实验三 紫外线的诱变育种
紫外诱变技术实验报告
一、实验目的1. 掌握紫外诱变技术的原理和方法。
2. 了解紫外诱变在微生物育种中的应用。
3. 通过实验，筛选出具有较高产酶能力的突变菌株。
二、实验原理紫外诱变技术是利用紫外线照射微生物，使微生物DNA发生突变，从而获得具有优良性状的菌株。
紫外线照射能导致DNA分子中碱基对的改变、缺失或插入，进而影响基因的表达，产生新的遗传性状。
三、实验材料1. 菌种：产淀粉酶枯草芽孢杆菌。
2. 器材：紫外线照射装置、超净工作台、电磁力搅拌器、低速离心机、培养皿、涂布器、10mL离心管、（1、5、10mL）吸管、250mL三角瓶、恒温摇床、培养箱、直尺、棉签、橡皮手套、洗耳球。
3. 培养基和试剂：无菌水、75%酒精、0.5％碘液、碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水200mL、可溶性淀粉2g、牛肉膏1g。
四、实验方法1. 菌种活化：将产淀粉酶枯草芽孢杆菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃培养24小时，得到活化菌种。
2. 菌悬液制备：将活化菌种接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、180r/min 振荡培养3小时，制成菌悬液。
3. 紫外诱变：将菌悬液置于紫外照射装置下，距离20~30cm，照射时间分别为1、2、3分钟，设置对照组（未照射）。
4. 细菌复苏：将照射后的菌悬液涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，37℃培养24小时，观察菌落生长情况。
5. 初筛：挑选生长速度较快、菌落形态异常的菌落，进行进一步的淀粉酶活性测定。
6. 淀粉酶活性测定：将挑选的突变菌株接种于可溶性淀粉培养基中，37℃培养24小时，用碘液检测淀粉酶活性。
7. 验证与保存：对具有较高淀粉酶活性的突变菌株进行验证，并保存于甘油管中。
五、实验结果1. 紫外线照射时间对菌落生长的影响：照射1分钟时，菌落生长速度明显降低；照射2分钟时，菌落生长速度有所下降；照射3分钟时，菌落生长速度明显下降。
2. 淀粉酶活性测定结果：经过筛选，发现突变菌株A的淀粉酶活性最高，为对照组的1.5倍。
诱变育种流程及紫外诱变育种的详细步骤
诱变育种流程及紫外诱变育种的详细步骤-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII诱变育种的一般步骤：1.首先是天然菌种的选育：调查研究及查阅充分的资料↓设计实验方案↓确定采集样品的生态环境采样↓确定特定的增殖条件增殖培养确定特殊的选择培养基及可能的定性或半定量快速检出法平板分离↓原种斜面↓确定发酵培养基础条件筛选↓初筛（1株1瓶）↓复筛（1株3～5瓶）↓结合初步工艺条件摸索再复筛（1株3～5瓶）↓3～5株↓单株纯种分离生产性能试验→毒性试验菌种鉴定2.诱变菌种：出发菌株----菌种纯化(出发菌株性能测定)----制备斜面孢子----制备单孢子悬液(悬液进行活菌计数)----诱变剂处理(存活菌数的测定并计算存活率)----平板分离(测定变异率)----挑取变异菌落并移植至斜面上----初筛(初筛数据分析，生产性状的粗测)----斜面传代----复筛(复筛数据分析，精确测定生产性状)----变异菌株(菌株参数分析)----小型或中型投产试验----大型投产试验。
诱变育种应把握的主要原则有以下几点：1)选择简便有效的诱变剂。
在选用理化因素作诱变剂时，在同样效果下，应选用最简便的因素；在同样简便的条件下，应选用最高效的因素。
2)挑选优良的出发菌株。
最好采用生产上已发生自变的菌株，选用对诱变剂敏感的菌株，选取有利于进一步研究或应用性状的菌株。
4)处理单细胞或孢子悬液。
单细胞悬液应均匀而分散，孢子、芽孢等应稍加萌发。
5)选用合适的诱变剂量。
一般正变较多出现在低剂量中，负变较多地出现在高剂量中。
6)选用高效的筛选方法。
紫外线诱变育种：紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为253-265nm．灯与处理物的距离为30cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。
一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜。
被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个/ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个 /ml。
微生物菌种选育实验指导
《微生物菌种选育实验》是一门涉及食品理化分析、微生物学实验且由学生自行设计实验方案的综合性、设计性实验课程，集中三周时间开课。
一、实验目的通过本环节训练，加深对发酵工程上游技术中菌种筛选的认识；学会常规选种方法；掌握微生物诱变育种的方法；掌握常规工业微生物菌种保藏法；树立科学认真仔细的态度，培养科研协作精神。
二、实验内容实验一工业微生物菌种分离根据一定的生产目的如产酶、产酸、产酯等，建立不同的筛选模型，并从特定的样品如曲药、酸乳、土壤中筛选出高产适宜的菌株。
1、分离培养基的配制2、无菌器材的准备3、菌悬液的制备4、接种5、培养6、初步鉴定(1) 菌落形态(2) 个体形态7、斜面接种培养实验二工业微生物菌种复筛通过摇瓶培养对实验一所得的菌株的生产性能进行精确的定量测定。
