Western blotting 具体操作步骤
Western Blotting操作指南
Western Blot 操作指导一：蛋白提取1、组织蛋白提取1）所需器材：制冰机、标记笔、两套1.5ml EP管（最好高温高压处理）、一个大冰盒、一个1.5ml EP管盒、手套、眼科剪（最好高温高压处理）、新鲜组织或保存于-80℃冰箱组织、保存于4℃冰箱的PBS（最好高温高压处理）、移液枪、吸头（最好高温高压处理）、两套研磨棒（最好高温高压处理）、掌上离心机、滤纸、三去污裂解液、苯甲基磺酸氟（PMSF，一种蛋白酶抑制剂，剧毒）、离心机、烧杯、2×SDS凝胶上样缓冲液、二硫苏糖醇（DTT）、震荡器、泡沫板。
2）操作步骤：a.制冰机制冰；b.标记笔将两套EP管做好标记；c.将大冰盒、EP管盒装上冰，一套标记笔做好标记的EP管放置于大冰盒中，另一套标记笔做好标记的EP管放置于EP管盒中，戴好手套，带上EP管盒、眼科剪剪取黄豆大小（约100mg）新鲜组织或保存于-80℃冰箱组织；d.取出保存于4℃冰箱的PBS，往EP管中滴加1ml PBS，眼科剪剪碎组织（动作快），掌上离心，弃上清，再往EP管中滴加1ml PBS，研磨棒研磨，3000转离心10分钟，弃上清，滤纸尽可能吸干管口残留液体，估算EP管中沉淀物体积，以上步骤尽可能在冰上操作；e.从4℃冰箱取出三去污裂解液，-20℃冰箱中取出PMSF置于大冰盒中，往EP管中滴加沉淀物3-5倍体积的三去污裂解液（一般为5倍）,再加入PMSF （二者比例为94：6）,研磨棒研磨（冰上充分裂解20-30分钟），以上步骤均需在进行；f.离心机预冷，将充分裂解后的组织液4 ℃、10000转离心10分钟；g.将烧杯用自来水洗净，倒入单蒸水，电炉上煮沸；h.备好2×SDS凝胶加样缓冲液（存放于常温），取出保存于-20℃冰箱的DTT,置于大冰盒中，将离心后的上清液用移液枪定量吸至另一套EP管中（勿吸掌上离心，然后小心将EP管插入泡沫板，投入已煮沸的烧杯中煮6-8分钟（电炉功率不要调太大，以免管盖爆开）；i. 将泡沫板用镊子取出，置大冰盒中冷却10分钟，掌上离心，再放入-20℃冰箱保存备用。
Western Blotting 流程详细版
Western Blotting 流程详细版1，收细胞。
从细胞间取出要收样的细胞，可以用两种方式进行处理（处理前准备好碎冰，并配好细胞裂解液，在所需量的细胞裂解液中加入leupeptin和PMSF，两者均为100X）：（1）真空泵吸去培养基，加入预冷PBS洗一次，真空泵吸去残液（彻底吸干净）。
直接在板中加入裂解液（6孔板：100ul/well；6cm板：500ul/well；10cm板：1.5ml/well），冰上静置5min。
再吸入预冷的1.5mlEP管中，准备超声(10cm板的细胞裂解液请分装至2到3个EP管中，方便超声)。
（2）真空泵吸去培养基，加入预冷PBS洗一次，真空泵吸净。
再在板中加入PBS（6孔板：500ul/well；6cm板：2ml/well；10cm板：5ml/well），用干净的细胞刮将板中的细胞刮下，转移至1.5mlEP管中（推荐每个EP管500ul左右液体，方便超声）。
2000r，5min，4℃。
如果想尽可能多收细胞，可以在刮过的板里再重复加一次PBS（用量见前述），待之前的管离心之后，再加入，重复离心一次。
离心之后，真空泵或移液枪吸去上清（用200ul tip头，尽可能吸干净）。
加入裂解液（6孔板：100ul/well；6cm板：500ul/well；10cm板：1.5ml/well）。
