酵母超糖基化
第三章基因工程常用受体细胞
是一种甲基营养菌，能在相 对较为廉价的甲醇培养基中 生长。
优点
除具有一般酵母所具有的特点 外，还有以下几个 优点： 1、具有目前最强，调控机理最严格的启动子之一 －乙醇氧化酶AOX1基因启动子,外源蛋白表达量 高（一般 500-4000mg/L，最高为破伤风毒素C达到 12g/l） 。 2、表达质粒能在基因组的特定位点稳定整合。 3、蛋白产物糖基化修饰作用大多数情况下接近哺乳动物细
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris)） 乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis） 多型汉逊酵母（Hansenula polymorpha）
一、酿酒酵母
是第一个用于基因药物表达的酵母菌， 遗传背景已相当清楚：有17条染色体， 1996年完成其全基因组测序，基因组为 12068 kb，阅读开放开架5887个，编码 约6000个基因，比单细胞的原核生物和 古细菌大一个数量级。 受体细胞举例：酿酒酵母GRF18
（二）缺点
1、不能识别剪切内含子，不能表达基因组DNA， 只能表达cDNA； 2、缺乏真核生物的蛋白质加工修饰系统，不能进 行蛋白酶解、糖基化、磷酸化、乙酰化、硫酸化、 酰胺化等修饰作用；
蛋白酶解作用：从蛋白前体中切去一段氨基酸序列，从 而获得功能性分子 糖基化意义： 赋予蛋白独特的结合性并增强稳定性
菌体内 稍复杂 简单
不大
哺乳动物
需注意 致癌
第三节、常用原核表达细胞
大肠杆菌 枯草芽孢杆菌 短小芽孢杆菌
一、大肠杆菌表达体系
（一）生物学特性 革兰氏阴性杆菌 大小2～4um×0.4～ 0.1um； 无芽孢； 一般无荚膜(capsule) 裂殖(Fission)分裂， 37℃17分钟繁殖一代。
酵母表达系统
4、甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策
载体稳定性 基因剂量 整合位点 甲醇利用表型 mRNA5’端 AT含量分泌信号 表达产物稳定性
1）载体稳定性
同拷贝数时，整合型的比自主复制型的表达水平高 YRp型载体的稳定化：
选择—非选择培养交替数十代可得稳定的整合子 ，但费时，整合位点不确定。 采用YIp型载体: 更易实现整合、整合位点清楚
2）基因剂量
外源基因表达存在基因剂量效应 筛选多拷贝整合子
载体引入G418/Zeocin抗性标记，整合子拷贝数 与抗性成正相关，采用高G418/Zeocin抗性转化子。 体外串联多个表达盒，直接获多拷贝整合子 采用YRp型载体稳定化技术获高拷贝整合子 构建高拷贝整合型表达载体
3）整合位点
外源基因表达盒整合于AOX/MOX或标记基因处，均 可高效表达 毕赤酵母中个别情况整合于His4位点的比AOX1位点 的低
2）分泌表达产物过糖基化
（二） 甲醇酵母表达系统
甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子 甲醇酵母表达系统的优缺点 甲醇酵母表达系统操作原理 甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策 甲醇酵母表达系统的应用
1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子
甲醇酵母（methylotrophic yeast) 指可利用甲醇作单一碳源的一类酵母。 毕赤酵母（Pichia pastoris) 汉森酵母（Hansenula ploymorpha) 假丝酵母（Candia boidinii)
组成的、复杂分支结构的现象。增加了免疫原性、对活 性与药代稳定性均有影响。 *糖链组成
O型糖链仅由甘露糖组成、而哺乳细胞的还含唾液酸 基团
4、酿酒酵母表达系统的缺陷
1）表达水平普遍不高 A、表达载体传代不稳定（YEp、YRp） B、所采用的强启动子调控不严谨 C、不能利用简单的无机培养基进行高密度发酵
酵母外泌FAQ
蛋白互作技术是植物保护、细胞生理等领域的关键实验技术，重组蛋白的质量对实验结果具有重要影响。
