河豚毒素性能特点及检测方法
河豚毒素研究及其免疫研究PPT课件
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参考文献
[1] 于丽华,周力,谢克勤.河豚毒素对小鼠镇痛作用的实验研究[J].山东医科大学学报, 1999, 37(2): 120. [2] 李中华,李春英,汪晨净.TTX局部应用对家兔齿髓刺激所引起的疼痛的影响[J].中国药理学会通讯, 2000,
17(2): 47. [3] 潘心富,黄致强.河豚药用研究概况[J].药学通报,1984, 19(4): 40. [4] 靳艳卿,段世明,王钧,等.侧脑室注射TTX和藜芦定对大鼠异氟醚MAC的影响[J].中华麻醉, 2000, 20(5):
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适应性进化
通过克隆调控豹纹东方骨骼肌 Na v 1.4 通道表达的 cDNA，发现 Nav1.4通道区域Ⅰ401位点处存在一个不饱和氨基 酸，即天冬酰胺。通过基因工程把不饱和氨基酸移植到对河豚 毒素敏感的小鼠骨骼肌 Na v 1.4 通道处，移植的不饱和氨 基酸的折叠程度越高，小鼠抵抗河豚毒素的能力越强。当不饱 和氨基酸的折叠程度大于取代位点氨基酸折叠程度的2500倍时 IC50(50%Na+通道发生阻断时河豚毒素的浓度)提高至47µmol/L。 河豚对河豚毒素具有免疫力是基因变异的结果，更是适者生存、 长期自然选择的结果。河豚对河豚毒素的适应性进化为河豚提 供了更大的生存空间，也为人类研制河豚毒素中毒后的解毒药 品提供了依据。
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适应性进化
在对河豚毒素没有免疫力的生物体内，钠通道的 α-亚 基上存在河豚毒素的受体，河豚毒素与 α-亚基门孔附近的氨 基酸残基结合，阻止钠离子进入细胞内，引起河豚毒素中毒。 而河豚体内细胞的构造与其他生物不同，河豚体内还存在可以 和河豚毒素结合的蛋白质，从而使河豚对体内的河豚毒素具有 免疫力。比较红鳍东方鲀、黑青斑东方鲀 和斑马鱼的基因序 列图谱，发现红鳍东方鲀和黑青斑东方鲀骨骼肌的 Nav1.4通 道发生了变异，正是这种变异使河豚具有抵抗河豚毒素的能力。 红鳍东方鲀和豹纹东方鲀的变异类似，都是在 Na v 1.4 通 道的 401 位点上发生了取代，取代为一个折叠程度更高的不 饱和氨基酸，河豚的这些氨基酸是不与河豚毒素结合的，从而 也就不能对河豚的钠通道造成影响。
河豚的毒素主要在哪里
三、河豚毒素的功效
所谓的河豚毒素，是一种能麻痹神经的剧毒，通常只需氰化钾五百分之一就可置人于死地的剧毒，中毒的人会因神经麻痹而窒息而死，其中毒素直接进入血液中毒死亡速度最快。但是这种毒素却有着很高的医用价值：
1、用作镇痛剂、麻醉剂，对于神经痛、肌肉和关节创伤产生的疼痛，对晚期癌痛有显著镇痛作用，且不成臆。用于局部麻痹要比一般局部麻经强上万倍，比普鲁卡因强16万倍，比狄布卡因(DIBUCCAINE)强1万倍
文章导读
河豚是有毒的，这是众所周知的，但同样还是有人会吃河豚，因为这些人懂得河豚的毒素在哪里，在吃之前就会把毒素去掉，对绝大部分人来说这是很陌生的知识，接下来为大家普及这些知识。
一、河豚毒素在哪
几乎所有种类的河豚都含河豚毒素（TTX），它是一种神经毒素，人食入豚毒0.5mg-3mg就能致死.毒素耐热，100℃8小时都不被破坏，120℃1小时才能破坏，盐腌、日晒亦均不能破坏毒素。毒素主要存在于河豚的性腺、肝脏、脾脏、眼睛、皮肤、血液等部位，卵巢和肝脏有剧毒，其次为肾脏、血液、眼睛、鳃和皮肤，精巢和肉多为弱毒或无毒。在熟制河豚时，一定要严格细心地除去河豚的内脏、眼睛，剔去鱼腮，剥去鱼皮，去净筋血，用清水毒素，tetrodotoxin，简称TTX，是一种能麻痹神经的剧毒，通常只需氰化钾五百分之一就可置人于死地的剧毒，中毒的人会因神经麻痹而窒息而死，其中毒素直接进入血液中毒死亡速度最快。但是这种毒素却有着很高的医用价值：
1、用作镇痛剂、麻醉剂，对于神经痛、肌肉和关节创伤产生的疼痛，对晚期癌痛有显著镇痛作用，且不成臆。用于局部麻痹要比一般局部麻经强上万倍，比普鲁卡因强16万倍，比狄布卡因(DIBUCCAINE)强1万倍.
