载体介绍

分类： 酵母人工染色体载体（YAC） 细菌人工染色体载体（BAC） P1人工染色体载体（PAC）
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酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome, YAC）
YAC的特点： 1.只能在酵母细胞中扩增 2.克隆容量大，一般为200kb-500kb 3.构建原理，按染色体结构构建
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染色体复制和遗传的三个基本组件：
1.自主复制序列（ARS） （autonomous replicating sequence） DNA复制起始点（ori）
2.着丝粒（centromere，cen）
3.端粒（telomeres，tel）
TEL ORI
CEN
TEL
YAC的组成结构
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YAC的缺点：
抗生素抗性基因：可以便于加以检测，如Amp+， Kan+
多克隆位点MCS：克隆携带外源基因片段 P/E：启动子/增强子 Terms：终止信号 加poly（A）信号：可以起到稳定mRNA作用
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如何阅读质粒图谱
第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核 /真核/穿梭质粒）
第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛 选标记。
4.高容量的克隆能力：
45kb （最少不能低于30kb）。
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噬菌粒载体（phagemid vector)
由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型载 体系列，称为噬菌粒（phagemid或phasmid）
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几种常用的噬菌粒载体的一般特征
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pUC118 (MCS)
pUC119 (MCS)
puC118和 pUC119噬 菌粒载体 的分子结 构
（稍后以大肠杆菌质粒载体详细介绍）
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噬菌体载体
双链DNA噬菌体载体：λ 单链DNA噬菌体载体：M13，T3，T7
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λ噬菌体载体
λ噬菌体颗粒中的DNA是一线性双链DNA分子，长 48502bp，两端各有12个碱基的5`凸出黏性末端 是互补的。进入细胞的λDNA通过两端的黏性末 端环化。
λ噬菌体上有些基因可被取代而不影响其生活 周期。
Ampr
Tetr
Ori
pBR322质粒载体的结构来源
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特点:
具有多个单一的限制性内切酶位点。 Tetr中有BamH1切点（G↓GATCC）和SalⅠ切点 （G↓AATTC），Ampr中有PstⅠ切点（CTGCA↓G）。 利用ColEl的复制子，在细胞中是多拷贝的。
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pBR322质粒载体的优点：
1.存在插入子的稳定性问题 同一酵母细胞内多个YAC引起交换
2.转化效率低 3.难以制备纯的YAC-DNA
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细菌人工染色体（BAC）
基于大肠杆菌F质粒构建的高容量低拷贝质粒载体。 克隆外源DNA片断：100-300kb,远大于柯斯质粒，但 小于YAC 比较稳定,每细胞只有一个拷贝，不会重组。 工作原理类似常规质粒克隆载体
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λ噬菌体载体举例：λgt10 载体
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λ噬菌体载体举例：λEMBL3
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λ噬菌体载体主要特点
主要有如下特点： (1)筛选简便； (2)可克隆的片段大，最大可达23 kb，而质粒最大
仅10 kb左右； (3)转化效率高。λ噬菌体载体是主要用于cDNA构建，也经常用 于外源目的基因的克隆。
什么是质粒？ 质粒（plasmid）是独立于染色体外、具有自主复制能
力的遗传单位，其本质是较小的核酸分子，大小范围在 1kb-200kb以上不等。
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细菌质粒的一般生物学特性
1. 很多细菌中已发现； 2. 是独立于细菌染色体之外的辅助性遗传单位，基因组绝大
部分为双链环状DNA，不同质粒大小各异； 3. 大多数质粒的宿主范围较窄； 4. 已发展进化出多种机制以维持其在细菌宿主中的稳定的拷
许多实用的质粒载体都是在pBR322的基础 上改建而成。可见其原型质粒在使用上有 优点。
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克隆载体
1.pBR322
它由三部分组成： 来自pSCl01的四 环素抗性基因Tetr 来自ColEl的衍生 物pMBl的松弛复 制起点ori 来自RSF2124的氨 苄青霉素抗性基 因Ampr。
组成:
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F+ 又叫雄性决定因子，所以F+细胞又叫雄性细胞， 相应的 F– 又叫雌性细胞。
F质粒(约94kb)在寄主细胞中有三种不同存在方式：
① F+
② F` ③ Hfr。
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基因工程中的质粒载体
克隆载体(cloning vector) : 使目的片段能在细菌细胞中复制的载体;
表达载体（Expression Vector ）: 使目的基因能在细菌细胞中表达为RNA或蛋白质的载体。
特点
具有更小的分子量 （2686bp）和更高 的拷贝数（500700）。 具有多克隆位点