高质量的重组蛋白必然是“拟真”的，靶蛋白的空间结构（如二硫键成键）及蛋白修饰情况（乙酰化、磷酸化、糖基化）要尽量与天然状态保持一致，才能提供足够高的亲和力与候选蛋白发生相互作用。
由于自然条件下的靶蛋白修饰情况往往未见报道，追求绝对“拟真”并不现实，在蛋白互作实验中保证重组蛋白正确折叠即可。
下面对重组蛋白表达的一些常见问题进行梳理。
Q1：毕赤酵母表达系统最“直观”的优势是什么？毕赤酵母的分泌表达成功率约为80%左右，远高于大肠杆菌（低于10%）。
另一方面，毕赤酵母发酵液上清的杂蛋白较少（见图1A），因此亲和层析纯化的成功率极高（超过95%，不会出现大肠杆菌中“能表达但不能挂柱”的情况），易于获得纯化蛋白进行下游实验。
最后，未经优化的酵母表达产量较大可能低于大肠杆菌，但通过使用高效表达元件、提高目的基因拷贝数、共表达分子伴侣后，重组蛋白的产量可比优化前提高3-8倍。
通过使用高密度发酵技术，又可在此基础上继续提高8-10倍。
最终将重组蛋白产量提高至理想水平。
图1 多拷贝策略对犬α干扰素产量的影响(A) 摇瓶发酵上清的SDS-PAGE检测。
泳道M，蛋白质分子量标记；泳道1-5：1、2、4、6、8拷贝酵母转化子发酵液上清。
4泳道对应的摇瓶表达量可达到350 mg/L左右。
(B) 6拷贝酵母转化子的高密度发酵。
红色圆点：目的蛋白含量；蓝色方块：菌体湿重。
重组蛋白产量即可达到1.26 g/L水平Q2：蛋白可溶是否等同于其具有正常功能？传统观念认为“蛋白可溶即折叠正确”，这是一种略显片面的经验性判断，尤其不适用于大肠杆菌生产的重组蛋白。
如图2所示，天然蛋白会将疏水基团包裹在蛋白内部，使整个蛋白处于亲水状态，整体表现为可溶；错误折叠的重组蛋白即便未形成正确的空间构象，仍有可能借助自身某些高亲水性的基团或亚基阻止蛋白聚集、蛋白沉淀的发生，从而表现为可溶。
酵母表达系统
C、野生型GAL4表达水平低，产物活性可被GLAL80产物完全抑制，半乳糖诱导效果差
2）半乳糖激酶启动子（GAL1）
半乳糖诱导、葡萄糖抑制
GAL10 Promoter
GAL80
GAL4
UAS
GAL1
GAL7
GAL10
A、 将GAL4的启动子换成GAL10的诱导型强启动子 B、半乳糖诱导GAL4高表达，不受GAL80产物抑制，激活GAL1等高效转录
性结合因子：MF-α
酸性磷酸酯酶：PHO5
蔗糖酶：SUC2 杀手毒素因子：KIL
酿酒酵母信号肽特点
*保守性低，大多异源宿主系统的信号肽不能互用
*信号肽结构：
Met 信号肽剪切位点
正电荷区 疏水区
极性区
目的蛋白
MF-α信号肽
*分泌效率高
*在酵母统具有通用性
*88个残基组成
Met KEX2 DAP DAP
AOX1与AOX2 *毕赤酵母和假丝酵母基因组存在二个AOX基因 AOX1、AOX2 *AOX1与AOX2基因97%同源 *AOX1 占主导地位，负责AOX 99%以上活性
1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子
甲醇氧化酶启动子 A、目前已发现的、最强的真核启动子 B、严谨调控型启动子 AOX1：葡萄糖和甘油脱阻遏、甲醇诱导 MOX：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇诱导
8）表达产物稳定性
分泌表达时，胞外蛋白酶是要影响因素
降低培养基pH值：蛋白酶在酸性条件下活性较低
培养基中添加蛋白水解产物：竞争性抑制
采用蛋白酶缺陷宿主株：如P.pastoris SMD1168
3、甲醇酵母表达系统操作原理
宿主株与标记基因 甲醇酵母系统的整合事件 胞内表达与分泌表达
为什么酵母不表达目的蛋白？
为什么酵母不表达目的蛋白？（因为百度文库下载要积分，所以把自己在生物论坛写的帖子上传换点积分）很多朋友问这样一个问题：为什么xx酵母不表达？他们自己也很纳闷，重组酵母PCR检测也证明目的基因重组了，但是诱导之后就是在表达上清中检测不到目的蛋白，仔细研究操作手册后仍然不知道原因。
本人，根据自己的经验，采用倒推的方法，按实验过程从后向前分析，供大家参考：1、诱导之后表达上清中检测不到目的蛋白：分析1：检测的方法是否有问题，要考虑是不是蛋白表达量低而没有检测到？如果是蛋白表达低，可以选择浓缩蛋白，具体的方法很多，有TCA、丙酮、浓缩柱等等方法，之前在本版已经发过帖，在此不赘述。
