紫外线诱变育种高产纤维素菌实验方案
紫外诱变技术实验报告
一、实验目的1. 掌握紫外诱变技术的原理和方法。
2. 了解紫外诱变在微生物育种中的应用。
3. 通过实验，筛选出具有较高产酶能力的突变菌株。
二、实验原理紫外诱变技术是利用紫外线照射微生物，使微生物DNA发生突变，从而获得具有优良性状的菌株。
紫外线照射能导致DNA分子中碱基对的改变、缺失或插入，进而影响基因的表达，产生新的遗传性状。
三、实验材料1. 菌种：产淀粉酶枯草芽孢杆菌。
2. 器材：紫外线照射装置、超净工作台、电磁力搅拌器、低速离心机、培养皿、涂布器、10mL离心管、（1、5、10mL）吸管、250mL三角瓶、恒温摇床、培养箱、直尺、棉签、橡皮手套、洗耳球。
3. 培养基和试剂：无菌水、75%酒精、0.5％碘液、碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水200mL、可溶性淀粉2g、牛肉膏1g。
四、实验方法1. 菌种活化：将产淀粉酶枯草芽孢杆菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃培养24小时，得到活化菌种。
2. 菌悬液制备：将活化菌种接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、180r/min 振荡培养3小时，制成菌悬液。
3. 紫外诱变：将菌悬液置于紫外照射装置下，距离20~30cm，照射时间分别为1、2、3分钟，设置对照组（未照射）。
4. 细菌复苏：将照射后的菌悬液涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，37℃培养24小时，观察菌落生长情况。
5. 初筛：挑选生长速度较快、菌落形态异常的菌落，进行进一步的淀粉酶活性测定。
6. 淀粉酶活性测定：将挑选的突变菌株接种于可溶性淀粉培养基中，37℃培养24小时，用碘液检测淀粉酶活性。
7. 验证与保存：对具有较高淀粉酶活性的突变菌株进行验证，并保存于甘油管中。
五、实验结果1. 紫外线照射时间对菌落生长的影响：照射1分钟时，菌落生长速度明显降低；照射2分钟时，菌落生长速度有所下降；照射3分钟时，菌落生长速度明显下降。
2. 淀粉酶活性测定结果：经过筛选，发现突变菌株A的淀粉酶活性最高，为对照组的1.5倍。
紫外线诱变纤维素酶高产菌株的筛选及其酶活力
紫外线诱变纤维素酶高产菌株的筛选及其酶活力张君胜;张力;张尧【摘要】为筛选产纤维素酶酶活力高的菌株应用于秸秆饲料发酵,利用紫外线诱变对1株产纤维素酶绿色木霉菌进行了试验研究.结果表明:筛选出1株纤维素酶产酶量高且性状稳定的高产菌株ZJUV18,其发酵72h纤维素酶滤纸酶活达68.07 U/g,较原始菌株提高4.45倍.%A Trichoderma viride strain was treated with ultraviolet to screen out a high cellulase-producing strain and apply in straw feed fermentation. The results showed that a high cellulase-producing strain with high cellulose yield and stable characteristics, which was named ZJUV18, was screened out. The FPA could be up to 68. 07 U/g after fermented for 72 hours, which was 4. 45 times the activity of the original strain.【期刊名称】《贵州农业科学》【年(卷),期】2011(039)010【总页数】3页(P125-127)【关键词】纤维素酶;诱变;紫外线;酶活力【作者】张君胜;张力;张尧【作者单位】江苏畜牧兽医职业技术学院,江苏泰州225300;江苏畜牧兽医职业技术学院,江苏泰州225300;江苏畜牧兽医职业技术学院,江苏泰州225300【正文语种】中文【中图分类】S182粮食短缺、能源危机是目前全球所面临的危机。