准备超声。
2，超声破碎细胞。
EP管置于冰上，每管按如下程序超声：超声时间1~2s/次，间隔5~10s 再重复下一次，总共10~20次。
超声后的样品与未超声样品相比更澄清。
超声效率推荐为20%，持续时间不宜过长，否则容易出现泡沫以及焦化现象。
超声1~2s时，可以将EP管从冰上拿出，以便操作，超声后立即放回冰上。
3，超声后离心，最大转速，30min，4℃。
离心后将上清转入新的干净EP管中（沉淀可以加入10ulSDS loading buffer混匀后，煮沸，跑胶，以验证目的蛋白是否残留于沉淀中，或是只存留于沉淀中）。
WB实验步骤详解
WB实验步骤详解Western blotting（简称WB）是一种常用的蛋白质检测技术，通过将蛋白质分离、转移和检测，可以用来确定特定蛋白质的存在和表达水平。
本文将详细介绍WB实验的步骤，以帮助读者了解该技术的操作流程。
1. 细胞培养和蛋白提取。
首先，需要培养细胞并收集细胞样本。
将细胞样本离心，去除培养基，然后用PBS洗涤细胞。
接下来，加入细胞裂解液并振荡离心，收集上清液，即为蛋白提取物。
2. 蛋白质浓度测定。
使用BCA或Bradford方法测定蛋白提取物的浓度，以确保后续实验中使用的蛋白质量一致。
3. SDS-PAGE凝胶电泳。
将蛋白提取物加入蛋白负载缓冲液，然后加入SDS-PAGE凝胶槽中。
进行电泳分离蛋白质，根据蛋白质大小和电荷不同，蛋白质会在凝胶中形成不同的条带。
4. 蛋白质转印。
将SDS-PAGE凝胶中的蛋白质转移到膜上，通常使用半湿式或全湿式转印。
将蛋白质从凝胶转移到膜上，使得蛋白质可以与抗体结合。
5. 阻塞。
将膜放入含有蛋白质的溶液中，如5%脱脂奶粉或蛋白质阻塞缓冲液中，阻塞非特异性结合位点。
6. 一抗孵育。
加入第一抗体，孵育过夜。
第一抗体与目标蛋白结合，形成抗原-抗体复合物。
7. 洗涤。
用TBST或PBS洗膜，去除未结合的抗体。
8. 二抗孵育。
加入HRP标记的二抗，孵育1小时。
二抗与第一抗体结合，形成复合物。
9. 洗涤。
用TBST或PBS洗膜，去除未结合的二抗。
10. 显色。
加入ECL显色液，使得膜上的蛋白质产生发光反应。
将膜放入暗室中，用X光片曝光，然后用显影液显影。
11. 图像获取和分析。
将X光片放入X光片扫描仪中，获取蛋白质条带的图像。
使用图像分析软件，如ImageJ，分析蛋白质的相对表达水平。
以上就是WB实验的详细步骤，每一步都至关重要，需要严格按照操作规程进行。
希望本文能够帮助读者更好地理解WB实验的操作流程，并在实验中取得准确、可靠的结果。
WB实验的基本原理及操作流程
WB实验的基本原理及操作流程WB实验（Western Blotting）是一种用于检测和分离蛋白质的实验方法，广泛应用于生物医学和生物化学领域。
它通过将复杂的蛋白质混合物按照分子大小分离，并使用特异性抗体来探测目标蛋白质。
本文将介绍WB实验的基本原理及操作流程。
一、基本原理WB实验主要基于蛋白质的电泳分离和免疫染色原理。
具体步骤如下：1.样品制备：首先，需要从细胞或组织中提取蛋白质，并经过适当的处理，如裂解细胞、破碎细胞膜等，以获取纯净的蛋白质样品。
2. SDS-电泳：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide Gel），随后进行电泳。
这一步骤会根据蛋白质的分子大小进行分离。
