乙肝病毒cccDNA检测
HBVcccDNA定量检测在拉米夫定阻断乙肝病毒宫内感染中的应用价值
Ｈ Ｂ Ｖ ｃ ｃ ｃ Ｄ Ｎ Ａ可作为 Ｈ Ｂ Ｖ宫 内感染 的重要 指标 ， 同时也 能作为 评价母婴 阻断疗效 的 良好指标 ， 其检 测具有较 高
的临床 价值 ， 值得推广应用 。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
【 关键词】 乙型肝炎病毒； 疾病传播； 宫内感染； 拉米夫定 ； 共价闭合环状 Ｄ Ｎ Ａ 【 中图分类号】 Ｒ ５ １ ２ ． ６ ２ 【 文献标识码】 Ａ 【 文章编号】 １ ０ ０ ３ －６ ３ ５ ０ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ２ —Ｏ ２ ２ ３ —Ｏ ３
ｔ ｈ ｅ ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ ｇ ｒ ｏ ｕ ｐ（ ＝ ３ ２ ） ａ ｎ ｄ ｈｅ ｔ ｃ ｏ ｎ ｔ ｒ ｏ ｌ ｇ ｒ ｏ ｕ ｐ ｎ ＝ ２ ８ ） ． Ｂ ｌ ｏ ｏ ｄ ｓ ａ ｍｐ ｌ ｅ ｓ ｗｅ ｒ ｅ ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ａ ｔ ２ ８ ｗｅ ｅ ｋ ｓ ｇ ｅ ｓ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ， ｐ ｒ ｅ ｎ ａ ａｌ ｔ
组２ ８ 例， 孕 妇 均于 孕 ２ ８ 周、 产前 ， 产后 ２ ４ ｈ与产后 ３ 个 月采 血 ， 对Ｈ ＢＶ ＤＮ Ａ、 Ｈ ＢＶ ｃ ｃ ｃ ＤＮ Ａ水平 采用 Ｐ Ｃ Ｒ方法 进 行 检测 ， 并 收 集结 果 ， 同时收集 产 时胎盘 组 织 Ｈ ＢＶ ｃ ｃ ｃ ＤＮＡ定量 结果 及 宫 内感染率 ， 对两 组数 据进 行分 析 。 结果 治疗组 孕妇在孕 ２ ８ 周 检测 ＨＢ Ｖ － Ｄ ＮＡ、 ＨＢ Ｖ ｃ ｃ ｃ ＤＮＡ水平 与对 照组 比较 ， 差异无 统计学 意义 （ Ｐ ＞ ０ ． ０ ５ ） ； 治 疗 组孕 妇在产前 ， 产后 ２ ４ ｈ 与产后 ３ 个 月 ＨＢ Ｖ － Ｄ ＮＡ、 ＨＢ Ｖｃ ｃ ｃ Ｄ ＮＡ水平及 产时胎 盘组织 Ｈ Ｂ Ｖｃ ｃ ｃ Ｄ ＮＡ水平 与对 照组 相 比 明显 不 同 ， 差 异 具有 统计 学 意义 （ Ｐ ＜ ０ ． ０ ５ ） ， 其新 生 儿 宫 内感 染 率 明显 低 于对 照组 （ Ｐ ＜ Ｏ ． ０ ５ ） 。 结 论
乙肝病毒相关终末期肝病患者肝移植术后外周血HBVcccDNA检测
现 代 检 验 医学 杂 志
第２ ３卷
第 ３期
２ ０ 年 ５月 ０８
ＪＭｏ ａ ｄ， １２ ， ． ， ｙ ２ ０ ｄＬ ｂＭｅ Ｖｏ． ３ Ｎｏ ３ Ｍａ ． ０ ８
６９
乙肝病毒相关终末期肝病患者肝移植术后 外周血 ＨＢ ｃＤ Ｖｃｃ ＮＡ检测
吴 月平 ， 勇武 ， 凌 王世 蓬 ， 罗文 明， 黄松 平 ， 吴 萍 ， 刘先 进 ， 韩 刚 ， 陆军 王 （ 南通 市第三 人 民 医院 ， 苏南通 ２ ６ ０ ） 江 ２ ０ ６
摘要 ： 目的 通 过 外 周 血 ＨＢ ｃＤ Ｖｃｃ ＮＡ 与 ＨＢ Ｄ Ｖ ＮＡ 及 Ｈ ＶＭ 的 相 关 性 检 测 分析 ， 讨 乙肝 病 毒 相 关 终末 期肝 病 患 者 原 Ｂ 探
～