而我国由于受人口多、耕地少的双重制约，粮食供应形势尤为严峻。
因此，我国畜牧业要稳定持久发展，就必须减少对粮食的依赖[1]。
生物工艺学紫外线诱变纤维素降解菌
紫外线照射处理观察记录表
培养皿处理时间min 菌落数 菌落形态变异形态 1 2 3 4 5 6 7 8
4.结果计算 致死率%=对照每毫升菌落数-处理后每毫升 菌落数/对照每毫升菌落数×100; 存活率%=处理后每毫升菌落数/对照每毫升 菌落数×100
ห้องสมุดไป่ตู้
思考题 1.为什麽设对照？ 2.为什麽微生物常采用紫外育种？
吸取1ml，在灭菌超净工作台上涂布无菌培养皿中， 打开皿盖， 用移液管分别加入1、3ml，经15W紫外灯距 离30cm处照射1、2、3、4、5、6、7、8min,将经过照射 的平板用报纸包好后置35℃培养3天；同时打开皿盖， 用移液管分别加入1、3ml菌体悬液，不照射紫外光做对 照，进行菌落计数，计算出每毫升菌落数，计算存活率 和致死率。
3.试剂
马铃薯 纤维素 琼脂 蒸馏水
4.仪器设备
超净工作台
15w紫外灯台
离心机
培养皿
3.方法
将制有PDA培养基（马铃薯200g 纤维素（cmc） 若干克 琼脂 15-20g 蒸馏水1000ml）的表面皿上 培养的菌落接入100ml（马铃薯200g 纤维素（cmc） 若干克 、蒸馏水1000ml ）不含琼脂的液体培养基 中，35℃，150r/min培养48h后将培养液用离心机 4000r/min离心，除上清液，用无菌上清液洗涤菌丝， 重复3次，最后用无菌水混合菌体悬液，用显微镜计数， 调整菌数浓度为106～107个/mL。
实验二 纤维素降解菌的诱变育种
1.目的:学习纤维素降解菌的诱变育种，掌握用紫外光诱变育种技 术（对有一定能力产纤维素酶的菌种进行紫外线诱变，诱变出高 产纤维素酶的菌种） 2.原理：紫外光诱变处理的有效波长为245nm（核酸最高吸收峰） DNA和RNA嘌呤和嘧啶吸收紫外线后，DNA形成嘧啶二聚体，即两 个相邻的嘧啶共价链接，二聚体减弱双键间氢键的作用，并引起 双链结构扭曲变形，阻碍碱基间正常配对，从而引起突变和死亡。 另外，二聚体的形成会妨碍双键的解开，影响DNA复制和转录。 从而引起碱基转换、颠倒、移码突变、缺失产生诱变（紫外线能 使微生物遗传物质发生突变，不良的遗传物质发生的突变,使优 良遗传物质发生突变的微生物个体得以继续繁衍。使不良遗传物 质发生突变的微生物个体消亡。为人类利用微生物生产有价值的 次生代谢物） 提供了途径。
一株产纤维素酶细菌紫外线诱变研究
一株产纤维素酶细菌紫外线诱变研究郑哲;贾翠英;张玉辉【摘要】A bacterium strain producing cellulase was investigated by UV mutation in this paper. The influenced factors of mutation time , mutation distance , cell concentration and cell growth cycles on ratio of cell death and cellulose activity were studied. Through the cellulose-Congo red cultivation and fermentative medium cultivation experiment, the optimal mutative condition was obtained, which was 180s mutation time , 25cm mutation distance, 10-5 diluted cell concentration and 24h cultivated cell. Under the optimal condition,the strain statically cultivated for 2 days , the highest cellulase activity of 38. 