方法之间的区别，以便更好地理解它们的应用和优势。
一、原理1. 凝胶过滤色谱法：凝胶过滤色谱法是一种按照分子大小分离物质的方法。
它利用具有特定孔径大小的凝胶填料，大分子无法进入凝胶孔隙而直接流出，而小分子则能够进入孔隙而被滞留，从而实现分子的分离和纯化。
3. 凝胶渗透色谱法：凝胶渗透色谱法是一种根据分子在凝胶中的渗透速度来分离物质的方法。
它利用凝胶填料形成的三维网络结构，分子在凝胶中的渗透速度与其分子大小成反比，因此分子越大，其在凝胶中的渗透速度越快，分子越小，渗透速度越慢，从而实现分子的分离和纯化。
二、区别1. 分离原理不同：凝胶过滤色谱法是根据分子大小的不同把大分子和小分子分离开来的，而凝胶渗透色谱法则是根据分子在凝胶中的渗透速度的不同进行分离的。
2. 分子范围不同：在凝胶过滤色谱法中，适用于分离分子量较大的物质，而凝胶渗透色谱法适用于分离各种分子量的物质，并且对于高分子更为有效。
3. 分离效果不同：凝胶过滤色谱法可以获得较好的分离效果，但对于高分子的分离效果不如凝胶渗透色谱法。
而凝胶渗透色谱法可以实现对高分子的高效分离。
三、应用凝胶过滤色谱法常用于分离蛋白质、多肽和核酸等生物大分子，用来检测生物大分子的分子大小和形态。
而凝胶渗透色谱法除了用于生物大分子的分离外，还可以用于溶液中各种溶质的分子量测定。
四、个人观点以上就是凝胶过滤色谱法和凝胶渗透色谱法的区别和应用。
在实际科研工作中，选择合适的色谱方法对于提高分离效率和分析准确性非常重要。
我们需要根据样品的特性和需要进行全面评估，选择合适的色谱方法进行分离和分析。
总结回顾通过本文的讨论，我们对于凝胶过滤色谱法和凝胶渗透色谱法有了更全面的了解。
这两种色谱方法在生物化学和生物医药领域具有重要的应用价值，能够帮助科研人员进行生物大分子的分离、纯化和分析，对于推动生物技术和医药领域的研究具有重要的意义。
第九章凝胶渗透色谱讲解
凝胶色谱分析二〇一一年九月九日第九章凝胶色谱分析凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography, GPC），又称尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography, SEC），其以有机溶剂为流动相，流经分离介质多孔填料（如多孔硅胶或多孔树脂）而实现物质的分离。
GPC可用于小分子物质和化学性质相同而分子体积不同的高分子同系物等的分离和鉴定。
凝胶渗透色谱是测定高分子材料分子量及其分布的最常用、快速和有效的方法[1]。
凝胶渗透色谱（GPC）的创立历程如下[2,5]：1953年Wheaton和Bauman用多孔离子交换树脂按分子量大小分离了苷、多元醇和其它非离子物质，观察到分子尺寸排除现象；1959年Porath和Flodin用葡聚糖交联制成凝胶来分离水溶液中不同分子量的样品；1964年J. C. Moore将高交联密度聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂用作柱填料，以连续式高灵敏度的示差折光仪，并以体积计量方式作图，制成了快速且自动化的高聚物分子量及分子量分布的测定仪，从而创立了液相色谱中的凝胶渗透色谱。
近年来，光散射技术（如图9-1所示，一束光通过一间充满烟雾的房间，会产生光散射现象。
）广泛应用于高分子特征分析领域[3]。
将光散射技术和凝胶渗透色谱（GPC）分离技术相结合，可以测定大分子绝对分子量、分子旋转半径、第二维里系数，也可测定分子量分布、分子形状、分枝率和聚集态等。
目前，该技术在高分子分析领域已成为一种非常有效的工具，在美国，日本及欧洲广为使用，国内近年来亦引进了此项技术。
入射光散射光图9-1光散射现象9.1 基本原理9.1.1凝胶渗透色谱分离原理让被测量的高聚物溶液通过一根内装不同孔径的色谱柱，柱中可供分子通行的路径包括粒子间的间隙（较大）和粒子内的通孔（较小）。