１ ３ 方 法 血 清 ＨＢ Ｄ ． Ｖ— ＮＡ 含量 检 测 和 白细胞 中 ＨＢ ｃＤ Ｖｃｃ ＮＡ 检 测 分别 采用 竞 争 Ｐ Ｒ 微 流 芯 Ｃ 一 片 法和 Ｐ Ｒ一 流芯片 法 （ Ｃ 微 上海 浩源公 司试剂 ） 。取 １ ０ ＤＴ Ｋ２ 凝 全 血 加 １ ０ 红 细胞 裂 解 ０ １ Ｅ Ａ— 抗 ０ １ 液， 生理 盐水 洗 涤 、 淀 白细胞 排 除血 清 中 ｒＤ 沉 ｃ ＮＡ 干 扰 （ 次 洗 涤 直 至洗 液 中检 测 不 到 ＨＢ ＮＡ 多 ＶＤ 等 ） 病 毒 裂 解 后 采 用 酚一 仿 抽 提 ， ， 氯 根据 ｃｃ ｃＤＮＡ 与 ｒＤＮＡ 结 构 的不 同 ， 引 物 分别 设 计 在 ＨＢ ｃ 将 Ｖ一 ＤＮＡ 负 链 缺 口的两 侧 ； ｆｇｏ ｉ 为全 血 中 自 以 ｝ ｌｂｎ作 ＿ 细 胞 提取成 功 与否判 断依据 。 清 中 ＨＢ ｃＤＮＡ 血 Ｖｃｃ 检 测采 用 荧 光 Ｐ Ｒ 法 （ 海 复 星 长 征 试剂 ） ＨＢ Ｃ 上 ， 一 ＶＭ 检 测 采 用 ＭＥ Ａ 法 （ 剂 由美 国雅 培 公 司提 Ｉ 试 供 ）血 清 ＨＢ ， ＶＹＭＤ Ｄ检 测采 用 Ｐ Ｒ 微 孔板 杂交 Ｃ 一 法（ 上海 浩源 公 司试 剂 ） 。 １ ４ 统 计 学分析 ． ２ 结果 采用 ｔ 检验 。
cccDNA是乙肝检测的最权威指标
龙源期刊网 cccDNA是乙肝检测的最权威指标作者：刘士敬来源：《家庭医学》2010年第08期研究发现，细胞外的乙肝病毒DNA是一种松弛环状的双链DNA分子，其两条链均不是闭合的，其中负链较长，有数个碱基的“缺刻”；正链较短，有较大的“缺口”。
在乙肝病毒的复制过程中，病毒DNA进入宿主细胞核，在DNA聚合酶的作用下，两条链的缺口均被补齐，形成超螺旋的共价、闭合、环状DNA分子(英文简称cccDNA)。
cccDNA是乙肝病毒前基因组RNA复制的原始模板，虽然其含量较少，每个肝细胞内只有约5～50个拷贝，但对乙肝病毒的复制以及感染状态的建立具有十分重要的意义。
近年来，国内一些大医院已建立了可靠的检测方法。
评价慢性乙肝抗病毒治疗疗效目前考核抗病毒药物疗效的标准，都是建立在乙肝病毒被抑制或可能被清除的间接评价指标之上，比如，病毒DNA达到不可测水平、HBeAg消失或血清转换、HBsAg消失或血清转换等。
只有彻底清除了细胞核内的cccDNA，乙肝病毒复制的基础不复存在了，才是真正治愈了乙肝。
可见，考核抗病毒治疗的最终疗效标准，应该是清除cccDNA，其他任何指标与之相比只能是“次要”标准。
有研究表明，在血清HBsAg被清除的乙肝病毒感染者中，肝细胞内仍有cccDNA存在。
但清除cccDNA的过程比较漫长，需要较高的社会和经济成本，而且在现有条件下进行长期治疗，伴随的必然是药物不良反应的增加以及病毒耐药突变等。
因此，是否把清除cccDNA作为治疗终点，还需要进行更多的研究。
筛选抗病毒药物目前的抗病毒药物均不能有效清除CCCDNA，因此，开发新的、能清除CCCDNA的药物是患者和医生共同的期待。
遗憾的是，CCCDNA分子在细胞内形成的一些关键环节，目前还不清楚或存在争论。
如果能阐明这些环节，将有助于指导开发新的、能够清除eecDNA的抗病毒药物。
评价乙肝病毒复制的模型一种细胞或动物模型能否支持乙肝病毒复制，cccDNA可以作为一个较好的评价指标。
乙肝DNA测定结果如何解读
乙肝DNA测定结果如何解读乙肝DNA测定结果的解读：乙肝DNA测定是一项用来检测乙型肝炎病毒是否存在于体内的重要检测手段。