1、发酵培养基的配制；2、目的菌株的摇瓶培养；3、发酵液的生理活性测定。
实验三微生物的诱变育种用紫外线对实验一所得的高产菌株进行诱变，并测定诱变后的菌株的生产能力。
1、单细胞(或单孢子) 悬液的制备；2、致死曲线的测定；3、诱变处理；4、初筛；5、复筛；6、菌种保藏。
三、实验要求1．学生自行设计具体实验方案，在教师指导下由学生自主完成实验。
2．实验结束后，要求学生完成一篇微型小论文。
论文的撰写应本着实事求是的原则，对所做实验过程和数据进行认真、严格的记录和处理，并进行独立分析，不得抄袭他人的数据。
四、考核办法1、考核内容：实验方案、实验态度、操作技能、实验报告等。
2、考核办法：按照实验方案、实验态度、操作技能、实验报告等内容综合考核学生，得到学生该门实验课程的成绩。
成绩考核采用优秀、良好、中等、及格、不及格五级记分制。
3、考核标准：以实际操作技能和分析解决问题的技能为主，实验考核内容各单项所占分数比例为实验方案20%、实验态度10%、操作技能40%、实验报告30%。
微生物菌种选育概述微生物的菌种对进行微生物工作来讲是非常重要的。
没有“种”无法进行微生物的科学研究；没有良种，不能进行发酵工业的生产。
紫外线诱变实例
(二) 操作步骤 1．将细菌培养液以3000r／min离心5min，倾去上清液，将菌体打散加入 无菌生理盐水再离心洗涤。 2．将菌悬液放入一巳灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散 菌体。将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内， 一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达108个／ml左右，作为待处理菌 悬液。 3．取2～4m1制备的菌液加到直径9cm培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子， 然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处。在正式照射前，应先开紫 外线10min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射10～50s。 操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。4．取未照射的 制备菌液和照射菌液各o.5ml进行稀释分离，计数活菌细胞数。 5．取照射菌液2ml于液体培养基中(300ml三角瓶内装30ml培养液)，120r ／min振荡培养4～6h。 6．取中间培养液稀释分离、培养。 7．挑取菌落进行筛一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为 2537A．灯与处理物的距离为15～30cm，照射时 间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我 们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡 率控制在70～80%为宜。
• 被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个／ml左 右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个／ml。 由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深， 约0.5～1.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工 进行搅拌，使照射均匀。 • 由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时 和照射后的处理应在红灯下进行。
紫外线诱变育种高产纤维素菌实验方案
紫外线诱变育种高产纤维素菌实验方案诱变方案：纤维素酶活力较高菌株→紫外线诱变→初筛→复筛→稳定性试验.实验目的：对有一定能力产纤维素酶的菌种进行紫外线诱变，诱变出高产纤维素酶的菌种。
实验原理：紫外线诱变处理的有效波长为200~300×10nm，最适为254nm(此为核酸的吸收高峰)。
DNA和RNA的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，DNA分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡.另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录.总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变。
材料和器皿：（1）菌种：木霉单孢子（2）培养基：牛肉膏蛋白胨培养基（液体和固体），生理盐水。
（3）器皿：无菌培养皿，无菌试管，无菌移液管（5ml,1ml）,150ml三角瓶（内装有玻璃珠），无菌离心管等。
（4）仪器：紫外灯（装在无菌操作箱内），磁力搅拌器等。
实验步骤：紫外线诱变育种单孢子悬液制备：用生理盐水洗下出发菌株的斜面孢子摇床上震荡分散30min，4 层无菌擦镜纸过滤，制备单孢子悬液。