如图9-2、图9-3所示，当待测聚合物溶液流经色谱柱时，较大的分子只能从粒子间的间隙通过，被排除在粒子的小孔之外，速率较快；较小的分子能够进入粒子中的小孔，通过的速率慢得多。
现代材料分析测试技术 凝胶渗透色谱 GPC
• 含有固化剂的EPOXY
酚醛树脂在室温条件下的自然 固化现象观察
8 6 4
RI/mv
2 0 -2 -4 15
1d 2d 5d 11d 19d
20
25 t/min
30
35
补充内容：水相GPC的应用
• 用于溶解于水的聚合物 • 较有机相GPC要复杂得多
水相GPC中存在的问题
• 非体积排除效应
• 分子尺寸不能直接反映分子质量及其分布 的信息。
聚合物分子量的特点
1.分子量大 2.多分散性
3.分子量统计平均值+分布系数才能确切 描述聚合物分子量
GPC分离机理
二、GPC仪器的基本配置
• • • • • • 溶剂贮存器(Solvent) 泵(Pump) 进样系统(Autosample ) 色谱柱(column) 检测器(detector) 数据采集与处理系统(Data Acquirement and Process System) • 废液池 (Waste)
（1）分子质量变化不大
• 这是由于分子链发生了氧化现象，生成了 其它物质，如羟基被氧化为醛、酮或酯的 结构，这时聚合物整体的分子链长度没有 明显的改变，但聚合物的性质发生了变化， 这时可以通过红外的方法检测其分子链结 构组成的变化。
（2）分子质量降低
• 有些高聚物的老化是因为分子链的断裂， 这时分子量急剧下降，使产品性能发生显 著的变化。如纤维强度下降，变脆，达不 到使用要求。
仪器基本配置流程图
3 2.5 2
RI/mv
1.5 1 0.5 0 -0.5 0 5 10 15 20 25 30 35 t/min
泵(515 HPLC Pump)
• 要求精度很高
凝胶渗透色谱
凝胶渗透色谱目录一、基本原理 (2)1.1 凝胶的特性 (2)1.2 色谱的分离原理 (3)1.3 凝胶渗透色谱在分离技术中的应用 (5)二、仪器设备 (6)2.1 凝胶渗透色谱仪的主要组成部分 (7)2.2 主要性能指标及选择 (9)2.3 仪器设备的清洁与维护 (9)三、样品前处理 (11)3.1 样品的选择与制备 (11)3.2 样品浓缩与净化 (12)3.3 样品检测方法的建立 (13)四、实验操作流程 (14)4.1 样品进样 (16)4.2 柱塞泵的设置与调节 (17)4.3 检测器的选择与校准 (18)4.4 数据处理与结果分析 (19)五、理论基础与数学模型 (20)5.1 凝胶渗透色谱的理论基础 (22)5.2 数学模型在凝胶渗透色谱中的应用 (23)5.3 实验数据的解释与处理 (24)六、应用领域 (26)6.1 在化学领域中的应用 (28)6.2 在生物医学领域中的应用 (29)6.3 在环境科学领域中的应用 (30)七、常见问题与解决方案 (31)7.1 常见问题及原因分析 (32)7.2 预防措施与解决策略 (33)八、实验安全与防护 (34)8.1 实验室安全规程 (36)8.2 个人防护装备的使用 (37)8.3 应急处理措施 (38)九、最新研究进展 (39)9.1 新型凝胶材料的研究与应用 (40)9.2 色谱技术的创新与发展 (41)9.3 聚合物凝胶渗透色谱法的探索 (43)一、基本原理它的基本原理是利用具有不同孔径大小的多孔凝胶颗粒作为固定相，将待分离的混合物通过凝胶柱进行分离。
在色谱过程中，待分离的混合物会与凝胶颗粒发生相互作用，从而导致不同成分在凝胶颗粒之间的分配系数和扩散速率的差异。
根据这些差异，混合物中的各个成分可以通过不同的时间顺序依次通过凝胶柱，从而实现对混合物中各组分的高效分离。
GPC的关键参数包括：凝胶颗粒的大小和形状；溶液流速；压力；洗脱剂的选择和浓度。
凝胶渗透色谱法
凝胶渗透色谱法（GPC）一、凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱Gel Permeation Chromatography（GPC)，一种新型的液体色谱，原理是利用高分子溶液通过一个装填凝胶的柱子，在柱子中按分子大小进行分离。