30U/mL was achieved which was much higher 40. 08％than that of original experimental strain, all these resultswill give some remarkable values and references for enhancing cellulose activity.%以一株产纤维素酶细菌为主要研究对象进行紫外线诱变研究,通过考察紫外线诱变时间、诱变距离、菌体浓度和菌龄时其产纤维素酶能力的影响,并用纤维素刚果红培养基进行复筛,然后进行液体静置发酵产酶试验,确定了最适紫外线诱变组合条件.结果表明最适紫外线诱变组合条件为:诱变时间180 s、诱变距离25 cm、菌体浓度为10-5、菌龄为24h,在此条件下进行2d液体静置发酵,其酶活最高值为38.30U/mL,与原始出发菌株相比酶活力提高了40.08%,该研究对提高纤维素酶活性具有一定参考价值和借鉴意义.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2011(028)003【总页数】4页(P66-69)【关键词】细菌;紫外线诱变;纤维素酶【作者】郑哲;贾翠英;张玉辉【作者单位】河南科技学院生命科技学院,新乡,453003;河南科技学院生命科技学院,新乡,453003;河南科技学院生命科技学院,新乡,453003【正文语种】中文【中图分类】Q93-3;Q814;Q55纤维素是地球上最广,含量最丰富的碳源物质,可以被纤维素酶降解成葡萄糖,并进一步的转化为食品、饮料或乙醇等,将对缓解人类目前面临的粮食紧缺和能源危机发挥重大的作用[1-4],因此,纤维素原料是重要的可再生资源和能源。
高产纤维素酶生产菌的筛选及诱变育种
ｄ ｉ ３ ６／ｉ ｎ１７ － ０ Ｘ２ １．１ ０ ５ ｏ：ｍ．９９ ．ｓ． ４ ５ ６ ． ００ － ０ ｉｓ ６ ０
丢糟 ，是在 固态 发 酵法 酿造 白酒 时 入窖 回糟 蒸 酒后 的酒醅 。 由于 丢糟含 有难 于消 化 的稻壳 ， 粗纤 维
素 的酶解 是 一个 复 杂 的过 程 ，其 真正 的酶解 机 制还 不 完全 清楚团 。 从 自然 中分 离 出 的纤 维 素 酶生产 菌纤维 素 酶活 力 一直 不 高 ， 了最 大 限度 的利 用丢 糟 中的 纤维 素 ， 为
Ｓ ｒ ｅ ｉ ｇ ａ ｄ Ｍ ｕ ａ ｅ ｅ ｉ ｆＨｉ ｈ Ｃｅｌ ｌ ｓ ｔ ｉｙ Ｓ ｒ ｉ ｃ ｅ ｎ ｎ ｎ ｔ ｇ ｎ ｓｓｏ ｇ ｌ ａ ｅ Ａｃｉ ｔ ｔ ａ ｎ ｕ ｖ
Ｆ Ｎ ｈｎ －ｉｇ Ｙ Ｎ ａ－ ａ ， Ｉ Ｎ Ｚ ｉｗ ｉＬ ｉ － ｉｎ ， ＨＥ ｏ ｂｎ Ａ Ｇ Ｓ ａ ｇ ｌ ， Ａ Ｇ Ｄ ｎ ｄ ｎ Ｑ Ａ ｈ－ ｅ， Ｉ ａ ｑａ ｇ Ｃ Ｎ Ｍａ－ ｉ ｎ Ｘ ｏ
ｍ ｔ ｅｅｉ Ｔ ｅＣ ｎｙ ｃ ｖ ｙＷ ３２９ ｕｇｄｙｍ ｄｕ ｔｅＦ Ａ ｅ ｚｍｅａｔ ｉ Ｗ ０ ．１ ／ ｒ ｄｕ ｕａ ｎｓ ． ｈ ＭＣ ｅｚｍｅａｔ ｉ ａ １３ ． ／ ｒ ｅｉｍ、 Ｐ ｎｙ ｃ ｖ ｇ ｓ ｉｔ ｓ ｏ ｈ ｉ ￣ ａ ３ １ Ｕｇｄｙｍｅｉｍ ｓ ６
利用紫外诱变育种选育强降解纤维素真菌的研究
利用紫外诱变育种选育强降解纤维素真菌的研究
张伟;张海宾;袁正仿;刘慧娟
【期刊名称】《中国医学生物技术应用》
【年(卷),期】2003(000)004
