凝胶渗透色谱
凝胶渗透色谱
GPC分离是基于样品分子的溶剂化体积
GPC 在色谱柱中的分离是基于分子在溶剂表现
出的体积而不是分子量
GPC分离原理
(1) 固定相是多孔填料，小分子样品可以进入孔 径内部
(2) 样品与固定相之间无作用力
(3) 迁样品移时间不同
填充物颗粒
大
中
孔穴
小
GPC分离原理示意图
solution
solvent
浓度检测器
体积大的分子先 被淋洗出来
体积小的分子后 被淋洗出来
GPC是如何工作的
GPC曲线
GPC曲线
浓度响应
W(M)
代代表表了了相分对子分量子的质大量小的--M大；小—M 浓度响应代表了了含含量量—--WW（(MM）)
样品制备的影响
样品浓度与分子量相关（分子量越大，浓度越低） 除非该样品可能会有剪切效应发生，聚合物溶液必须
过滤 为了增加样品的溶解，可轻微扰动（不要剧烈摇动或
1 凝胶色谱的任务
分子量的分布与高分子材料 的所有关键加工特性以及材料 性能紧密相关
聚合物的分子结构
PD = Mw / Mn
分子量分布
增加分子量
聚合物的各种平均分子量
用GPC测得的不同种平均分子量可对应于其他仪器所 测的值：
– Mn：用渗析计测出(Osmometry) – Mw：用光散射计测出(Light Scattering) – Mv：用粘度计测出(Viscometry) – Mz及Mz+1：用超速离心法测出(Ultracentrifuge) – Mw/Mn：为多分散性(Polydispersity) – Mn<Mv<Mw<Mz<Mz+1
高效凝胶渗透色谱法
高效凝胶渗透色谱法
高效凝胶渗透色谱法（Gel Permeation Chromatography，GPC），又称凝胶过滤色谱，是一种分离大分子化合物的色谱技术。
该技术基于样品分子在凝胶纳米孔道中的渗透性差异，通过溶液中大分子与凝胶孔道的相互作用，实现溶液中分子的分离。
高效凝胶渗透色谱法主要包括以下步骤：
1. 样品制备：将待分离的大分子溶于适当的溶剂中，并使用过滤器或超滤器去除杂质。
2. 色谱柱选择：根据溶液中分子的分子量范围选择合适的高分子凝胶柱。
常用的凝胶材料包括聚合物和硅胶。
3. 柱温控制：根据样品性质，可选择恒温柱柱温控制，提高分离效果。
4. 流动相选择：根据样品的性质选择合适的流动相，常用的流动相包括有机溶剂和缓冲溶液。
5. 柱体填充：将凝胶填充到柱体中，保证凝胶均匀分布。
6. 样品进样：将样品溶液注入柱体，通过凝胶孔道渗透分离。
7. 分离分析：样品分子在凝胶孔道中的渗透速度不同，根据渗透速度的大小进行分离分析。
8. 检测器检测：通过检测器检测分离后的样品，常用的检测器包括紫外-可见光谱仪和光散射检测器。
高效凝胶渗透色谱法广泛应用于聚合物、蛋白质、天然高分子等大分子的分离和纯化。
与其他色谱技术相比，高效凝胶渗透色谱法具有分辨率高、选择性好、样品制备简单等优点，是一种重要的分离技术。
凝胶过滤色谱法和凝胶渗透色谱法的区别
凝胶过滤色谱法和凝胶渗透色谱法是生物化学领域常用的两种分离和纯化方法。
它们在分子大小分离和蛋白质结构分析中发挥着重要作用。
今天，我们将深入探讨这两种方法之间的区别，以便更好地理解它们的应用和优势。
一、原理1. 凝胶过滤色谱法：凝胶过滤色谱法是一种按照分子大小分离物质的方法。
它利用具有特定孔径大小的凝胶填料，大分子无法进入凝胶孔隙而直接流出，而小分子则能够进入孔隙而被滞留，从而实现分子的分离和纯化。
3. 凝胶渗透色谱法：凝胶渗透色谱法是一种根据分子在凝胶中的渗透速度来分离物质的方法。
它利用凝胶填料形成的三维网络结构，分子在凝胶中的渗透速度与其分子大小成反比，因此分子越大，其在凝胶中的渗透速度越快，分子越小，渗透速度越慢，从而实现分子的分离和纯化。
二、区别1. 分离原理不同：凝胶过滤色谱法是根据分子大小的不同把大分子和小分子分离开来的，而凝胶渗透色谱法则是根据分子在凝胶中的渗透速度的不同进行分离的。
2. 分子范围不同：在凝胶过滤色谱法中，适用于分离分子量较大的物质，而凝胶渗透色谱法适用于分离各种分子量的物质，并且对于高分子更为有效。
3. 分离效果不同：凝胶过滤色谱法可以获得较好的分离效果，但对于高分子的分离效果不如凝胶渗透色谱法。
而凝胶渗透色谱法可以实现对高分子的高效分离。