柱子为玻璃柱或金属柱，内填装有交联度很高的球形凝胶。
其中的凝胶类型有很多，都是根据具体的要求而确定（常用的有聚苯乙烯凝胶）。
然而，无论哪一种填料，他们都有一个共同点，就是球形凝胶本身都有很多按一定分布的大小不同的孔洞（见图1）。
图1 GPC分离原理不仅可用于小分子物质的分离与鉴定，而且可作为用来分析化学性质相同但分子体积不同的高分子同系物。
可以快速、自动测定高聚物的平均分子量及分子量分布。
现阶段，已经成为最为重要的测定聚合物的分子量与分子量分布的方法。
二、测定原理凝胶色谱法的固定相采用凝胶状多孔性填充剂，是根据样品中各种分子流体力学提及的不同进行分离的。
比凝胶孔径大的分子完全不能进入孔内，随流动相沿凝胶颗粒间流出柱外，而娇小的分子则可或多或少地进入孔内。
因此大分子流程短，保留值小；小分子流程长，保留值大，所以凝胶色谱是按分子流体力学体积的大小，从大到小顺序进行分离的。
（见图2）图2 GPC淋出曲线溶质分子的体积越小，其淋出体积越大，这种解释不考虑溶质与载体间的吸附效应以及溶质在流动相和固定相中的分配效应，其淋出体积仅仅由溶质分子的尺寸和载体的孔径尺寸决定，分离完全是由于体积排除效应所致。
凝胶色谱的特点是样品的保留体积不会超出色谱柱中溶剂的总量，因为保留值的范围是可以推测的，这样可以每隔一定时间连续进样而不会造成谱峰的重叠，提高了仪器的使用率。
三、分子量校正曲线（LogM-V曲线）凝胶色谱图计算样品的分子量分布的关键是把凝胶色谱曲线中的淋洗体积V转化成分子量M，这种分子量的对数值与淋洗体积之间的曲线(LogM-V)称之为分子量校正曲线（见图3）。
图3 分子量校正(LogM-V)曲线➢排阻极限排阻极限是指不能进入凝胶颗粒空穴内部的最小分子的分子量。
凝胶渗透色谱概述
1. 凝胶渗透色谱的简单回顾凝胶渗透色谱[GPC（Gel Permeation Chromatography）][也称作体积排斥色谱(Size Exclusion Chromatography)]是三十年前才发展起来的一种新型液相色谱，是色谱中较新的分离技术之一。
利用多孔性物质按分子体积大小进行分离，在六十年前就已有报道。
Mc Bain用人造沸石成功地分离了气体和低分子量的有机化合物，1953年Wheaton和Bauman用离子交换树脂按分子量大小分离了苷、多元醇和其它非离子物质。
1959年Porath和Flodin 用交联的缩聚葡糖制成凝胶来分离水溶液中不同分子量的样品。
而对于有机溶剂体系的凝胶渗透色谱来说，首先需要解决的是制备出适用于有机溶剂的凝胶。
二十世纪60年代J.C.Moore在总结了前人经验的基础上，结合大网状结构离子交换树脂制备的经验，将高交联度聚苯乙烯凝胶用作柱填料，同时配以连续式高灵敏度的示差折光仪，制成了快速且自动化的高聚物分子量及分子量分布的测定仪，从而创立了液相色谱中的凝胶渗透色谱技术。
2. 凝胶渗透色谱的应用三十多年来，凝胶渗透色谱的理论、实验技术和仪器的性能等方面有了突飞猛进的发展。
尤其是随着新型柱填料的诞生、高效填充柱的出现(目前其理论塔板数已超过10000/米)以及计算机的普及，凝胶渗透色谱在工业、农业、医药、卫生、国防、宇航以及日常生活的各个领域得到了广泛的应用。
特别是近年来，随着各种高分子材料的问世，人们对高分子科学的不断探索，高聚物的分子量及其分布的测定显得尤为重要，成为科研和生产中不可缺少的测试项目之一。
例如：常见的聚苯乙烯塑料制品，其分子量为十几万，如果聚苯乙烯的分子量低至几千，就不能成型；相反，当分子量大到几百万，甚至几千万，它又难以加工，失去了实用意义。
科研和生产上通过控制高聚物的分子量及其分布宽度指数D(D=Mw/Mn)、分子量微分分布曲线、分子量积分分布曲线来生产出性能最佳的高聚物产品。
第5章 凝胶渗透色谱
•