其结果可分为阳性和阴性两种，具体解读如下：1、乙肝DNA测定结果为阴性：表示体内没有乙型肝炎病毒或病毒数量很少。
此时，患者有可能已经从疾病中恢复或处于病毒携带者状态。
2、乙肝DNA测定结果为阳性：表示体内存在乙型肝炎病毒。
阳性结果的大小表示病毒载量的多少，数字越大，病毒载量越高。
数字越小，病毒载量越低。
当病毒载量高时，就需要进行相应的治疗。
乙肝DNA测定的治疗方法：目前，治疗乙肝感染的方法主要是药物治疗以及疫苗预防。
药物治疗依靠抗病毒药物来抑制病毒复制，达到稳定病情、控制病毒、防止病情恶化等效果。
常用的抗病毒药物有：拉米夫定、爱地华、恩替卡韦等。
疫苗预防是针对乙型肝炎病毒产生抗体，从而达到预防感染的目的。
乙肝DNA测定的注意事项：1、准确性：乙肝DNA测定的结果应该由专业医生来解读，因为误判会对治疗方案产生影响。
2、重要性：乙肝DNA测定是乙肝治疗的一个关键指标，检测结果直接关系到患者治疗的方向和疗效。
3、检测周期：乙肝DNA测定结果不是一次就能确定的，需要定期测定。
一般来说，至少每半年进行一次测定，以保证治疗的有效性和及时处理病情。
4、治疗方案：乙肝治疗除了要考虑病毒载量外，还需要注意患者的肝功能情况、乙肝病期、合并症等因素，因为不同的患者情况需要的治疗方案是不同的。
5、生活习惯：患者在治疗期间应该注意生活习惯，比如不要喝酒，不要吃刺激性食物，同时保持充足的休息，加强身体锻炼，避免感染其他疾病。
乙肝核心抗体阳性是不是曾经感染能跟他吃饭乙肝核心抗体阳性是什么意思？乙肝核心抗体（HBcAb）是乙型肝炎病毒感染后体内产生的抗体之一，其出现表明人体曾经感染过乙型肝炎病毒。
乙肝核心抗体阳性的患者可以被诊断为曾经患有乙型肝炎，但并不一定表示这个人正在患有乙型肝炎。
跟乙肝核心抗体阳性的人吃饭是否安全？乙肝核心抗体阳性的患者可以跟大多数人一样吃饭，因为乙肝病毒不通过空气、水、食物传播。
乙肝病毒DNA检测Microsoft Word 文档
乙肝病毒DNA检测乙肝病毒DNA指的是脱氧核糖核酸，病毒的复制是靠DNA的复制来完成的，DNA的浓度越高，病毒的复制越活跃。
合起来，HBV-DNA指的就是乙肝病毒的脱氧核糖核酸。
乙肝病毒DNA检测是判断乙肝病毒复制的常用手段。
一般的，把数值大于10的3次方为阳性，把3-5次方认为是低量复制，5-7为中等量，大于7次方为大量。
乙肝两对半并不能准确的判断病毒复制情况，DNA弥补了这个的不足。
不过由于DNA检测技术要求严格，容易受到干扰，因此，一次结果不足以说明问题，遇到阳性，可以换医院再次检查。
目录1DNA检测2作用3临床意义4复制过程▪第一步：黏附▪第二步:脱壳▪第三步：入核▪第四步：转录▪第五步：翻译▪第六步：逆转录▪第七步：组装5频率6注意事项7检测方法8检测报告9检测费用10检测要空腹吗11乙肝病毒DNA检测的作用1DNA检测以往乙肝患者抗病毒治疗的指征是：乙肝病毒e抗原阳性（大三阳）患者HBVDNA数值要求达到10的5次方拷贝/毫升（20000U/ml），乙肝病毒e抗原阴性（小三阳）患者乙肝病毒DNA数值要求达到10的4次方拷贝/毫升（2000U/ml），但是10的4次方拷贝/毫升以下也不能认为就没有问题了，最新的国际研究资料表明：和肝脏疾病进展相关的病毒DNA水平域值尚不清楚，即使HBVDNA水平持续低于20000U/ml，也可能乙肝病毒情仍在进一步发展，因此HBVDNA数值应该越低越好，目前国际建议的HBVDNA检测正常值应该是：< 50U/ml 。
2作用目前，乙肝病毒DNA检测在乙肝检查化验中使用的越来越普遍，可见乙肝病毒DNA检测在乙肝检查化验中占的分量越来越重，这是因为乙肝病毒DNA检测对确诊乙肝和评估乙肝治疗效果具有十分重要的作用。
