光化学传感器理论与实践-第七章1

植 物 凝 血 素
激 素 抗 体
目前应用：生物修饰敏感层主要涉及酶，抗原或抗 体。
酶相关知识
酶的定义：是一类具有催化活性的蛋白质分子。 酶特点 (优点) 影 响 酶 活 性 因 素 非常高的特异性 非常高的催化效率
活性基团种类：组氨酸上的咪唑基、丝氨 酸上的羟基、半胱氨酸上的巯基等 活性中心的空间构象：独特的三维结构 决定了酶发挥其活性的基础 环境因素：pH值影响(最佳：生理pH7.4), 抑 制剂 (Ag+、Hg2+、As3+等)存在使酶失活
抗原-抗体结 合力的主要 贡献者
免疫光化学传感器响应
免疫光化学传感器响应特点：与热力学平衡有关
Ab Ag Ab - Ag
免疫光化学传感器响应
无需标记：抗原-抗体结合前后会引起体系
荧光强度或偏振程度的变化而直接被检测。
抗原抗
体检测 需标记：无光学性质变化，进行荧光标记。
Ag Ag Ab Ag - Ab Ag - Ab
d[S] d[P] K 2 [E]0 [S] k 2 [ES] 米氏方程(一): V dt dt (k1 k 2 )/k1 [S]
其中： [E]0 [E] [ES] 当[S]很大时： V Vmax k2 [E]0
米氏方程(二):
Vmax[S] V K m [S]
* *
或
Ag Ab Ab* Ag - Ab Ag - Ab*
降低抗原-抗体结合力提高光化学传感器的可逆性
1.减少主体溶剂极性降低抗体－抗原之间的 疏水相互作用从而降低抗原与抗体结合力 (消极，因为：结合力发、灵敏度下降) 措施 2.通过改变测量温度降低结合力的方法(消极) 3.通过缓释技术，或竞争结合原理可以作成
第七章
第一节
第二节
生物修饰传感器
识别原理
基于普通光学波导传感器的酶催化传感器
第三节
第四节
基于化学修饰传感器的酶催化传感器
基于简单免疫体系的光化学传感器
第五节
第六节
基于竞争免疫体系的光化学传感器
核酸生物修饰传感器
第三节
基于化学修饰传感器的酶催化传感器
技术产生背景
有些酶催化的反应不产生或不消耗可直接光学检测 的物质，但涉及质子的产生与消耗、氧气的产生与消 耗、酸性或碱性气体(CO2或NH3)产生与消耗。这些 物质很容易被化学修饰光化学传感器所检测，故可采 用相应化学修饰光化学传感器作内传感器构建酶催化 传感器。
+
O N O
O
心肌黄酶 NAD
O-
O N
O
+
9-羟基异吩噁唑 (强荧光) 灵敏度提高2倍
刃天青 (无荧光)
2. 与NADH反应产生紫外可见吸收
心肌黄酶
NADH
+
噻唑蓝
NAD
+
紫色甲臜 强吸收 lmax=558nm
基于其它荧光体系的酶催化传感器
基于辣根过氧化酶(HRP)催化 硫胺素的H2O2荧光传感器： 硫胺素 + H2O2
文献
﹝7，8﹞
﹝9﹞
胆酸
乙醇 苹果酸、草酸盐 甘油-3-磷酸 3-羟基-丁酸 辅酶I 睪酮雄（甾）酮
羟基类固醇脱氢酶
醇脱氢酶 苹果酸脱氢酶
3-羟基胆酸+NAD胆酸酮 +DADH
乙醇+ NAD乙醛+NADH 苹果酸+ NAD草酸盐+NADH 萄糖酸内酯+NADH
﹝10﹞
﹝7，11﹞ ﹝12﹞ ﹝12﹞ ﹝12﹞ ﹝12﹞ ﹝12﹞
碳酸酐酶
促进同分异构体的相互转变 磷酸葡萄糖变化酶 促进键的形成，同时使ATP 分子中的高能磷酸键断裂 谷氨酰胺合成酶
酶在光化学传感器中应用
目前主要限于：氧化还原酶，转移酶。
原因： 常常伴随有可供光学检测的物质的产生或消耗; 可直接采用普通光学波导传感器作为内传感器器件; 有时酶所催化的化学反应可能不产生或不消耗可供检测 的物质，但往往伴随有易于被化学修饰光化学传感器检 测的物质（例如H＋、O2、NH3等）的生成与消耗。
识别原理：在生物修饰传感器中，修饰的生物敏 感层在对分析对象进行生物识别的同时，能向普
通光学波导传感器或化学修饰光化学传感器提供
可检测的光学信号。
特点：与分子或离子化学识别相比，生物 识别有更高的选择性与灵敏度。
生物修饰敏感层
具有生物识别功能的生物物质 酶 抗 原 或 抗 体
微 生 物
结 合 蛋 白
免疫反应
免疫反应：当动物体收到外界异性物质（抗原）的侵
入时，动物体内的免疫系统细胞就会产生一种与这
些异性物质相对抗的物质（抗体），通过抗体与抗