【摘要】以纤维素粉为唯一碳源,从棉籽壳中筛选出能分解纤维素(CMC)的霉菌,利用常规方法鉴定为绿色木霉,通过紫外线诱变提高分解纤维素的能力,采用水解圈和滤纸崩溃法进行初筛,摇瓶培养复筛的方法,筛选出一突变绿色木霉(T118),降解纤维素的能力提高了1倍,CMC酶活性提高了50%,C1酶活性提高了40%,还对该突变株产酶条件进行了研究,得出最适条件为:稻草粉:麸皮=4:1,发酵时间为5d,发酵温度为30℃,该酶最适反应PH为6,最适反应温度为50℃。
此突变株易培养,有利于工业生产,具有重大的实用价值。
【总页数】6页(P37-42)
【作者】张伟;张海宾;袁正仿;刘慧娟
【作者单位】河南信阳464000
【正文语种】中文
【中图分类】S182
【相关文献】
1.两株纤维素降解真菌的分离鉴定及其产纤维素酶酶学性质的初步研究
2.细菌纤维素高产菌株的紫外诱变育种研究
3.药用真菌猪苓的紫外线及氦-氖激光诱变育种研
究4.朽木中白腐真菌的选育及对木质纤维素降解性能研究5.紫外诱变育种在瘤胃厌氧真菌中的应用效果研究
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紫外线诱变育1
准紫外线诱变育种1.准紫外线诱变育种备孢子悬浮液取新采收的无菌孢子,放入装有生理盐水的三角瓶中(瓶中可放少量玻璃球),摇荡,使孢子分散.孢子液浓度以每毫升含孢子..诱变处理处理要放在能折光的箱中,箱内顶部装15瓦紫外灯管.把孢子液放在培养皿底部.盖好盖,培养皿距灯管30厘米,处理前先开灯30分钟左右,使波长稳定,然后打开皿盖,照射时间为0.5—4分钟(由于各种菌类的孢子不同,照射时间也应有所不同),选定对孢子杀伤在90﹪--99﹪的适当处理时间.照射结束盖上皿盖,稀释,然后取稀释液0.1毫升涂平板,适温黑暗培养,待长出是芒状菌落后立即挑出,供进一步试验用.(二)硫酸二乙脂诱变处理硫酸二乙酯属烷化剂,对人体有毒,使用时要注意安全.1.准备孢子悬浮液同前2.诱变处理取硫酸二乙酯原液2毫升,加乙醇2毫升溶解,吸取0.4毫升硫酸二乙酯溶液放入20毫升孢子悬浮液中,让其作用.作用时间,至数小时不等,选出孢子杀伤在90﹪以上的适当处理时间,采用大量稀适法中止反复.最后取0.1毫升涂平板或斜面,适温培养,挑出星芒状菌落作进一步试验.(三)单孢杂交方法1.分离单孢采集孢子,采用连续稀释法稀释孢子,以达到镜检每视野1---2个孢子为好;涂布平板,,适温培养;挑起单个菌落,继续培养.2.单核菌丝鉴定(1)海登海因氏铁矾苏木精染色法①苏木精处理:取苏木精0.5克,溶于10毫升95%乙醇内,再加90毫升蒸馏水,用纱布扎住瓶口,置光亮处,3—4个月成熟后方能使用.氧化完成的苏木精呈酒红色.为防止苏木精过度氧化,可将苏木精溶于95%乙醇内配成原液,使用前加水稀释.如在乙醇中加少量甘油效果会更好.②媒染液准备:这种染色法要用铁矾作媒染液.配方为铁矾2.5克,溶于100毫升蒸馏水中即可.③褪色剂制备:将上述媒染液加水稀释一倍即可.④铁矾苏木精染色步骤:将石蜡切片从二甲苯经各级乙醇到水,冲洗,媒染1—4小时,蒸馏水洗2—3次,用退色剂处理至镜检细胞核清晰为止.(2)锁状联合鉴定取菌丝镜检,观察3—5个视野,以找不到锁状联合为准,确认为单核菌丝.(3)出菇试验鉴定利用单核菌丝不结实的特征,相同条件下以双核菌丝作对照鉴定单核菌丝.3.杂交采用两点接种法进行杂交,杂交可在平板上也可在试管内进行.方法是将两个不同亲本的单核菌丝分别接种在平板或试管斜面上,两点相距1厘米左右,适温培养,待两亲本菌丝生长入空白试管斜面,培养.镜检有无锁状联合,如有锁状联合说明已杂交上,留下作出菇筛选.4.初筛,复筛,中试推广取有锁状联合的试管,扩制原种,栽培种,进行小面积出菇筛选,为初筛.把初筛中综合性状表现较好的菌株扩大面积进行复筛,选出优良菌株作中试推广.(四)多孢杂交方法1.亲本孢子萌发时间测试分别制备两亲本孢子悬浮液,同时分别接入培养基上,适温培养,定时观察孢子萌动情况,纪录萌动时间.2.