三、应用凝胶过滤色谱法常用于分离蛋白质、多肽和核酸等生物大分子，用来检测生物大分子的分子大小和形态。
而凝胶渗透色谱法除了用于生物大分子的分离外，还可以用于溶液中各种溶质的分子量测定。
四、个人观点以上就是凝胶过滤色谱法和凝胶渗透色谱法的区别和应用。
在实际科研工作中，选择合适的色谱方法对于提高分离效率和分析准确性非常重要。
我们需要根据样品的特性和需要进行全面评估，选择合适的色谱方法进行分离和分析。
总结回顾通过本文的讨论，我们对于凝胶过滤色谱法和凝胶渗透色谱法有了更全面的了解。
这两种色谱方法在生物化学和生物医药领域具有重要的应用价值，能够帮助科研人员进行生物大分子的分离、纯化和分析，对于推动生物技术和医药领域的研究具有重要的意义。
第九章凝胶渗透色谱讲解
凝胶色谱分析二〇一一年九月九日第九章凝胶色谱分析凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography, GPC），又称尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography, SEC），其以有机溶剂为流动相，流经分离介质多孔填料（如多孔硅胶或多孔树脂）而实现物质的分离。
GPC可用于小分子物质和化学性质相同而分子体积不同的高分子同系物等的分离和鉴定。
凝胶渗透色谱是测定高分子材料分子量及其分布的最常用、快速和有效的方法[1]。
凝胶渗透色谱（GPC）的创立历程如下[2,5]：1953年Wheaton和Bauman用多孔离子交换树脂按分子量大小分离了苷、多元醇和其它非离子物质，观察到分子尺寸排除现象；1959年Porath和Flodin用葡聚糖交联制成凝胶来分离水溶液中不同分子量的样品；1964年J. C. Moore将高交联密度聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂用作柱填料，以连续式高灵敏度的示差折光仪，并以体积计量方式作图，制成了快速且自动化的高聚物分子量及分子量分布的测定仪，从而创立了液相色谱中的凝胶渗透色谱。
近年来，光散射技术（如图9-1所示，一束光通过一间充满烟雾的房间，会产生光散射现象。
）广泛应用于高分子特征分析领域[3]。
将光散射技术和凝胶渗透色谱（GPC）分离技术相结合，可以测定大分子绝对分子量、分子旋转半径、第二维里系数，也可测定分子量分布、分子形状、分枝率和聚集态等。
目前，该技术在高分子分析领域已成为一种非常有效的工具，在美国，日本及欧洲广为使用，国内近年来亦引进了此项技术。
入射光散射光图9-1光散射现象9.1 基本原理9.1.1凝胶渗透色谱分离原理让被测量的高聚物溶液通过一根内装不同孔径的色谱柱，柱中可供分子通行的路径包括粒子间的间隙（较大）和粒子内的通孔（较小）。
如图9-2、图9-3所示，当待测聚合物溶液流经色谱柱时，较大的分子只能从粒子间的间隙通过，被排除在粒子的小孔之外，速率较快；较小的分子能够进入粒子中的小孔，通过的速率慢得多。
现代材料分析测试技术 凝胶渗透色谱 GPC
• 含有固化剂的EPOXY
酚醛树脂在室温条件下的自然 固化现象观察
8 6 4
RI/mv
2 0 -2 -4 15
1d 2d 5d 11d 19d
20
25 t/min
30
35
补充内容：水相GPC的应用
• 用于溶解于水的聚合物 • 较有机相GPC要复杂得多
水相GPC中存在的问题
• 非体积排除效应
• 分子尺寸不能直接反映分子质量及其分布 的信息。
聚合物分子量的特点
1.分子量大 2.多分散性
3.分子量统计平均值+分布系数才能确切 描述聚合物分子量
GPC分离机理
二、GPC仪器的基本配置
• • • • • • 溶剂贮存器(Solvent) 泵(Pump) 进样系统(Autosample ) 色谱柱(column) 检测器(detector) 数据采集与处理系统(Data Acquirement and Process System) • 废液池 (Waste)
（1）分子质量变化不大
• 这是由于分子链发生了氧化现象，生成了 其它物质，如羟基被氧化为醛、酮或酯的 结构，这时聚合物整体的分子链长度没有 明显的改变，但聚合物的性质发生了变化， 这时可以通过红外的方法检测其分子链结 构组成的变化。