适于组织化学 方法检测重组 体
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MCS
lacZ`
Ampr Ori
含四个部分：
1.来自pBR322的质粒复制起 点（ori）；
2.ampr ;
3.大肠杆菌β半乳糖苷酶基因 （lacZ）的启动子及其编码 α-肽链的DNA序列；
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目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由 少数几个野生型质粒构建的
pSC101 8.8 kb拷贝数5、四环素抗性标记基因 Ter
ColE1 6.5 kb拷贝数20 – 30、大肠杆菌内毒素标记 基
因 E1
RSF2124 ColE1衍生质粒、氨苄青霉素抗性标记基因
Apr
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pBR322载体
pBR322为4.36kb的环状双链DNA，其碱基序 列已经全部清楚。是最早应用于基因工程 的载体之一。把pBR322用限制性内切酶切 去某片段，换上合用的表达组件，就可以 构建成工作所需的新载体。
贝数；在不同的宿主细胞中拷贝数可能不同。 5. 复制转录的进行依赖于宿主编码的酶和蛋白质； 6. 常含有一些编码对细菌宿主有利的酶的基因。
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单链切割 连接
线性DNA （ linear ，lDNA）
开环DNA （ open circular， ocDNA）
单链切割 连接
共价闭合环形DNA （Covalent close
第三步：看多克隆位点（MCS）。看其限制性酶切 位点，决定能不能放目的基因以及如何放置目的基 因。
第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只 能容纳小于10Kb的外源DNA片段。
第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖 体结合位点－克隆位点－转录终止信号。
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克隆载体必备条件
1.具有复制起点 2.具有抗菌素抗性基因 3.具有若干限制酶单一识别位点 4.具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数
具有较小的相对分子质量(4363bp) 具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选 择记号(Ampr和Tetr) 具有较高的拷贝数（15个,松弛型）
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重组克隆的 “插入失活”筛选方法
pBR322—→插入在Tetr中，基因型为Tets 、Ampr—— →在含有氨卞青霉素培养基上可生长，在含有四环素培 养基上不生长； pBR322—→插入在Ampr中，基因型为Tetr 、Amps、— —→在含有氨卞青霉素培养基上不生长，在含有四环素 培养基可生长；
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P1 噬菌体载体和 P1 人工染色体载体
P1 噬菌体 ：大肠杆菌的一种溶原性噬菌体。 P1 噬菌体载体 工作原理类似黏粒载体 外源片断70-100kb
P1 人工染色体载体 P1 噬菌体载体的改造，结合了P1 噬菌体载体和 BAC载体的优点。 克隆外源片断130-150kb
（详细介绍）质粒载体
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噬菌粒载体的优点
1.具小分子量的共价、闭合、环状的基因基因组DNA，可克隆高达10 kb的外源DNA 2.有ampr 等基因作为选择记号 3.拷贝数高 4.存在多克隆位点,可克隆达10 kb的外源DNA 5.可用组织化学显色反应筛选重组子 6.具质粒复制起点，在无辅助噬菌体存在下，克隆外源基因可按质粒一样复制 7.有单链噬菌体复制起点，在有噬菌体辅助感染的宿主细胞中，可合成出单链DNA
载体介绍
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什么是载体？
简单说，载体就是将外源DNA或基 因携带入宿主细胞的工具。
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载体应具备的特征
1.在宿主细胞内必须能够自主复制（具备复制原 点）
2.具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点，供 外源DNA片断插入，同时不影响复制
3.有一定的选择标记，用于筛选 4.具有较高的拷贝数，便于载体的制备
穿梭载体（shuttle vector）： 装有针对两种不同受体的复制子，便于基因克隆。 这类载体可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和
表达。
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一个合格质粒载体的组成要素
复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点：原核 生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生 物DNA分子有多个复制起始位点。
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载体分类
按功能分：克隆载体 和 表达载体 按受体细胞类型分：原核载体， 真核载体，
穿梭载体 按构建克隆载体的DNA来源分：质粒载体，
噬菌体载体，cosmid克隆载体（柯斯质粒）， 噬菌粒载体，人工染色体载体等
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质粒载体
包括： 大肠杆菌质粒载体 枯草杆菌质粒载体 酵母质粒载体 农杆菌质粒载体 蓝细菌质粒载体
而在两种抗生素培养基上都生长的是非重组型。
这种在一个基因位点中插入外源DNA片段，从而使该 基因活性丧失的现象叫插入失活。
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外源基因的插入：
PstI Amp r Tet r
Amp s Tet r
重组体的筛选
...
..
.
. .
涂布有Tet的培养基
. .
. .