孢子杂交根据亲本孢子萌动时间,同时(孢子萌动时间基本一致)或先后接入孢子液同一试管斜面上,培养,当两亲本菌丝接触,发生自然杂交.培养过程中经常检查,见有单菌落出现就挑出,接入马铃薯葡萄糖培养基上培养.3.拮抗试验取杂交菌株与两亲本作3点拮抗试验,选取有2条拮抗线的菌株扩大培养,作初筛,复筛,中试推广.(五)原生质体融合所谓原生质体是细胞去除细胞壁后的细胞核和细胞质的部分.原生质体融合则是把具有一定遗传标记的两种不同遗传类型的原生质体,通过细胞核和细胞质的融合,进行遗传重组成为新的类型的一种方法.它是生物技术领域的重大突破,它为远缘杂交育种开辟了新的途径.1.原生质体制备(1)培养适龄的菌丝体可以用液体培养,也可用试管斜面培养,一般要求生长旺盛的幼嫩菌丝体.如香菇原生质体制备采用25℃液体培养,也可用试管斜面培养4天的菌丝体最佳.培养基以马铃薯葡萄糖酵母粉培养基为最好,不但菌丝生长不好,同时原生质体释放量有也大.(2)酶系统与酶浓度选择真菌细胞壁的主要成分是纤维素、半纤维素和几丁质等多糖物质,合适的脱壁酶系统是这些多糖物质降解的关键,常用的有溶壁酶、脱壁酶、蜗牛酶等.中国科学院广东微生物研究所研制的脱壁酶具有较好的酶解效果,香菇菌丝脱壁采用1%脱壁酶,其原生质释放量可达到10/7%毫升以上 . (3)渗透压稳定剂选择脱去细胞壁的原生质体必须在相应的渗透压条件下才不至于破裂,因此,合适的渗透压稳定剂是影响菌丝释放原生质体的重要因素.常用的有0.6摩/升氯化钾、0.6摩/升硫酸镁及0.6摩/升甘露醇.香菇菌丝脱壁的渗透压稳定剂以0.6摩/升氯化钾或0.6摩/升硫酸镁为宜,原生质释放量均在10/7/毫升以上.(4)酸碱度一般担子菌的脱壁在中性条件下效果最好,香菇则要在较酸[氢离子浓度100微摩/升(PH4)]的酶解反应系统中才能达到高的脱壁率.2.原生质体再生脱壁的原生质体虽然失去原有的形态而变成球形,但细胞质膜和整个基因团仍然存在,它具有原来的生理功能,在适宜的条件下,细胞壁能在形成,恢复为一个细胞,在培养基上形成菌落,这就是再生.再生培养基有麦芽糖10%,葡萄糖4%,酵母粉4%(MDY)；麦芽糖10%,葡萄糖4%,酵母粉4%,菌丝提取液15%(MDYM);纤维二糖1.5%,蛋白胨0.2%,菌丝提取液20%.香菇原生质体再生方法:将制备好的原生质体经过滤和洗涤后,置于再生培养基MDYM中浅层培养(25℃),2天后把开始萌动的原生质体涂布在固体再生培养基表面,经10至15天后即开始出现微小的再生菌落,把这些菌落转移到马铃薯葡萄糖琼脂培养基上培养,10至14天可长满斜面.再生滤可达10%左右,若采用再生培养基MDY,则再生率只有1%左右,说明不同营养成分对原生殖体再生的影响.再在生培养中,渗透压稳定剂以蔗糖为好.3原生质体融合(以香菇为例) 将两个单核亲本的原生质体以1：1混合(每个原生质体数目在5×10/6毫升以上),混匀后缓慢加入等体积的聚乙二醇溶液[ 聚乙二醇溶液4000,30%,10毫摩/升氯化钙 ,氢离子浓度3136纳摩/升(PH5.5)],与24℃静止30分钟,用0.05摩/升甘氨酸,50毫摩/ 升氯化钙,氢离子浓度 0.316纳摩/升(PH9.5)的缓冲液冲洗2至3次,稀释后取0.1毫升放入0.5%软琼脂融合子再生培养基中,混匀后把它薄薄地铺在 1.5%琼脂的融合子再生培养平板上,25℃培养.4. 融合子的检出于鉴定待培养基上出现肉眼可见的微小再生菌落时,将其分别转移到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上,镜检菌丝有无锁状联合.融合子的鉴定可做以下试验:镜检有无锁状联合;融合子与亲本菌株的拮抗试验;酯酶同工酶谱;多酚氧化酶谱;DNA扩增仪分析;出菇试验.㈥单核和同核原生质体杂方法由于单核和同和原生质体是直接来源于营养菌丝 ,没有经过减数分裂的无性后代,所以这一材料为食用菌的遗传和育种研究提供了一个十分重要的基础材料.