（2）分子质量降低
• 有些高聚物的老化是因为分子链的断裂， 这时分子量急剧下降，使产品性能发生显 著的变化。如纤维强度下降，变脆，达不 到使用要求。
仪器基本配置流程图
3 2.5 2
RI/mv
1.5 1 0.5 0 -0.5 0 5 10 15 20 25 30 35 t/min
泵(515 HPLC Pump)
• 要求精度很高
凝胶渗透色谱
凝胶渗透色谱目录一、基本原理 (2)1.1 凝胶的特性 (2)1.2 色谱的分离原理 (3)1.3 凝胶渗透色谱在分离技术中的应用 (5)二、仪器设备 (6)2.1 凝胶渗透色谱仪的主要组成部分 (7)2.2 主要性能指标及选择 (9)2.3 仪器设备的清洁与维护 (9)三、样品前处理 (11)3.1 样品的选择与制备 (11)3.2 样品浓缩与净化 (12)3.3 样品检测方法的建立 (13)四、实验操作流程 (14)4.1 样品进样 (16)4.2 柱塞泵的设置与调节 (17)4.3 检测器的选择与校准 (18)4.4 数据处理与结果分析 (19)五、理论基础与数学模型 (20)5.1 凝胶渗透色谱的理论基础 (22)5.2 数学模型在凝胶渗透色谱中的应用 (23)5.3 实验数据的解释与处理 (24)六、应用领域 (26)6.1 在化学领域中的应用 (28)6.2 在生物医学领域中的应用 (29)6.3 在环境科学领域中的应用 (30)七、常见问题与解决方案 (31)7.1 常见问题及原因分析 (32)7.2 预防措施与解决策略 (33)八、实验安全与防护 (34)8.1 实验室安全规程 (36)8.2 个人防护装备的使用 (37)8.3 应急处理措施 (38)九、最新研究进展 (39)9.1 新型凝胶材料的研究与应用 (40)9.2 色谱技术的创新与发展 (41)9.3 聚合物凝胶渗透色谱法的探索 (43)一、基本原理它的基本原理是利用具有不同孔径大小的多孔凝胶颗粒作为固定相，将待分离的混合物通过凝胶柱进行分离。
在色谱过程中，待分离的混合物会与凝胶颗粒发生相互作用，从而导致不同成分在凝胶颗粒之间的分配系数和扩散速率的差异。
根据这些差异，混合物中的各个成分可以通过不同的时间顺序依次通过凝胶柱，从而实现对混合物中各组分的高效分离。
GPC的关键参数包括：凝胶颗粒的大小和形状；溶液流速；压力；洗脱剂的选择和浓度。
凝胶渗透色谱法
凝胶渗透色谱法（GPC）一、凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱Gel Permeation Chromatography（GPC)，一种新型的液体色谱，原理是利用高分子溶液通过一个装填凝胶的柱子，在柱子中按分子大小进行分离。
柱子为玻璃柱或金属柱，内填装有交联度很高的球形凝胶。
其中的凝胶类型有很多，都是根据具体的要求而确定（常用的有聚苯乙烯凝胶）。
然而，无论哪一种填料，他们都有一个共同点，就是球形凝胶本身都有很多按一定分布的大小不同的孔洞（见图1）。
图1 GPC分离原理不仅可用于小分子物质的分离与鉴定，而且可作为用来分析化学性质相同但分子体积不同的高分子同系物。
可以快速、自动测定高聚物的平均分子量及分子量分布。
现阶段，已经成为最为重要的测定聚合物的分子量与分子量分布的方法。
二、测定原理凝胶色谱法的固定相采用凝胶状多孔性填充剂，是根据样品中各种分子流体力学提及的不同进行分离的。
比凝胶孔径大的分子完全不能进入孔内，随流动相沿凝胶颗粒间流出柱外，而娇小的分子则可或多或少地进入孔内。
因此大分子流程短，保留值小；小分子流程长，保留值大，所以凝胶色谱是按分子流体力学体积的大小，从大到小顺序进行分离的。
（见图2）图2 GPC淋出曲线溶质分子的体积越小，其淋出体积越大，这种解释不考虑溶质与载体间的吸附效应以及溶质在流动相和固定相中的分配效应，其淋出体积仅仅由溶质分子的尺寸和载体的孔径尺寸决定，分离完全是由于体积排除效应所致。
凝胶色谱的特点是样品的保留体积不会超出色谱柱中溶剂的总量，因为保留值的范围是可以推测的，这样可以每隔一定时间连续进样而不会造成谱峰的重叠，提高了仪器的使用率。