死Hale Waihona Puke 间•调整保留时间 与固定液用量有
关
• 比保留体积 相对保留值 保留指数
• 色谱过程方程: VR=VM+VR’
•
VR=VM+KVS
•
色谱的保留值与热力学系数联系起来
• 色谱流出曲线方程：——研究色谱峰形
•
塔板理论：高斯分布曲线
•
c 标准偏差：
nc0
2 tR
exp
1 2
n 1
t tR
2
3.2分离机理简介
• 在现在，虽然GPC已经得到了广泛的应用， 但是就连基本的分理机理都处在百花争鸣 的阶段。目前模型机理可分为4大类：
3.2.1平衡排除理论
• 依据色谱方程，认为分离处于平衡时，即溶质在 胶体孔洞内的停滞时间大于它扩散入与扩散出孔 洞所需的时间，分离的过程就既不受扩散控制也 不受扩散影响。
tR / n
c
c0
2
exp
t tR
2 2
2
• 描述色谱峰大小的参数：
•
峰高h h c0
2
• 峰宽Ｗ W 4
• 分离度：描述峰分离情况
R
2
tR2 W1
tR1 W2
•
分离因素：保留值 峰窄
•
• 色谱定性分析－－依据保留值
• 与已知组分的保留值相比
• 与其它分析方法连用 如ＩＲ
• 第5章 凝胶渗透色谱法
•
• 色谱原理 • 流动相:载气 • 固定相:固体吸附剂等
•
图 气相色谱对样品分离过程示意图
• 色谱谱图解析
• 一 谱图表示方法: 横坐标 时间
•
纵坐标 检测器响应信号的大小 色谱图
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色谱仪组成示意图
示差折光检测器恒温区
S R
缓冲柱 柱温箱
进样阀
预热板
色谱柱
自动进样器
废液管
放空阀
废 液
溶 剂
溶剂输 送系统
I Out n
在线脱气
凝胶渗透色谱 HLC-8320 GPC 生产厂商：日本东曹株式会社
HLC-8320 GPC操作规程
GPC是如何工作的
凝胶色谱柱的分离
SEC 体积排 除色谱（ GPC）不同 于 HPLC, 没有化学作 用。
时间 顺序 (A) 样品进入(B) 尺寸分离 (C) 大尺寸 (D) 小尺寸溶质
溶剂流动
溶质 洗提洗提源自混合样品多孔性填料SEC 体积排
除色谱（
示差检测器
GPC）依靠
单纯的物理 色谱图（浓度淋洗曲线）
GPC/SEC体积排斥色谱
Log (分子量MW)
分子量MW vs. 淋洗体积
8.00
排斥
6.00
极限
4.00
2.00
0.00 10.0
15.0
20.0
淋洗体积 (mL)
全部 渗入
25.0
排阻极限 ----不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分 子量。所有大于排阻极限的分子都不能进入凝胶 颗粒内部，直接从凝胶颗粒外流出，所以它们同 时被最先洗脱出来。排阻极限代表一种凝胶能有 效分离的最大分子量，大于这种凝胶的排阻极限 的分子用这种凝胶不能得到分离。随固定相不同， 排阻极限范围约在 400至60×106之间。
体积排斥色谱（SEC)工作原理
➢ 以多孔树脂为固定相，用溶剂推动分子量大小 不同的样品流过固定相产生大小分子顺序流出 的分离
➢ 流出级份的保留时间（洗脱体积）提供其分子 量（尺寸）的信息
➢ 用检测器得到各流出组分的强度和流出时间 ➢ 用已知分子量的标样标定出流出时间和分子量
的关系 ➢ 用标定好的时间和分子量的关系对未知样各流
合物
超临界
有机组份键合于 超临界流体和
流体
固体表面
键合相间分配
体积排斥色谱 SEC( Size Exclusion Chromatography）的发展史
1953年 Wheaton和Bauman 用多孔离子交换树脂按 分子量大小分离了苷、多元醇和其它非离子物质， 观察到分子尺寸排除现象。 ➢ 1959年 Porath和 Flodin 用葡聚糖胶联制成凝胶 来分离水溶液中不同分子量的样品。 ➢ 1962年 J.C.Moore 将高交联度聚苯乙烯-二乙烯基 苯树脂用作柱填料，以连续式高灵敏度的示差折光 仪，并以体积计量方式作图，制成了快速且自动化 的高聚物分子量及分子量分布的测定仪，从而创立 了液相色谱中的凝胶渗透色谱技术。