2、如果蛋白浓缩N倍之后仍然检测不到，那基本可以确证蛋白并不在上清中。
那么蛋白到哪里去了，考虑是否没有分泌出来，而是在胞内，那就需要通过裂解酵母来检测胞内蛋白，具体的方法很多，在此也不赘述，曾整理过相关破碎的帖子。
3、如果胞内也没有目的蛋白表达，那么基本可以确定蛋白并没有表达。
4、为什么没有表达呢？倒推回来就是诱导的过程了，诱导体系是什么？甲醇浓度是多少？培养问题是多少，转速是多少？这些都要注意。
甲醇一般是0.5%-1.0%，本人用的是0.5%，也有很多人也用1.0%，曾见过一个帖子，说超过1.5%反而会抑制表达，没有验证过，供大家参考。
培养问题28-30度比较合适，转速250rpm比较合适，诱导体系没有固定的体系，说明书上推荐的是BMGY到OD600 2~6，换到BMMY中OD600为1左右。
5、如果诱导的过程也没有问题，那问题就复杂了，特别是重组酵母PCR检测证明目的基因确实已经发生了重组。
这个时候是最郁闷的了，但是郁闷怎么办，还是要找原因，在此我给的建议是先做RT-PCR证明mRNA水平的情况，也就是说有没有转录。
如果转录了，后续的操作也没有问题（本帖的1、2、3、4项），那么只有重新设计实验，比如换酵母株，有文章上说：用GS115表达不出蛋白，换KM71H后，大部分克隆能表达。
第七章 酵母基因工程
Dividing Saccharomyces cerevisiae (baker’s yeast) cells
一. 酵母克隆载体
① 能在E.coli中克隆和扩增。 Ori ②有大肠杆菌的选择标记 Ampr、Tetr。 ③ 有酵母的选择标记 Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+;
如pYF92:
pBR322 2m 酵母his 3+
2m质粒： 酿酒酵母的内源质粒，长度是2m 。含有自主 复制起始区ori和STB序列（使质粒在供体中维 持稳定）。
特点：
①很高的转化活性（103-105转化子/微克 DNA）. ②拷贝数多（25-100分子/细胞）。 ③比YRp稳定。
YEp24
亮氨酸lue2—β-异丙基苹果酸脱 氢酶
• 该酶是把丙酮酸转化成亮氨酸的代谢酶之 一．只要使用亮氨酸lue2突变的营养缺陷型 酵母作受体，载体上带有亮氨酸lue2基因就 能在不含亮氨酸的培养基上实现转化克隆 的筛选（书１７０页图）．
四. 酵母表达系统的特点
（1）优点 ①对其遗传学和生理学的研究比较深入。 ②小量培养和大规模反应器中都能生长。 ③已经分离出很强的启动子。 ④有翻译后的加工。 ⑤本身自然分泌很少，便于胞外蛋白的纯 化。 ⑥安全性高（FDA确认的安全生物），不 需要宿主的安全性检验。
④不稳定，容易丢失。
（3）着丝粒质粒(YCp) 在YRp质粒中插入酵母染色体的着丝粒 区。 YRp质粒 酵母着丝粒 特点： ①行为像染色体，能稳定遗传。 ②单拷贝存在。
③不易从细胞中提取。
（4）附加体型载体(YEp) 由大肠杆菌质粒、2m质粒及酵母染色体 DNA选择标记构成。 大肠杆菌质粒 2m质粒 酵母选择标记
第十五章：酵母菌基因工程选编
③易进行载体DNA的导入。DNA转化技 术的不断发展优化，多数酵母菌可 以取得较高的转化率；
④培养条件简单，容易进行高密度 发酵；
⑤能将外源基因表达产物分泌到培 养基中；
⑥有类似高等真核生物的蛋白质翻 译后的修饰功能。
2.缺陷在于：
①表达效率相对低； ②酵母常有密码子偏爱性，真核基
因在其中表达时需要人工修正。
2.含有ARS的YRp和YEp质粒及其构建
①ARS为酵母菌中的自主复制序列，大 小在0.8-1.5Kb,染色体上每30-40bp 就有一个ARS元件。
②由染色体ARS构成的质粒称为YRp，而 由2μ质粒构建的杂合质粒为YEp。
③上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数 最高可达200个，但是经过几代培养 后，质粒丢失率达50%-70%，主要由 于分配不均匀所致。
三．抑制超糖基化作用的突变宿主菌