三、分子量校正曲线（LogM-V曲线）凝胶色谱图计算样品的分子量分布的关键是把凝胶色谱曲线中的淋洗体积V转化成分子量M，这种分子量的对数值与淋洗体积之间的曲线(LogM-V)称之为分子量校正曲线（见图3）。
图3 分子量校正(LogM-V)曲线➢排阻极限排阻极限是指不能进入凝胶颗粒空穴内部的最小分子的分子量。
凝胶渗透色谱概述
1. 凝胶渗透色谱的简单回顾凝胶渗透色谱[GPC（Gel Permeation Chromatography）][也称作体积排斥色谱(Size Exclusion Chromatography)]是三十年前才发展起来的一种新型液相色谱，是色谱中较新的分离技术之一。
利用多孔性物质按分子体积大小进行分离，在六十年前就已有报道。
Mc Bain用人造沸石成功地分离了气体和低分子量的有机化合物，1953年Wheaton和Bauman用离子交换树脂按分子量大小分离了苷、多元醇和其它非离子物质。
1959年Porath和Flodin 用交联的缩聚葡糖制成凝胶来分离水溶液中不同分子量的样品。
而对于有机溶剂体系的凝胶渗透色谱来说，首先需要解决的是制备出适用于有机溶剂的凝胶。
二十世纪60年代J.C.Moore在总结了前人经验的基础上，结合大网状结构离子交换树脂制备的经验，将高交联度聚苯乙烯凝胶用作柱填料，同时配以连续式高灵敏度的示差折光仪，制成了快速且自动化的高聚物分子量及分子量分布的测定仪，从而创立了液相色谱中的凝胶渗透色谱技术。
2. 凝胶渗透色谱的应用三十多年来，凝胶渗透色谱的理论、实验技术和仪器的性能等方面有了突飞猛进的发展。
尤其是随着新型柱填料的诞生、高效填充柱的出现(目前其理论塔板数已超过10000/米)以及计算机的普及，凝胶渗透色谱在工业、农业、医药、卫生、国防、宇航以及日常生活的各个领域得到了广泛的应用。
特别是近年来，随着各种高分子材料的问世，人们对高分子科学的不断探索，高聚物的分子量及其分布的测定显得尤为重要，成为科研和生产中不可缺少的测试项目之一。
例如：常见的聚苯乙烯塑料制品，其分子量为十几万，如果聚苯乙烯的分子量低至几千，就不能成型；相反，当分子量大到几百万，甚至几千万，它又难以加工，失去了实用意义。
科研和生产上通过控制高聚物的分子量及其分布宽度指数D(D=Mw/Mn)、分子量微分分布曲线、分子量积分分布曲线来生产出性能最佳的高聚物产品。
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Sample PE-150C-2h Sample PE-150C-4h Sample PE-160C-2h Sample PE-160C-4h Sample PE-170C-2h Sample PE-170C-4h
用GPC测得的分子量分布可以计算出各种不同 种平均分子量，可对应于其他仪器所测的值。
4. 存在问题及解决办法
标样与待测样品不同种类
以同类聚合物的标准样品可绘制出标准曲线，给
出淋出体积与分子量的关系。
不同种类的聚合物，在溶剂中受到的作用不同，
所以即使相同的分子量也会有不同的溶剂化体积
采用标样的校正曲线，只能得到与标样分子溶剂
2 凝胶渗透色谱的原理
以多孔树脂为固定相
用溶剂推动聚合物样品流过固定相 产生大小分子顺序流出的分离
Vg载体骨架体积
Vi载体孔洞体积
淋出体积 Ve=V0+KVi
分配系数 0<K<1
V0载体粒间体积
V0和Vg对分离没有贡献，应尽量减小，Vi越大分离效果越好
凝胶渗透色谱柱是如何工作的
流出级份的保留时间（洗脱体积） 提供其分子量（尺寸）的信息。 从检测器信号强度得到各流出级分 的浓度。
尽量减轻分子间的弱相互作用（样品分子间、样 品和溶剂分子间、填料和样品分子间等） 使难于溶解的样品得以溶解（如聚烯烃PE\PP、 工程塑料PPS等） 使GPC检测处在一个温度稳定的环境
废液管 检测器3 废 液 检测器2 检测器1 连接管
柱温箱 进样阀 GPC色谱柱
一体化温控区的示意图
在同一个温控区集成了进样阀、色谱柱、检测器，保证温度 的一致性和稳定性
样品制备的影响
样品浓度与分子量相关（分子量越大，浓度越低） 除非该样品可能会有剪切效应发生，聚合物溶液必 须过滤
为了增加样品的溶解，可轻微扰动（不要剧烈摇动 或用超声）