单核和同核原生质体与孢子单核体相比,有它自己的特点:它是自己从菌丝体得到的;只存在两种交配型(亲本型AXBX,AYBY);在菌落形态、菌丝生长速度﹑羧甲基纤维素酶相对活性和酯酶同工酶这4种性状上,都具有相对的稳定性,变异范围小,亲本性状不易在单核原生质体中分散和稀释,这就可以使人们在一个比较小的变异范围内去选择具有亲本性状的单核体.单核原生质体的这一特点在食用菌菌种改良中具有重要意义,同时也为遗传育种中充分利用野生种质资源提供了一个十分光明的前景.杂交的具体方法:同前法制备原生质体.分别取不同亲本的单核原生质体进行杂交(杂交方法同单孢杂交),得到杂交株后进行初筛﹑复筛,中试推广.(七)单双核杂交方法选用两个亲本,其中一个用其双核菌丝,另一个分离单核原生质体,在平板上先接种单核原生质体,待菌落长到1厘米左右时,相距0.5∽1厘米处接种双核菌丝,适温培养.数天后,挑取单核菌丝一边.少许菌丝镜检,如有锁状联合,说明已杂交成功,可行扩管培养,进行筛选.四﹑基因工程育种基因工程就是基因水平上的遗传工程.它是用人工方法把人们所需要的某一供体生物的遗传物质---- 脱氧核糖核酸(DNA)大分子提取出来,在离体条件下切割后,把它和作为载体的脱氧核糖核酸分子连接起来,然后导入某一受体细胞中,以让外来的遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得符合人们预先设计要求的新物种.基因工程主要包括以下步骤︰准备材料,如“目的”基因﹑载体及工具酶等;体外重组;载体传递﹑复制表达.基因工程育种在医﹑工﹑农方面有较多的研究,食用菌育种上研究甚少.。
实验一工业微生物的筛选和紫外诱变育种
实验一工业微生物的筛选和紫外诱变育种一．实验目的：加深对发酵工程上游技术中菌种选育的认识；学会常规选种和育种的方法，树立科学认真仔细的态度，培养科研协作精神。
二、实验原理：根据一定的生产目的如抗生素或酶类的生产，建立不同的筛选模型，并从特定的样品如土壤中筛选出高产适宜的菌株。
三．培养基及仪器：降解亚硝酸盐培养基：NaNO2 0.2%，KH2PO4 0.7%，MnSO4.H2O 0.25%，Na2HPO4 1.35%，MgSO4.7H2O 0.1%，葡萄糖1％，琼脂2％，0.1MPa灭菌20分钟。
6个250ml三角瓶，各装100ml培养基。
同时灭菌试管20支，1ml吸管12支，普通平皿60个，灭菌生理盐水。
培养亚硝酸盐降解菌发酵液1瓶，每位同学准备1个斜面。
3．洁净工作台、培养箱、三角瓶、曲玻棒、平皿。
四．操作方法课前半小时打开超净工作台灭菌。
1.土壤中降解亚硝酸盐细菌的筛选分离稀释土样。
5g土样，加入45ml无菌水中。
为10-1，然后取1ml加入9ml无菌水，为稀释10-2，直至稀释至10-8溶化培养基。
将溶化后不烫手的培养基倒入平皿，刚好盖过平皿底部，迅速摇匀后放置，使培养基冷却，要求平皿培养基表面平整、光滑。
吸取10-4，10-5或10-6相应浓度的土样稀释液0.5ml，加入平皿内，用烧过灭菌的曲玻棒均匀涂平，放入37℃培养箱中倒置培养48小时。
2.亚硝酸盐分解菌的紫外诱变育种取10ml培养好的液体培养液，放入90 mm培养皿，将皿放置于诱变箱的磁力搅拌器上,置于30 W 紫外灯下，照射90 s，用无菌生理盐水稀释至10-6，10-7，10-8，按常规方法涂布筛选平板。
同学可自行选择培养亚硝酸盐降解菌和诱变菌。
每位同学做一个平皿。
并标记好稀释度、种类和名字。
五、实验进程安排及结果分析（1）第1次实验：稀释土样，倒平板，冷却后进行平板涂布，放入恒温培养箱中；或进行菌种诱变，稀释诱变菌，倒平板，冷却后进行平板涂布，放入恒温培养箱中。
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紫外线诱变育种高产纤维素菌
实验方案
诱变方案：纤维素酶活力较高菌株→紫外线诱变→初筛→复筛→稳定性试验.