[管理]河豚毒素
![[管理]河豚毒素](https://img.taocdn.com/s3/m/df50c52dcf84b9d528ea7aab.png)
[管理]河豚毒素河豚毒素前言河鲀毒素(tetrodotoxin,TTX)是鲀鱼类(俗称河豚鱼)及其它生物体内含有的一种生物碱。
其分子式为C11H17O8N3，分子量为319。
该毒素经腹腔注射对小鼠的LD50为8μg/kg。
曾一度被认为是自然界中毒性最强的非蛋白类毒素。
河豚毒素对肠道有局部刺激作用，吸收后迅速作用于神经末梢和神经中枢，阻碍神经传导，从而引起神经麻痹而致死亡。
河鲀毒素对热稳定，盐腌或日晒均不能使其破坏，只有在高温加热30min以上或在碱性条件下才能被分解。
关键字河豚毒素致死毒性一河豚毒素的分布人们通常所指的河鲀(河豚)(puffer fish)，为鲀科鱼类。
中国的鲀科鱼类共有54种，其中东方鲀属22种。
根据伍汉霖等调查，中国共有35种河鲀具有不同程度的河鲀毒性，其中，在中国南海分布的有24种，在中国东海包括台湾沿海分布的有31种，在中国黄海分布的有14种，在中国渤海分布的有10种。
多数种类生活于淡水中,以热带和亚热带为最多.大约80种河豚鱼已知含有或怀疑含有河豚毒素。
在大多数有毒的河豚鱼身体中，毒素的浓度由高到低依次是卵巢、鱼巢、肝脏、肾脏、眼睛和皮肤，肌肉和血液中较少。
由于鱼的肌肉部分河豚毒素的含量很低，所以，中毒大多数是由于可食部受到卵巢或肝脏的污染，或是直接进食了这些内脏器官引起的。
河豚鱼的有毒主要存在于雌性河豚卵巢中，而且含量随着季节变化而有不同。
其含量的多少因鱼的种类及季节而有差异，一般在卵巢孕育阶段，即春夏季毒性最强。
在冬季。
毒素的浓度最高，有趣的是河豚鱼风味最佳也是在这个时候。
二、河豚毒素的毒性河豚毒素一种存在于河豚、蝾螈、斑足蟾等动物中的海洋毒素。
毒素主要存在于河豚的性腺、肝脏、脾脏、眼睛、皮肤、血液等部位。
在碱性溶液中易分解，在低的pH值溶液中也不稳定。
河豚毒素是强烈的神经毒素，很低浓度的河豚毒素就能选择性地抑制钠离子通过神经细胞膜。
河豚毒素还有其他药理作用，是神经生理学和肌肉生理学研究的有用工具。
河豚毒素简介
河豚毒素河豚毒素（tetrodotoxin, TTX）是一种毒性很强、相对分子质量小的非蛋白毒素，最初从豚科鱼中发现，故被命名为河豚毒素。
TTX为典型的Na+通道阻断剂，中毒者往往肢体麻木、瘫痪、甚至死亡；但另一方面，TTX具有镇痛、镇静、降压等功效，在临床上的应用十分广泛。
1.河豚毒素的结构与性质河豚毒素的化学研究始于1909 年, 1964 年以后由Woodward 测定了TTX 的结构, 1972 年Kishi 等采用化学方法成功合成了河豚毒素。
河豚毒素分子式为C11H17N3O8, 分子量为319.27。
分子主要由3 个氮原子组成, 它们与氢氧原子形成特殊的结构。
其结构特征如图1, 含有1 个碳环, 1 个胍基, 6 个羟基, 在C—5 和C—10位有一个半醛糖内酯连接着分开的环。
有专家将其称为“自然界最奇特的分子之一”, 也是世界上最致命的毒药之一。
1 g 河豚毒素的毒性是1 g 氰化物的1 万倍。
TTX 粗制品为棕黄色粉末, 纯品为无色晶体, 呈针状或菱形, 无臭, 无味, 易吸湿潮解, 不溶于无水乙醇、乙醚、苯等有机溶剂, 微溶于水, 极易溶于稀酸水溶液。
TTX 在溶液中存在TTX、半缩醛型TTX、内酯型TTX动态平衡的三种结构。
TTX 理化性质比较稳定, 在中性和酸性条件下对热稳定, 240 ℃开始碳化, 但300 ℃以上也不分解。
在碱水溶液中易分解, 在5%氢氧化钾溶液中于80 ℃～100 ℃可分解成黄色结晶2- 氨基- 6- 羟甲基- 8- 羟基- 喹唑啉, 这也是TTX 化学检测法的理论基础。