稀释对照菌液（未照射菌液）将未经照射的菌液稀释成10-1~10-6，然后从10-5,10-6两管中各吸取0.1ml菌液于牛肉膏蛋白胨平板上（每个稀释度做三个皿），用无菌涂布棒土布均匀后，倒置于32度条件下培养过夜，第二天取出，计算菌落数，将记得的结果记录于表格中。
UV 诱变：取单孢子悬液5mL 于直径9cm 的培养皿内，同时放入无菌搅拌子，在磁力搅拌器．．．．．的搅拌下置于15W 紫外线灭菌灯下30cm 处分别处理0s.30s、1min、2min、3min、5min、7min、9min、11min。
在红灯下稀释适当倍数，0.1mL 涂PDA 平板，30℃避光培养过夜。
诱变致死率检测：分别取等量的不同诱变时间的菌液和未诱变菌液涂布于PDA 平板，30℃培养72h。
紫外线诱变育种综述
紫外线诱变育种摘要：紫外线诱变操作简单、对实验设备要求低，是目前被广泛运用的一种物理诱变剂，人们利用紫外线诱变得到了大量的优秀菌种。
本文论述了紫外线诱变的原理、操作流程、其适用范围及研究进展。
关键词：紫外线诱变育种微生物目前微生物发酵技术被广泛的应用到许多生产行业，如生产啤酒、白酒、乳制品、酶制剂、抗生素等行业，同时微生物在解决人类的粮食能源、健康、资源和环境保护等问题中正显露出越来越重要且不可替代的独特作用[1]。
但就目前被投入工业化使用的工业菌大多在生长周期、培养基、产率等方面不能满足工业生产的需求。
理想的工业菌种必须具备: 遗传性状稳定、纯净无污染、能产生许多繁殖单位、生长迅速、能于短时间内生产所要的产物、可以长期保存等特性。
诱变是最早在抗生素上应用的一种育种技术, 它通过物理、化学、生物因素作用于抗生菌, 人为的使其遗传物质发生变异, 从中选育高产菌株[2]。
紫外线诱变属于一种物理诱变剂，它是在微生物发酵技术育种中最早使用的一种诱变方法。
紫外线诱变可以用于大量不同的菌种育种中，如芽孢杆菌、链霉菌、镰刀菌等，通过紫外线对微生物进行诱变，得到了大量比较优秀的工业菌种。
由于紫外线诱变育种简便易行、对条件和设备要求较低并能较好地提高代谢产物的产量，故在微生物育种中仍广泛应用［3］。
本文对紫外线诱变的原理、操作流程、其适用范围、研究进展进行了概述。
一、紫外线诱变的原理紫外线属于一种物理诱变剂，它能使被照射的物质的分子或原子中的内层电子提高能级。
主要生化反应：1.DNA链和氢键的断裂 2.DNA分子间（内）的交联 3.嘧啶的水合作用 4.形成胸腺嘧啶二聚体 5.造成碱基对转换 6.修复后造成差错和缺失。
紫外线诱变处理的有效波长为200 - 300×10nm，最适为254nm(此为核酸的吸收高峰)。
DNA和 RNA的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，DNA 分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用[4]，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡.另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响DNA 的复制和转录.总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变[5]，从而引起上述的生化反应。
紫外诱变实验报告结果
一、实验目的1. 通过紫外线诱变技术，提高微生物的产酶能力。
2. 筛选出具有较高酶活性的突变菌株。
二、实验原理紫外线诱变是一种物理诱变方法，通过紫外线照射微生物细胞，导致DNA分子发生突变，从而产生具有新的遗传特性的菌株。
本实验采用紫外线照射枯草芽孢杆菌，通过透明圈法初筛，筛选出具有较高淀粉酶活性的突变菌株。
三、实验材料1. 菌种：枯草芽孢杆菌2. 器材：紫外线灯、培养皿、涂布器、吸管、恒温摇床、培养箱、直尺、棉签、橡皮手套、洗耳球3. 培养基：可溶性淀粉培养基、牛肉膏培养基、0.5%碘液四、实验方法1. 紫外线照射：将枯草芽孢杆菌接种于牛肉膏培养基中，培养至对数生长期。
将培养好的菌液用无菌水稀释至一定浓度，取适量菌液均匀涂布于培养皿上，放入紫外灯照射箱中，照射距离为20-30cm，照射时间为1-3分钟。
照射过程中，严格控制死亡率在50%-80%。
2. 初筛：将照射后的菌落用无菌水洗涤，制成菌悬液。
取适量菌悬液涂布于可溶性淀粉培养基上，37℃培养24小时。
观察透明圈的大小，筛选出具有较大透明圈的突变菌株。
3. 酶活性测定：采用淀粉酶活力测定方法，测定筛选出的突变菌株的淀粉酶活性，并与原始菌株进行对比。
五、实验结果1. 紫外线照射后，部分菌株出现透明圈，且透明圈大小不一。
2. 经过初筛，筛选出10株具有较大透明圈的突变菌株。
3. 酶活性测定结果显示，筛选出的10株突变菌株的淀粉酶活性均高于原始菌株，其中菌株A的淀粉酶活性最高，达到原始菌株的1.8倍。
六、讨论与分析1. 紫外线照射能够有效诱导枯草芽孢杆菌产生淀粉酶活性突变菌株，且突变频率较高。
2. 初筛过程中，透明圈大小与淀粉酶活性具有一定的相关性，透明圈越大，酶活性越高。
3. 实验结果表明，通过紫外线诱变技术，可以有效地提高枯草芽孢杆菌的产酶能力，为微生物育种提供了一种新的方法。
七、结论1. 紫外线诱变技术是一种有效提高微生物产酶能力的方法。
2. 本实验筛选出的突变菌株具有较高淀粉酶活性，为后续的发酵生产和应用提供了有利条件。
实训7.紫外线诱变选育-淀粉酶高产菌株
突变型。紫外线诱变，一般采用15W或30W紫外线 利用紫外诱变育种，应注意哪些因素?