3.转膜：将分离的蛋白质从凝胶转移到聚乙烯2.2-羟基苯基酮（PVDF）或硝酸纤维素膜上，这样可以更容易进行免疫染色。
4.封闭：将转膜后的膜进行封闭，通常使用牛血清白蛋白（BSA）或脱脂奶粉等阻断非特异性结合位点。
5.抗体反应：加入目标蛋白质特异性的抗体，使其与特定抗原位点结合。
6.洗涤：将膜洗涤以去除非特异性的抗体。
7.免疫染色：加入酶标记的辅助抗体，它与目标抗体结合，并携带可检测信号物质（如酶或荧光染料）。
8.显色：加入合适的底物，使酶标记的辅助抗体产生可视化的颜色或荧光信号。
9.分析：通过成像设备（如X射线胶片或荧光成像系统）观察和记录目标蛋白质的表达。
二、操作流程下面是一份WB实验的基本操作流程，具体步骤可能因实验目的和实验条件而有所变化。
1.样品制备：a.收集细胞或组织样品，并使用适当的缓冲液裂解细胞膜。
b.添加蛋白质提取试剂，并彻底裂解细胞。
c.离心裂解后的细胞，收集上清液，其中含有目标蛋白质。
2.SDS-电泳：a.准备好聚丙烯酰胺凝胶，通常使用8%至12%的分辨胶。
b.加载待测样品和分子量标记蛋白质到凝胶中。
c.进行电泳，常用条件为100V持续电解，直到样品顶到凝胶底部。
3.转膜：a.准备合适大小的PVDF或硝酸纤维素膜，并剪成和凝胶一样大小。
western bloting 步骤
Western blotting 步骤一、全细胞裂解液的提取(该步骤在冰上操作，所以要提前准备冰)1.用PBS洗两遍细胞，然后尽量把PBS吸干净2. 配细胞裂解液混合液：细胞裂解液（RIPA）：蛋白酶抑制剂（cocktail）=50：1 或细胞裂解液（RIPA）：PMSF=100：13.按每1×10^6细胞加100到250ul的细胞裂解液混合液，例如：每个10cm的中皿加500ul RIPA再加50ul cocktail4.冰上裂解30min中间震荡几下使其充分裂解(或放在4℃冰箱里，摇床上摇30min，速度20-30)，之后拿刷子把黏在板子上的细胞刷到下面的液体中，将液体吸到EP管中。
5.超声波破碎仪（此步骤可省略）6.离心12000g 4℃离心10min，离心结束后轻轻吸出上清至新的EP管。
离心时打开金属浴，提前做好准备，调节温度到95℃7.测蛋白质浓度(BCA法)①准备一个96孔板，每个孔里加25ul的蛋白质样品，注意加样时间隔一定的距离。
②配测浓度用的BCA液按A:B=50:1的比例配置，每个孔加200ul的BCA混合液。
然后放入37℃的水平摇床上摇晃30分钟，速度60rpm左右。
③将96孔板放入测浓度的设备中，打开电脑中的gen5软件，按“reading”开始测浓度。
假设所得的结果是X，则Y=921.62X-151.65，蛋白浓度=（Y/1000×4/5）ug/ul 上样量=样本量/蛋白浓度8.按吸出的蛋白样本：5×loading buffer =4：1的比例加入loading buffer，在小离心机上甩一下，使挂壁的液滴掉下来。
9.95℃煮蛋白10分钟，使蛋白成线性；然后再放冰上5分钟忽冷忽热使蛋白成球，并与loading紧密结合10.如果紧接着做Western blotting，则可直接用。
如果要以后备用，把蛋白样本放在-20或-80的冰箱里。
二、电泳及免疫印迹1.配胶①将玻璃板洗净，用干净纱布擦干。
免疫印迹实验操作具体步骤及详细说明
免疫印迹实验操作具体步骤及详细说明免疫印迹（Western Blotting，简称WB）是一种常用的分子生物学技术，主要用于检测和鉴定蛋白质的存在以及其在不同样本中的表达水平。
下面将详细介绍WB实验的具体步骤。