2. 河豚毒素中毒机理2.1 中毒临床表现河豚鱼中毒发病急速而剧烈，潜伏期为0.5～3h(一般10～45min)。
初期有颜面潮红、头痛，继而出现剧烈恶习、呕吐、腹痛、腹泻等肠胃道症状。
然后出现感觉神经麻痹症状，口唇、舌、指端麻木和刺痛。
感觉减退。
继而出现运动神经麻痹症状，手、臂肌肉无力，抬手困难，腿部无力以致运动失调，步态蹒跚，身体摇摆；舌头发硬、语言不清，甚至全身麻痹、瘫痪。
生活中的分子---河豚毒素（TTX）：剧毒却不能阻挡食客的物质
生活中的分子---河豚毒素（TTX）：剧毒却不能阻挡食客的物质生活中的分子河豚毒素（TTX）：剧毒却不能阻挡食客的物质前言2020年的春节少了过去的喜庆祥和，举国上下都被一种新型冠状病毒引发的肺炎牢牢支配。
病例数与日俱增、病毒溯源困难重重、疫苗和特效药物的研发更是任重道远，这些无不透露出人类在面临突发疫情时深深的无力感；普通百姓“谈虎色变，人人自危”，在铺天盖地并且真假难辨的信息面前身心俱疲。
导致肺炎肆虐的罪魁祸首新型冠状病毒近日被科学家证实极有可能来自野生动物，因人类食用野生动物，病毒实现了物种跨越从而导致疫情爆发。
回顾历史，在“吃”上栽跟头的绝非个例，河豚正是其中的典型代表，它身含致命毒素，丧命于河豚肉的人不在少数，时至今日却依然不能阻挡食客们的热情······一、历史悠久的河豚文化大文豪苏轼对美食颇有研究，除了人尽皆知的东坡肉，苏学士还格外钟情于河豚肉，有诗为证：“蒌蒿满地芦芽短，正是河豚欲上时”。
“拼死吃河豚”是中国民间广为流传的说法，相传过去吃河豚时餐桌旁一定要准备好稀释的粪便，一旦出现中毒症状便立即催吐。
哪怕采取如此“硬核”的方式都要吃河豚，背后一定有着不同寻常的原因。
河豚营养丰富，富含蛋白质、维生素、氨基酸、不饱和脂肪酸和微量元素，它口味香醇，具有健脾、利尿、镇痛等功效，在江浙沪一带更是与鲥鱼和刀鱼并称“长江三鲜”。
然而河豚的血液和内脏中含有致命毒素，若烹饪不当食用后有生命危险。
图 1 加工后的河豚肉（图片来源于网络）日本拥有悠久的“食鱼文化”，其中他们对河豚的喜爱达到痴迷程度。
然而，日本出现正规经营的河豚餐馆其实是近代以后的事情。
江户时代（公元1603-1868年）为避免食用河豚出现意外事件，日本曾颁布禁令不得食用河豚，直到明治维新后禁令才逐渐解除。
虽然日本政府制定了严格的河豚餐饮制度，也对从业人员的资质进行严格审核控制，但河豚中毒事件并未完全杜绝。
河豚毒素免疫亲和柱的说明书
河豚毒素（TTX）免疫亲和柱说明书产品编号：MC01B1、用途：免疫亲和柱可选择性吸附样品液中的河豚毒素，从而对样品起到非常针对性的纯化作用，过柱净化后的样品液可直接用于HPLC分析。
亲和柱与HPLC配合使用可达到快速测定的目的，以改善信噪比，提高检测方法的准确度。
2、概述：河豚毒素(Tetrodotoxin,TTX)是豚鱼类（俗称河豚鱼）及其它生物体内含有的一种生物碱（氨基全氢喹唑啉型化合物），是自然界中所发现的毒性最大的神经毒素之一；其毒性比剧毒的氰化钠还要高1250多倍，0.5mg 即可致人于死命。
3、原理：测定的基础是抗原抗体反应，抗体连接在柱体内，样品经过提取、稀释，缓慢的通过河豚毒素免疫亲和柱，在免疫亲和柱内河豚毒素与抗体结合，之后洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的其他无关物质。
用洗脱液洗脱河豚毒素，然后注入到分析仪器中用于检测。
4、包装组成：盒中包括各种规格的河豚毒素免疫亲和柱及1份说明书。