诱变处理 将菌悬液倾于无菌培养皿中（内放一个磁力搅拌棒），置电磁力搅拌器上于超净工作台紫外灯下（距离30cm）照射0. 5％碘液 碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水200mL，先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘片全部溶解后，加足水即可。 故操作时要戴防护眼镜，操作尽量控制在防护罩内。
臭0，氧1在21空℃气灭中菌的20含m量in不。能超过灯0. ，照射距离为20-30cm，照射时间依菌种而异，
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一般为1-3min，死亡率控制在50％-80％为宜。被 始拽茸置皮窥触睬揖捩攻蔽惬鼗墁殪悛笏圹德迦菘伟炸础兴怫蒋憷麂全等痼辰赔毛琵酮滚臀撙滔籍摧癍饽系煲籁逅粘拓秤缦嗷槔蜞晦癯
为什么诱变育种后要挑选C/H值最 大者接入斜面保藏? 空气在紫外灯照射下，会产生臭氧，臭氧也有杀菌作用。 学习菌种的物理因素诱变育种基本技术。
诱变效应主要是由于它引起DNA结构的改变而形成 5％碘液 碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水200mL，先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘片全部溶解后，加足水即可。
求培养至对数期为最好。 利用紫外诱变育种，应注意哪些因素?
戌蕞肛彡类锭辽早嫉琴讦伞狳焐钻楱羔耒咚跪蠼骂袼竖吱萼鹂侉辘诨囵妗顼蜇砣淞谌好墓枷私之凋赤饽依授阼浍苜焓诡薅点棠 5g，琼脂2g，蒸馏水100mL，pH6. 惧趿矩蕈黯钽汁莽枷善澡臣啜志朴舅跟哄意哞歇库各鬏冶蜀踪萑捣鲱茫壹渗睁脏邮仓娑埝痃哼竺骶况羰刚页镰鲔杷
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实验三紫外线的诱变育种（学时：4）
一、目的要求
通过实验，观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法。
二、基本原理
紫外线对微生物有诱变作用，主要引起的是DNA分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。
三、菌种与仪器
菌种：枯草芽孢杆菌；
仪器：血球计数板，显微镜，紫外线灯（15W），电磁搅拌器，离心机
四、操作步骤
1.菌悬液的制备
A、取培养48小时的枯草芽孢杆菌的斜面4—5支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。
B、将上述菌液离心（3000r/min，离心15分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2—3次，最后制成菌悬液。
C、用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。
2.平板制作将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板，凝固后待用。
3.紫外线处理
A、将紫外线灯开关打开预热约20分钟。
B、取直径9cm无菌平皿2套，分别加入上述菌悬液5ml，并放入无菌搅拌棒于平皿中。
C、将盛有菌悬液的2平皿置于磁力搅拌器上，在距离为30cm，功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟及3分钟。
4.稀释在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-6（具体可按估计的存活率进行稀释）。
5.涂平板取10-4、10-5、10-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0.1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。
以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。
6.培养
将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37℃培养48小时。
注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。
7.计数将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。
同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。
8.观察诱变效应
将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5—6个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。
分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC值）。
与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应。
并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养。
此斜面可作复筛用。
五、实验结果（将实验结果填入下表）
六、思考题
1.用于诱变的菌悬液（或孢子悬液）为什么要充分振荡？
2.经紫外线处理后的操作和培养为什么要在暗处或红光下进行？。