1.细胞裂解和蛋白质提取：首先将待检测的组织样本或细胞样本通过离心将其收集，并添加适量的裂解缓冲液。
使用超声波或机械破碎手段将细胞打乱，使蛋白质溶解在裂解缓冲液中。
再通过离心去除细胞碎片和细胞核等。
2.蛋白质浓度测定：根据实验需要，采用BCA法、Lowry法或Bradford法等方法测定蛋白质浓度，以确定后续实验的载体中待加载的蛋白质量。
3.蛋白质电泳：将相同量的蛋白质样品加入SDS-凝胶槽中，进行电泳。
电泳时蛋白质在凝胶中向阴极迁移，分子量小的蛋白质迁移速度较快，分子量大的较慢。
电泳结束后，将凝胶转移到膜上。
4.膜上瞬时染色：在转移至膜上后，可以使用Ponceau S染色或其他瞬时染色方法，以确认蛋白质在膜上的存在和转移效果。
5.阻断：在膜上的蛋白质检测之前，需要对膜进行阻断处理，以防止非特异性结合。
常用的方法是在膜上加入牛血清蛋白或脱脂奶粉的溶液，进行阻断。
6.一抗反应：加入已稀释好的一抗抗体，与目标蛋白质特异性结合。
一抗的选择要根据待检测蛋白的特异性来确定。
7.清洗：一抗反应后，用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗，以去除未结合的一抗抗体。
8.二抗反应：9.清洗：二抗反应后，用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗，以去除未结合的二抗抗体。
10.显色和成像：使用显色剂（如ECL）使膜上的蛋白质发生化学发光反应，然后将膜放入X射线片中，进行曝光。
最后使用化学显影废片机或Gel Doc System等设备进行成像。
11.数据分析：使用专业的成像软件分析成像结果，计算蛋白质的相对表达水平，并与内参蛋白进行比较。
需要注意的是，在进行WB实验的过程中，要严格操作，避免污染和交叉反应的出现。
同时，应根据实验需求选择适当的试剂和抗体，并进行标记、保存和储存等操作。
western blotting的基本操作过程
western blotting的基本操作过程Western blotting是一种常用的分子生物学技术，在蛋白质分析中具有重要的应用。
它可以用于检测、分析、定量和分离蛋白质分子，并广泛应用于生物医学、病理学、免疫学、遗传学等领域。
本文将介绍Western blotting的基本操作过程，以帮助读者了解和掌握Western blotting技术的实验操作。
一、材料准备在进行Western blotting之前，必须准备好所有需要的材料和试剂。
首先需要制备胶液和凝胶，包括聚丙烯酰胺凝胶、缓冲液、Tris-HCl缓冲液、SDS-PAGE凝胶、封盘液、扩增液等。
此外，还需要准备电泳装置、电源、电极、磁力搅拌器、主机等实验设备。
此外，还需要准备细胞或组织样本，并提取蛋白质。
提取蛋白质的方法有很多，目前常用的包括酚/氯仿法、三氯乙酸法、离子交换柱法、氨基酸顺序法等。
二、电泳分离Western blotting是基于电泳的分析方法，因此第一步是将提取的蛋白质进行电泳分离。
在分离之前，必须将样品加入载体缓冲液，以确保其稳定性和一致性。
将样品加入凝胶槽中，用电泳装置进行电泳分离。
在电泳期间，缓冲液通过电解质稀释样品。
当电流通过凝胶时，带电粒子会在电场中移动，分离出不同的组分，最后嵌入凝胶中。
分离后的蛋白质按照其分子量大小排列，从而形成一条蛋白质带。
三、转膜将蛋白质分离带从聚丙烯酰胺凝胶中转移到聚氟乙烯膜上，这个步骤称为转膜。