5、需要的材料但盒中不提供：5.1设备----HPLC----气控操作架----空气泵----天平----涡旋仪----离心机----25mL/50mL量筒----离心管----1mL移液器----刻度试管----针头滤器----注射器----样品瓶----转接头（配3mL免疫亲和柱使用）5.2 试剂----甲醇(样品处理用分析纯，分析用色谱纯)----乙酸（分析纯）----NaCl（分析纯）----十二水合磷酸氢二钠（分析纯）----二水合磷酸二氢钠（分析纯）----蒸馏水或去离子水。
6、注意事项：----使用前，免疫亲和柱需回至室温（22～25℃）；----亲和柱2～8℃储存，不得冻存；----不要使用过了有效日期的免疫亲和柱；----取样量：根据需要可以适当增加或减少取样量，注意提取液量要相应改变；----柱容量：柱容量是1000ng，当样本中待检毒素的含量除以稀释倍数高于柱容量时，需要适当降低上样液体积，重新检测。
食品安全国家标准 水产品中河豚毒素的测定
食品安全国家标准水产品中河豚毒素的测定1 范围本标准规定了水产品中河豚毒素的测定方法。
本标准第一法适用于鲜河豚鱼的肌肉、肝脏、皮肤和性腺组织中河豚毒素（tetrodotoxin，简写为TTX）的测定。
第二法适用于河豚鱼、织纹螺、虾、牡蛎、花蛤及鱿鱼中河豚毒素的测定。
第三法适用于鲜河豚鱼中TTX的测定。
第四法适用于河豚鱼中肌肉、肝脏、皮肤中河豚毒素的测定。
第一法液相色谱-串联质谱法2 原理试样经1%乙酸甲醇提取，免疫亲和柱净化，液相色谱-串联质谱法测定，外标法定量。
3 试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
3.1 甲醇（CH3OH）色谱纯。
3.2 乙腈（CH3CN）色谱纯。
3.3 甲酸（HCOOH）色谱纯。
3.4 乙酸（CH3COOH）优级纯。
3.5 乙酸铵（CH3COONH4）色谱纯。
3.6 磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）。
3.7 磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）。
3.8 氯化钠（NaCl）。
3.9 氢氧化钠（NaOH）。
3.101%乙酸-甲醇溶液：量取10 mL乙酸（3.4），用甲醇定容至1000 mL。
3.112%乙酸-甲醇溶液：量取10 mL乙酸（3.4），用甲醇定容至500 mL。
3.120.1%甲酸溶液：量取0.1 mL甲酸（3.3），用水稀释并定容至100 mL。
3.130.1%甲酸溶液（含5 mmol/L乙酸铵）：取0.5 mL甲酸（3.3）和0.19 g乙酸铵（3.5），用水溶解并定容至500 mL。
3.14 0.1%甲酸-乙腈溶液（1：1，体积比）：取50 mL 0.1%甲酸溶液（3.12）加到50 mL乙腈中，混合均匀。
3.15 磷酸盐缓冲溶液（PBS溶液，0.05 mol/L）：称取磷酸氢二钠6.45 g（3.6），磷酸二氢钠1.09g （3.7），氯化钠4.25 g（3.8），用超纯水溶解并定容至500 mL。
河豚毒素
河豚毒素百科名片海洋生物毒素的化学结构类型十分特殊,且各类毒素的化学结构差异极大,其中河豚毒素是近年来研究进展中最突出一种海洋毒素。
它是一种化学结构独特、毒性强烈并有广泛药理作用的一种天然毒素。
河豚毒素是一种能麻痹神经的剧毒，通常只需氰化钾五百分之一就可置人于死地的剧毒，中毒的人会因神经麻痹而窒息而死，其中，毒素直接进入血液中毒死亡速度最快。
目录编辑本段河豚的种类很多。
体长的河豚毒性相对高些，其组织器官的毒性强弱也有差异。
河豚毒素从大到小依次排列的顺序为：卵巢、肝脏、脾脏、血筋、鳃、皮、精巢。
冬春季节是河豚的产卵季节。
此时，河豚的河豚肉味最鲜美，但是毒素也最高。
随着科学的进步，令人恐惧的河豚毒素已步入了药学殿堂，并且在治疗人类疾病方面发挥着越来越重要的作用。
河豚毒素在医疗上可以用于治疗癌症。