实验目的：对有一定能力产纤维素酶的菌种进行紫外线诱变，诱变出高产纤维素酶的菌种。
实验原理：紫外线诱变处理的有效波长为200~300×10nm，最适为254nm(此为核酸的吸收高峰)。
DNA和RNA的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，DNA分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡.另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录.总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变。
材料和器皿：
（1）菌种：木霉单孢子
（2）培养基：牛肉膏蛋白胨培养基（液体和固体），生理盐水。
（3）器皿：无菌培养皿，无菌试管，无菌移液管（5ml,1ml）,150ml三角瓶（内装有玻璃珠），无菌离心管等。
（4）仪器：紫外灯（装在无菌操作箱内），磁力搅拌器等。
实验步骤：
紫外线诱变育种
单孢子悬液制备：用生理盐水洗下出发菌株的斜面孢子摇床上震荡分散30min，4 层无菌擦镜纸过滤，制备单孢子悬液。
稀释对照菌液（未照射菌液）
将未经照射的菌液稀释成10-1~10-6，然后从10-5,10-6两管中各吸取0.1ml菌液于牛肉膏蛋白胨平板上（每个稀释度做三个皿），用无菌涂布棒土布均匀后，倒置于32度条件下培养过夜，第二天取出，计算菌落数，将记得的结果记录于表格中。
UV 诱变：取单孢子悬液5mL 于直径9cm 的培养皿内，
同时放入无菌搅拌子，在磁力搅拌器
．．．．．的搅拌下置于15W 紫外线灭菌灯下30cm 处分别处理0s.30s、1min、2min、3min、5min、7min、9min、11min。
在红灯下稀释适当倍数，0.1mL 涂PDA 平板，30℃避光培养过夜。
诱变致死率检测：分别取等量的不同诱变时间的菌液和未诱变菌液涂布于PDA 平板，30℃培养72h。
以未诱变菌液培养后的菌落数为基准计算
不同诱变时间的致死率，选择致死率较高的诱变菌液继续检测其产纤维素酶的能力。
致死率(％)=（对照皿的菌落总数-诱变处理后的菌落总数）／对照皿的菌落总数×100
筛选培养基的选择
．．．．．．．．:．挑取孢子接种到PDA 斜面培养基上活化，28℃
培养72h。
通过点样法分别接种于平板筛选培养基1和培养基2 上，28℃培养72h。
观察不同培养基上纤维素酶生产菌的透明圈大小，以确定合适的选择培养基，为进一步筛选做准备.
最佳筛选培养基的确定（对比）
经观察，如果发现平板筛选培养基1 中透明圈较小，平板筛选培养基2（改良培养基）中菌落周围透明圈较明显，因此选择平
板筛选培养基2 作为平板筛选培养基。
复筛：<纤维素酶生产菌菌种复筛> 将纤维素酶生产菌接种于固体曲培养基进行固态发酵，置30℃恒温箱中培养，在12h 以前堆积培养，12h 后摊平，待表面长满菌丝，结成块状时“扣瓶”，继续培养,待长满菌丝即可。
干曲的制备及含水率的测定参考[7]。
测定纤维素酶活力（内切纤维素酶活，滤纸酶活力），筛选高产纤维素酶生产菌.
稳定性试验：对紫外诱变得到的纤维素酶活力相对较高的突变株进行传代遗传稳定性实验, 经一定次数的传代后测定纤维素酶活力.
将所得到的高产纤维素酶菌用于实际生产过程中，与其它产纤维素霉菌对比产酶效率。
注意事项
（1）：用作诱变处理的菌液应尽量使其分散成单细胞，使每个细胞能均匀地接触诱变剂，以避免长出不纯的单菌落。
（2）：照射后的操作都必须在暗室内红光下进行。