许多真核生物的蛋白质在其天门冬 酰胺侧链上接有寡糖基团，常常影 响蛋白质的生物活性。整个糖单位 由糖基核心和外侧糖链两部分组成。
酵母菌普遍拥有完整的糖基化系统，酿 酒酵母细胞内的天门冬酰胺侧链糖基修 饰和加工系统对来自高等动物和人的异 源蛋白活性表达是极为有利的，但野生 型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很 难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖基 化缺陷菌株非常重要。
②YAC载体的装载量建
①YIP 载体由大肠杆菌质粒和酵母的 DNA 片段组成，可与受体或宿主的染色体 DNA 同源重组，整合进入宿主染色体中，酵母 片段只提供选择性标志，没有复制起点。
②转化率低（只有1-10转化子/微克DNA）， 但转化子遗传性稳定，多用于遗传分析。
一．广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
目前已广泛用于外源基因表达的研究的酵母菌包括：
基因工程：第四章-酵母基因工程
UBC4-UBC5双突变型：
UBC4-UBC5双突变型能大幅度削弱泛
素介导的蛋白降解。
7个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白 降解作用同样有效。
6、内源性蛋白酶缺陷型的突变宿主菌
酿酒酵母具有20多种蛋白酶 空泡蛋白酶基因PEP4野生型和
pep4-3突变株
B-半乳糖苷酶活性明显升高
（三） 酵母菌的载体系统
酵母基因工程
酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征 酵母菌的宿主系统 酵母菌的载体系统 酵母菌的转化系统 酵母菌的表达系统 利用重组酵母生产乙肝疫苗
1974 Clarck-Walker和Miklos发现在多数酿酒酵母 中存在质粒。
1978 Hinnen将来自一株酿酒酵母的leu2基因导入 另一株酿酒酵母，弥补了后者leu2的缺陷， 标志着酵母表达系统建立。
酵母菌有4个泛素编码基因：
UBI1 编码泛素-羧基延伸蛋白52 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI2 编码泛素-羧基延伸蛋白52 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI3 编码泛素-羧基延伸蛋白76 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI4 编码泛素五聚体
对数生长期关闭 稳定期表达
酵母菌有7个泛素连接酶基因：
UBC1、UBC2、UBC3、UBC4、UBC5、UBC6、UBC7
酵母菌表达外源基因的优势： 全基因组测序，基因表达调控机理清楚，遗传 操作简便。 具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。 能将外源基因表达产物分泌至培养基中。 大规模发酵工艺简单、成本低廉。
不含特异性病毒、不产毒素，被美国FDA认定为 安全的基因工程受体系统。
酵母菌表达外源基因的缺点：
表达产物的糖基化位点和结构特点 与高等真核生物有差距。
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酵母超糖基化
酵母超糖基化是一种生物化学现象，主要发生在酿酒酵母中。
在酿酒酵母中，Asn（天冬酰胺）上的寡糖核心在高尔基体中通过甘露糖的不断加入而得以延伸。
由于加入甘露糖的数目不定，所以由酿酒酵母表达的外源蛋白或内源蛋白的糖链长度不等。
典型的酿酒酵母糖蛋白中每个糖链的甘露糖数目为50~150，这种现象即为超糖基化。
与酿酒酵母相比，毕赤酵母表达蛋白的糖链结构在超糖基化方面有所不同。
具体来说，毕赤酵母分泌蛋白核心糖单位以外的典型糖单位是ManGlcNAc2或Man9GlcNAc2，其糖链平均为8~14个甘露糖基，远低于酿酒酵母的50~150个。
此外，毕赤酵母还可以形成分支糖链，这也是与酿酒酵母的一个主要区别。
以上内容仅供参考，如需更专业的解释，可查阅相关生物化学领域的书籍或咨询相关领域的专家。