主要表现在以下七个方面：1、了解乙肝病毒在体内存在的数量。
2、乙肝病毒是否复制。
3、乙肝是否传染，传染性有多强。
4、是否有必要服药。
5、肝功能异常改变是否由病毒引起。
乙型肝炎患者血清HBV cccDNA检测的临床意义
１ 材 料 与 方 法
１ １ 病例选 择 ．
选 取本 院 ２ ０ 年 ６月 至 ２ ０ 年 ５月住 院 乙型 ０５ ０６
肝 炎患 者 １ ２例 ， １ ８例 ， １ ６ 男 ４ 女 ４例 ； 龄 １ ～ ６ 年 ６ ８
提 供 。主要检 测 仪器 为美 国产 Ｆ Ｃ ２ ０ Ｔ 一０ ０荧 光 Ｐ Ｒ Ｃ 检测 仪 ， 国 Ｃ ｄ 美 ｏ ａ全 自动 酶 免 分 析 仪 。实 验 操 作 步骤 按试 剂盒 说 明书 要求 进行 。
１ ３ 统 计学 处理 ． 采用 Ｙ 检 验 。
因组 复制 中间 体 ｍＲ ＮＡ 和 前 基 因组 Ｒ ＮＡ 的合 成
（ ｅ 、 Ｖ ＮＡ） ＨＢ Ａｇ ＨＢ Ｄ 的关 系 。方 法
检测 １ ２ 乙 型肝 炎 患 者 外 周 血 清 中 ＨＢ ｃＤ ６例 Ｖ ｃｃ ＮＡ 定 量 、 Ｖ ＤＮＡ 定 量 和 乙 型 肝 炎 病 毒 标 志 物 。 结 果 １ ２例 ＨＢ ６ 乙型肝炎患者 ， 血清 ＨＢ ｃＤＮ 阳性 率 为 ４ ． ５ （８ ６ ） ＨＢ ｃＤ Ｖ ｃｃ Ａ ８ １ ７／ ２ 。 Ｖ ｃｃ ＮＡ 阳性 率 在 ＨＢ ＮＡ 阳 性 患 者 中 为 ＶＤ
维普资讯
・４ ・
实用 临床 医学 ２ ０ ０ ８年 第 ９卷 第 ７期
Ｐ ａ ｔ ａ Ｃ ｉ ｉ ｌ ｅ ｉ ｎ ，２ ０ ， ｏ ９ Ｎ ７ ｒ ｃｉ ｌ ｌ ｃ ｄ ｃ ｅ ０ ８ Ｖ ｉ ， ｏ ｃ ｎ ａＭ ｉ
乙型 肝 炎 患 者 血 清 ＨＢ ｃＤＮ 检 测 的 临 床 意 义 Ｖ ｃｃ Ａ
HBV cccDNA检测技术进展
Ｈ Ｖ 基 因组 结 构 及 ｃｃ Ｎ 的 形 成 Ｂ ｃＤ Ａ
细胞外乙型肝炎病毒 Ｄ Ａ是一种松弛环状的双 Ｎ 链 Ｄ Ａ （ｅ ｘ ｄｃｒ ｌ Ｎ Ｎ ｒｌ ｅ ｉ ｕａ Ｄ Ａ，ｒＤ Ａ 分子 ，其 两 ａ ｃｒ ｃＮ ） 条链均不闭合 ， 其中负链较长 ，约 ３０ ２０个碱基，含 有 乙肝病 毒 基 因组 的全 长基 因 ，在其 ５ ’起 始 端 与
胞 内 保 持 一 个 动 态 平 衡 水 平 ，形 成 一 个 Ｈ Ｖ Ｂ
ｃｃ Ｎ ｃＤ Ａ池 。
ｃｃ Ｎ ｃＤ Ａ检测 的分子 基础
乙肝 病毒在 一个 完整 的生活周期 中有多 种 同源
度和特异性 ，而新 的荧光探针和荧光引物技术使准 确 检测 ＨＢ ｃＤ Ａ成为可 能 。 Ｖｃｃ Ｎ
中图分类号 ：Ｒ １． ２ ５２６
陈保德 陈瑜 审校
文献标识码 ：Ａ 文章编 号：１ ０ ０ ３ （０ ０ ５—０ １ ０ ０７－ ９ １ ２ １ ）０ ０ ９— ４
乙型 肝炎 病 毒共 价 闭合 环 状 Ｄ Ａ （ ｅａｔ Ｎ ｈｐｔｉ Ｂ ｉｓ
ｖ ｕ ｏａ ｎｌ ｃ ｓｄ ｃ ｃｌｒＤ Ａ，Ｈ Ｖ ｃＤ Ａ） ｉ ｓｃｖｌ ｔ ｌ ｅ ｉ ｕａ Ｎ ｒ ｅ ｙ ｏ ｒ Ｂ ｃｃ Ｎ
浙江预防医学 ２ １ ００年第 ２ ２卷第 ５期
Ｚ ￣ ａｇＰｅｅｔｅＭｅｉ ｎ ，Ｍａ ００，Ｖ ｌ ２ ｏ５ ｈ ｉ ｒ ｎｉ ｄｃ ｅ ｎ ｖ ｖ ｉ ｙ １ ２ ｏ ２ ，Ｎ ．
・
１ ・ ９
・
综述 ・
Ｈ Ｖ ｃｃ Ｎ Ｂ ｃＤ Ａ检 测 技 术 进 展