原的结合使抗原的作用消失。
免疫反应
抗原：具有免疫原性与抗原特异性。按来源可分为 天然抗原、人工抗原和合成原。一般为具有较大分 子量的生物活性物质，例如蛋白质、多糖、核酸等， 有时为小分子活性物质(半抗原)，药物，激素，肽 等。
尼龙网
器
葡萄糖 + O2
葡萄糖
O2
样品
葡萄糖酸
图7-5 氧光化学传感器为基础光极的葡萄糖生物传感器
传感器的特性
样品中葡萄的浓度越大，传感器的荧光强度
信号越大；
检测范围0.1 ~ 20 mmol/L；
响应时间几分钟之内。
氨气酶光极传感器为基础传感器的 酶催化传感器
由Blum等人提出(Anal. Chim. Acta, 1989, 227, 387) 荧光素酶
ATP + 荧光素 + O2
AMP + 氧化荧光素 + PPi + CO2
hn (lmax=560 nm)
应用：
检测ATP， DL=10-10 molL-1 其它有ATP参与的代谢过程所涉及的反应物
NADH-黄素单核苷酸(FMN)-氧化还原酶-O2-荧光素酶 生物催化发光体系 氧化还原酶 NADH + H+ + FMN 荧光素酶 FMNH2 + RCHO + O2 FMN + RCOOH + H2O hn(lmax = 490nm) NAD + FMNH2
其中： K m (k1 k 2 )/k1
检测器
光学波导
内传感器
光极
生物催化层
底物 酶 产物
底物
样品
产物
图7-2 酶催化光化学传感器识别原理
识别过程
传质 扩散
底物(分析对象)：样品相 产物：生物催化层 生物催化层 样品相
稳态响应信号：产物生成速度恰好等于产物离开生物 层的净速度。 分析对象 根据校正曲线+稳态响应信号(快响应) 浓度测定 根据校正曲线+反应速率(响应时间较长)
基于化学或生 物发光的酶催 化反应体系
鲁米诺(Luminol)+H2O2化学发光体系
许多氧化酶催化的反应伴随有H2O2产生，将氧化酶与过氧化 酶固定在一起可建立灵敏的化学发光酶催化传感器，用于检 测底物，如：尿酸、氨基酸、乳酸、葡萄糖、胆固醇、胺类、 丙酮酸等。
ATP-荧光素-O2-荧光素酶生物发光体系
的重要物质，在反应中主要起递氢作用。
还原型(NADH)：荧光较强 辅酶I类型 lEx = 360nm, lEM = 460nm 氧化型(NAD)：无荧光
表7-3 检测NADH荧光的脱氢酶催化传感器
分析对象
乳酸、丙酮酸
葡萄糖
固定化酶
卤酸脱氢酶
葡萄糖脱氢酶
催化反应
乳酸+NAD丙酮+NADH
葡萄糖+ NAD葡萄糖酸内酯 +NADH
第二节
基于普通光学波导传感器 的酶催化传感器
紫外吸收
类型
(根据检测信号分) 荧光(NADH体系 )
化学发光(Luminol)
基于紫外吸收信号检测的酶催化传感器
探测光纤 信号光纤
例：基于碱性磷酸酯酶的普通光化学传感器
Anal. Chem. 1985,57,565 滤光片 404.7nm
公共端
钨灯
P M T
-COOH端
图7-3 IgG 分子结构示意图
五种免疫球蛋白结构示意图
抗体与抗原的结合力
氢键力 作用 通过 NH2 OH 作 用 非极性 作用 库仑力 作用 分子间 吸引力 立体排 斥力
通过非 极性侧 链作用

通过两 侧链相 反电荷 吸引
通过范 德华力 作用
通过结 合部电 子云互 补 抗体识别 抗原分子 的基础
葡糖-6-磷酸-脱氢酶 甘油-3-磷酸+ NAD6-磷酸葡 3-羟基-丁酸脱氢酶 醇脱氢酶 羟基类固醇脱氢酶
3-羟基-丁酸+ NAD乙酰乙酸 +NADH 乙醇+ NAD乙醛+NADH 睾酮雄（甾）酮+ NAD类固醇 +NADH
与NADH生成反应耦合
1. 与NADH反应产生更强荧光产物
O-
NADH
可逆响应的光化学传感器(积极)
第七章
第一节
第二节
生物修饰传感器
识别原理
基于普通光学波导传感器的酶催化传感器
第三节
第四节
基于化学修饰传感器的酶催化传感器
基于简单免疫体系的光化学传感器
第五节
第六节
基于竞争免疫体系的光化学传感器
核酸生物修饰传感器
第二节
基于普通光学波导传感器 的酶催化传感器
概念：当酶催化反应直接产生或消耗可供光学检 测的物质时，可将相应的酶固定于普通光学波 导传感器的探头上，构成酶催化传感器。
酶蛋白
辅助因子 蛋 白 链
全酶的结构与分子组成