窄分布标样不必过滤，高分子量标样也不要剧烈摇 动 可使用在线过滤器，但是不推荐使用保护柱
样品制备的影响
150 C
170 C
研发历程：
1953年--Wheaton和Bauman-用多孔树脂按分子量大小分离了苷、多元醇和其它非离子物 质，观察到分子尺寸排除现象。 1959年--Porath和Flodin— 用葡聚糖凝胶分离了水溶液中不同分子量的样品。 1962年--J.C.Moore— 将连续式高灵敏度的示差折光仪接在分离柱后，并以体积计 量方式作图，制成了快速且自动化的高聚物分子量及分子量 分布的测定仪，创立了凝胶渗透色谱技术。 凝胶渗透色谱 GPC---Gel Permeation Chromatography 也称作体积排斥色谱 SEC---Size Exclusion Chromatography 以溶剂作流动相，流经多孔填料作为分离介质的液相色谱 法。
样品制备的影响
固态 (半结晶)
液态 (稀溶液)
样品制备的影响
用淋洗液制样，使聚合物在分析的整个过程 中处于稳定状态，并且使溶剂峰最小 溶解必须使聚合物链打开成最放松的状态
允许充分的时间让链展开
有些聚合物需要大于3小时
分子量及结晶度愈大，所需真正溶解的时间 就俞多
某些结晶的聚合物需要加热
缓冲柱
放空阀
柱温箱
废液
色谱柱 进样阀
预热板
溶剂
I n
Out
溶剂输送系统
在线脱气
典型分离式GPC系统示意图
为GPC加热的理由
降低流动相黏度，使得谱柱内部溶剂处于接近理 想的GPC状态（如Polyethylene – Terphthalate m-Cresol + 0.05 m LiBr/100 °C）
化体积相同的相对分子量
讨论： 请给出你的解决办法
5. 对测试结果产生影响的因素
输液系统 样品制备 进样系统 柱温变化 色谱柱结构与性能 检测器的影响 流动相的种类
溶剂输送系统
高流速精度是获得重现性 GPC结果的基础 微小的流速误差会导致分子 量计算的很大误差 使用参考峰 ( Flow Markers) 的技术可校正流速误差
实验室温度波动对RI检测器基线的影响
20.0 Temp.(Deg C)
19.5 19.0 18.5
Room Temperature
2.00
RI Baseline
1.00 MV
0.00 -1.00 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Minutes 50 55 60 65 70 75
用已知分子量的标样标定出流出 时间和分子量的关系， 再对未知样各流出级份的时间（ 分子量）和强度进行统计计算得 到分子量分布。 聚合物在色谱柱中的分离是基于分子 在溶剂中表现出的体积而不是分子量
由示差检测器连续记录 流出样品的浓度
溶剂化体积
3. 凝胶渗透色谱仪
示差折光检测器恒温区 加热废液管儿
S R
聚合物的分子结构
PD = Mw / Mn
分子量分布
增加分子量
聚合物的各种平均分子量
Mn：用渗析计测出(Osmometry) Mw：用光散射计测出(Light
Scattering) Mv：用粘度计测出(Viscometry) Mz及Mz+1：用超速离心法测出(Ultracentrifuge) Mw/Mn：为多分散性(Polydispersity) Mn<Mv<Mw<Mz<Mz+1
进样系统的影响
40 瓶位样品盘 2ml 玻璃瓶卷边压紧铝瓶盖 优先进样的样品缓慢搅拌 双温区设计是降解风险降至最低
进样点
进样点
热区 温区
200
温度 (C)
100
50 -20
-10
0
10
20
瓶位
Carousel Motion
Agitated
自动进样器
柱温对分辨率影响
Column : Eluent : Flow rate : PLgel 5um MIXED-C 300x7.5mm DMF 1.0ml/min
Mobil Phase – Methanol @ 0.25/mL minute Detector Temp 35 C No Column Heater Used
Waters G2000高温凝胶色谱仪
多检测器集成的 GPC 系统
紫外检测器（浓度型）
粘度检测器（分子量型）
多角激光光散射检测器（分子量型） 红外接口（特征基团型为测量短链支化）