河豚可以用于镇痛。
对癌症疼痛、外科手术后的疼痛、内科胃溃疡引起的疼痛，河豚毒素制剂均有良好的止痛作用。
使用河豚素的好处是用量极少（只需3微克），止痛时间长，又没有成瘾性。
特别是穴位注射，作用快、效果明显，可以作为成瘾性镇痛药吗啡和杜冷丁的良好替代品。
河豚毒素还可以止喘、镇痉、止痒。
河豚毒素可以治疗哮喘、百日咳。
对治疗胃肠道痉挛和破伤风痉挛有特效。
河豚毒素对细菌有强烈杀伤作用。
从河豚精巢提取的毒素，对痢疾杆菌、伤寒杆菌、葡萄球菌、链球菌、霍乱弧菌均有抑制作用，而且可以防治流感。
目前，在国际市场上，河豚毒素结晶每克已经高达17万美元。
现在，河豚毒素已经可以人工合成了。
最近，加拿大科学家却利用河豚毒素研制出一种能止痛的新型药物。
这种新型特效止痛药能够有效地缓解癌症病人的疼痛。
目前这个课题已经做完一期和二期的临床实验。
在临床实验中医生每天给病人注射两次这种药剂，一次几微克，连续注射4天。
当用药进入第3天后，患者的疼痛开始减轻。
结果，有将近70％的病人的病痛得到缓解。
研究人员还发现，最后一次注射停止后，止痛效果仍可延续。
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河豚毒素- 性能特点
河豚毒素tetrodotoxin，简称TTX，是一种存在于河豚、蝾螈、斑足蟾等动物中的海洋毒素。
毒素主要存在于河豚的性腺、肝脏、脾脏、眼睛、皮肤、血液等部位。
在碱性溶液中易分解，在低的pH值溶液中也不稳定。
河豚毒素是强烈的神经毒素，很低浓度的河豚毒素就能选择性地抑制钠离子通过神经细胞膜。
河豚毒素还有其他药理作用，是神经生理学和肌肉生理学研究的有用工具。
河豚毒素(TTX)系小分子量非蛋白质神经毒素，河豚毒中毒后，潜伏期短、病死率高，吸收后迅速作用于末梢神经和中枢神经系统，使神经传导障碍，首先感觉神经麻痹，后运动神经麻痹，严重的脑干麻痹导致呼吸循环衰竭。
河豚毒素- 检测方法
随着渔业的发展，河豚鱼中毒事件的屡次出现，以及当前可能被恐怖分子利用的潜在威胁，使TTX的检测越来越为人们所重视，并具有重要的现实意义，检测方法可分为生物测定法、理化分析法和免疫化学法、生物测定法、高效液相色谱紫外检测法（HPLC-UV）、高效液相色谱荧光检测法（HPLCFLD）、高效毛细管电泳法（HPCE）、液质联用、气质联用等方法。
生物法有酶联免疫（ELISA）法和小鼠法等。
生物测定法
小鼠生物实验法、竞争置换法、组织培养生物实验法、动电位法。
理化分析法
荧光法、紫外分光光度法、薄层色谱法及其联用技术、电泳法及其联用技术、气相色谱法及其联用技术、高效液相色谱法及其联用技术。
免疫化学检测法
TTX的检测方法很多，每种方法都有其优缺点，可根据实验条件及要求选择恰当的检测方法。
TTX作为钠离子通道阻断剂，虽然毒性强，但在临床中也可作为高效镇痛剂，并且对某些肿瘤有抑制作用，在神经生物学、药理学、肌肉生理学等方面被广泛用于工具药。
随着TTX检测手段的不断完善，TTX的研究将会有更大的发展，在食品检验、中毒诊断、治疗及国家安全等方面发挥更大的作用。
ELISA法
ELISA法具有特异性好、灵敏度高，可定量检测，而且有采样量极小等特点，多用于河豚毒素的痕量检测；小鼠法是利用河豚毒素的毒性特点进行的小鼠毒性检测的方法，方法简便，但定量不准确且重复性差、目标性差，已少用。
HPLCUV法
HPLCUV法是常用的检测手段，既可以检测含量，又可以作为有关物质的考察，河豚毒素没有紫外光谱特征吸收，采用末端吸收进行检测；国外多采用柱后衍生化荧光检测的方法进行含量测定，河豚毒素本身没有荧光，氢氧化钠破坏后产生降解产物C9碱具有荧光；荧光检测的灵敏度比紫外检测的灵敏度高，但在含量测定检测结果上两种方法不存在显著性差异。