转膜要求将聚氟乙烯膜浸泡在沉淀剂中，使其吸水并增加其静电位，然后放置在集装箱中。
加入转移缓冲液、荷载样品和过硫酸铵，启动转移。
转膜电源把电流传递到电极板上，导致电子从内极板流向外极板。
这个过程产生的电流足以推动带电粒子（即蛋白质）从凝胶中转移到聚氟乙烯膜上。
由于膜具有不吸水的特性，其吸附的蛋白质能够保持原来的位置和形式。
借助荧光染料可以对蛋白质进行原位成像，并进一步进行分析。
四、免疫分析Western blotting的第四个步骤是免疫分析。
Western Blotting操作步骤及说明
Western Blot操作方法及步骤1).蛋白质提取Extraction buffer组成:蔗糖0.7 MTris/HCl0.5 MEDTA 50 mMKCl0.1 M配制成母液pH 9.4巯基乙醇2%蛋白酶抑制剂25×取100-200 mg植物叶片，用液氮速冻后用研磨仪打碎（若量比较大可用液氮研磨，分装到多管中），加入500 µl 提取缓冲液，涡旋；完全混匀后加入500 µl 苯酚（分层，取下层酚层）, 涡旋；在3000 g 的转速下离心10 min, 4 °C拿两只新的EP管，各取200 µl 离心后的上清液；向两只EP管中各加入1 ml 0.1M NH4Ac（用甲醇溶解配制）；在-20°C下沉淀放置至少2 h过夜放置；在13000 rpm转速下离心5 min，4 °C；用0.1 M NH4Ac（用甲醇溶解配制）洗涤，用枪头将蛋白吹散，洗净杂质；在13000 rpm转速下离心5 min，4 °C；取上清后空甩EP管，去除多余的溶液；室温干燥蛋白, 用1% SDS（100ul左右）溶解蛋白。
2). 测定总蛋白浓度。
用BCA蛋白检测试剂盒测定提取物中的蛋白质含量(1)蛋白浓度测定1、考马斯亮蓝G250通过与蛋白质内的氨基和羧基基团间的静电结合作用以及范德华力，考马斯亮蓝与蛋白质形成强但非共价键连接的复合物。
蛋白-染料复合物的形成稳定染料携带的负电荷阴离子，从而产生在膜上或者胶上肉眼可见的蓝色①测定总蛋白浓度步骤：按照BCA试剂盒说明书进行操作1.配制标准曲线的标准样品--胎牛血清蛋白（BSA）浓度BSA原液浓度：5mg/ml②待测样品稀释用Nanophotometer（纳米光度计）初步测一下待测样品的浓度，计算好稀释的体积，使得终浓度在标准曲线区间内。
③加样准备测定标准样品和待测样品各准确吸取20μl溶液于酶标孔中，加入BCA工作液200μl。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Western blotting
步骤一：配胶
用具：玻璃板（厚板和薄板），海绵垫，梳子，移液枪（1000ul、200ul、20ul等）。
试剂：分离胶成分10%（水、Tris8.8、40%丙烯酰胺、10%APS、TEMED），浓缩胶5%（水，Tris6.8、40%丙烯酰胺、10%APS、TEMED），压线液异丙醇。
过程：1.配制40%的丙烯酰胺溶液，放4℃保存，配制10%APS溶液（0.1g/ml)，备用
2.用一蒸水清洗玻璃板，海绵垫和梳子用自来水冲洗，必须冲洗干净，放入烘箱中烘干。
3.组装玻璃板，放入架子中夹紧，注意板一定要平齐后再放入，将各个量程的移液枪调至所需的量程，先配分离胶，加入各组分至50ml离心管中（最后加TEMED），充分混匀后，立即加入板中，注意沿着玻璃板壁加入，加至液面与板子凹槽平齐，立即加入0.5ml 高度的压线液异丙醇赶走气泡，并及时清洗配胶用的管子以防凝固，30min后待出现折光线即可倾倒去除异丙醇，用吸水纸将残留液体吸净，再配浓缩胶。