凝胶渗透色谱法测定 分子量分布原理
实验目的
1 掌握GPC测定物质分子量及其分布 的基本原理和仪器的使用方法。 2 测定样品的GPC谱图，由软件获得 Mn,Mw,PDI。
色谱分类
分类
方法
固定相
平衡类型
气 气液色谱
液体吸附于固体 气液间分配
相 气固色谱
固体吸附剂
吸附
色 气相键合色谱 有 机 组 份 键 合 于 液 体和 键合 体
凝胶过滤色谱 (GFC:Gel filtration chromatography) – 主要用于生命科学领域 – 以水溶液为流动相 – 常用固定相填料：亲水性有机凝胶(葡聚糖， 琼脂糖，聚丙烯酰胺等)
GPC载体的种类： 1. 交联聚苯乙烯凝胶 2. 多孔性玻璃 3. 半硬质及软质填料包括聚乙酸乙烯 酯凝胶及聚丙烯酰胺凝胶 4. 木质素凝胶等
DVB/PS Packing Particle 20,000x
有机 GPC 介质
▪ 悬浮聚合产生苯乙烯基二乙基苯聚合物的单体颗粒 ▪ 开始的小颗粒融合集合成最终的颗粒 ▪仔细控制反应环境产生出合适的单体孔和颗粒的尺寸
Pore Structure Defines Resolving Range
体积排除分离机理
1 打开电脑，点击EcoSEC-WS工作站，输入密码，进入 采集控制应用程序。
2 开启仪器电源，点击工作站控制系统Power按钮，待 联机显示成功后，设定流速、温箱温度和检测条件。
3 设定Warm Up时的流速和待机时间，并执行该程序。
4 将待测样品放入样品托盘，设定运行时间、数据采 集时间、样品测定序列，执行Analysis 程序，进行标 准物质和样品的测定及数据处理。
(Ultracentrifuge) – Mw/Mn：为多分散性(Polydispersity) – Mn<Mv<Mw<Mz<Mz+1
聚合物的分子结构
PD = Mw / Mn
分子量分布
增加分子量
分子量分布
单分散性聚合物 窄分布聚合物
中等分布聚合物 宽分布聚合物
Mw/Mn = 1.00 Mw/Mn < 1.20 Mw/Mn < 2.00 Mw/Mn > 2.00
分离原理。
(A)
(B)
(C)
(D)
保留时间
进 样
色谱柱对GPC/SEC 色谱分离的影响
参数
峰的分离
峰加宽
分辨率和准确率
色谱柱体积
++
色谱柱填料:
填料颗粒尺寸
0
填料颗粒的孔隙率 +
填料颗粒的形状 0
孔的尺寸分布
+
孔的形状
0
++
++
凝胶柱的分离按照尺寸进行
++
++
0
+
0
0
0
+
0
0
0 = 可以忽略的因素 + = 影响适中的因素 ++ = 影响很大的因素
5 测试完毕后，执行Shut Down程序，待控制面板显示 Power Off 后关闭仪器电源和电脑。
SEC 分类
凝胶渗透色谱 (GPC: Gel permeation chromatography ) – 主要用于聚合物领域 – 以有机溶剂为流动相(氯仿，THF，DMF) – 常用固定相填料：苯乙烯－二乙烯基苯共聚物
凝胶色谱的任务
分子量的分布与高分子材料的 所有关键加工特性以及材料性能紧 密相关
Plastics Technology, May 1986
聚合物的各种平均分子量
用SEC测得的不同种平均分子量可对应于其他仪器所 测的值：
– Mn：用渗析计测出(Osmometry) – Mw：用光散射计测出(Light Scattering) – Mv：用粘度计测出(Viscometry) – Mz及Mz+1：用超速离心法测出
谱
固体表面
表面间的分配
液液色谱
液体吸附于固体 不 相溶 液体 间
的分配
液
液 固 ( 吸 附 ) 色 固体吸附剂 谱
吸附
相 液相键合色谱 有 机 组 份 键 合 于 液 体和 键合 体
色
固体表面
表面间的分配
谱 离子交换色谱 离子交换树脂
离子交换
凝胶渗透(尺寸 液 体 附 于 多 孔 聚 分配/筛析
排阻)色谱