4.浓缩胶配制类似分离胶，配好后加入到玻璃板中，至顶部加满即可，插入梳子，及时洗配液管，待凝固后拆板，用双蒸水浸泡，现用或放入4℃冰箱中存放平衡，待第二天取用。
注意：APS，为白色粉末，常温保存，10%APS存于-20℃冰箱配置时提前半小时取出放置室温预热。
TEMED需4℃保存
丙烯酰胺粉末，常温保存即可，而40%的丙烯酰胺溶液则需4℃避光保存
步骤二、电泳
用具：移液枪（20ul，100ul)，上样枪头
试剂：marker，蛋白样品（已加上样缓冲液和100℃，5min加热处理）
准备工作：配制10*电泳液保存，电泳时稀释成1*的电泳液1L现用
过程：将玻璃板装入电泳架中，放入电泳槽中，垂直拔出梳子，先在两板内侧加满电泳液，外侧加一些，不得影响上样，吹打胶丝，去除样品孔中的气泡，上样20ul每孔，左端和右端不加样组分别加多（5ul）和少（2.5ul）的marker，枪头可以看出界线，主要是使marker 的量不一样，右端的多颜色深，左端的量少颜色浅，能区分左和右。
60v电泳1h，至分离胶，转80v//120v电泳1.5h至溴酚蓝跑到胶的底部即可停止电泳。
注意：为保持电泳的平衡，在无样品的孔中也应加入适量的蛋白电泳上样缓冲液。
步骤三、转膜
用具：玻璃翘板、搪瓷盘、镊子、PVDF膜、滤纸、海绵、制冰机、剪刀、镊子
试剂：1*转膜液（冰浴或4℃）、甲醇
准备工作：一般电泳开始后，需制备1*电泳液1L，放置于4℃或冰浴保存，开启制冰机（上样前就开，尽早开启），剥胶前，需将PVDF膜放入甲醇溶液中活化30秒，再将滤纸、PVDF 膜等放入装有电泳液的搪瓷盘中浸泡5-10min左右（转膜前），再进行剥胶。
过程：剥胶，要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬时动作要轻柔，防止胶裂，将浓缩胶轻轻刮去，保留分离胶泡在转膜缓冲液（冰浴过的）中，将样品胶与膜装入标有正负极的转膜夹板中，由夹板负极（黑色）开始，依次从下向上放海绵—2层滤纸—分离胶—PVDF膜—2层滤纸（赶走气泡）—海绵，最上面的白色夹为正极，紧扣转膜夹板，黑对黑，白对红放入槽中，放入含有转膜缓冲液的转移电泳槽中，冰浴中恒流200mA转膜1.5~2h。
注意：分清膜和胶的放置顺序，事先将膜剪成所需的宽度和大小。
步骤三、洗膜
用具：剪刀、镊子、一抗二抗孵育盒
试剂：1*TBST、5%milk-TBS封闭液、
准备工作：转膜过程中，需配制1%TBST、5%milk-TBS牛奶封闭液（4℃保存）。
过程：转膜结束后，黑面在上，白面在下的方向打开夹子，用剪刀在每个PVDF膜的右上角（marker量最多颜色深的一侧），剪一个角，作为标记，判断膜的正反面及样品的位置，再将膜转移到装有TBST的抗体孵育盒中摇床上洗30s左右（将表面的牛奶洗掉即可），再去掉TBST，加入5%milk-TBS封闭液封闭1h左右（摇床转速转到最低）。
步骤四、孵育一抗
试剂：1*TBST
过程：去除膜上残余的奶粉，用封口袋制作一个袋子，将膜放入其中，加入一抗稀释液（1:1000），大概2ml，封口，放置4℃冰箱过夜，第二天回收一抗，将条带取出加1*TBST 洗3次，每次5min，（摇床转速170-180左右）
步骤五、孵育二抗
试剂：1*TBST，二抗
过程：加入二抗（1:10000）在盒子中避光慢摇1~2h，条带取出放在孵育盒中，1*TBST洗3次，15min/次，快摇（170~180转）。