齐雪芬 徐 益 飞 综 述
３ ’末 端 之 间 有 一 个 包 含 数 个 碱 基 的 “ 刻 ” 缺
乙肝病毒cccDNA检测
1.选择性PCR
选择性PCR：rcDNA不被扩增
选择性PCR：cccDNA能被扩增
“选择性”PCR：并非万无一失
PCR产物自身退火（self annealing）
rcDNA被大量扩增，阳性结果不可靠，定量结果也不可靠
Hepatology Research 2003;15: 234-243（PBMC）
解决方案
特异性抽提分离cccDNA与其它形式的病毒DNA 采用沉淀法或质粒抽提试剂盒抽提法 酶切纯化cccDNA 采用绿豆核酸酶或ATP依赖的plasmid-safe DNA酶
选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA
选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR) 侵入者探针法（Invader assaay）
P2
cccDNA能被扩增 检测到荧光信号
选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA
实时荧光定量PCR的原理
实时荧光定量PCR的原理
实时荧光定量PCR的原理
选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA
结果 ： 标准曲线方程YCtcopy 相关指数： R2=0.995 灵敏度至少可以达到103copy/ml
与定性法比较增加了一个荧光探针，探针位于扩增片段区（负链缺口下游），与cccDNA的负链互补。
01
选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA
02
rcDNA不能被扩增 无荧光信号
EcoR I
5‘
+
P1
P2
3200(1)
5‘
3‘
1590
3‘
1820
P1
1820
1590
+
3200（1）
EcoR I
World J Gastroenterol 2004;10(1):82-85(血清)
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分离cccDNA和rcDNA的分子基础
cccDNA 核酸一级结构 完整的双链 rcDNA 两条链均不完整
核酸空间结构
是否与蛋白质结合
闭合环状，超螺旋 松弛环状，非超螺旋
不结合 共价结合 弱，容易被降解
对某些核酸酶抗性 强，不容易被降解
分离cccDNA和rcDNA的任何手段均基于上述差异
二、HBV cccDNA检测技术
持恒定(5－50copy/cell)
病毒自身调节：关于病毒的进化
关于病毒的“思维”
病毒自身的调节
外来压力：打破病毒含量自身恒定的结果
2.抗病毒药物对cccDNA的影响
现有抗病毒药物，包括干扰素和各种核苷类 似物，可以一过性地减少cccDNA，但均不能
清除cccDNA
细胞核内cccDNA含量的相对稳定性，决定了 长疗程抗病毒治疗的必要性
侵入者探针法定量检测cccDNA的优缺点
优点：线性信号放大，特异性比荧光 PCR法强 缺点：灵敏度低：104copy/ml
现有的几种cccDNA检测技术简介
1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR) 2.侵入者分析法（Invader assaay） 嵌合引物荧光PCR法
3. 嵌合引物荧光PCR法
无论是选择性荧光PCR，还是侵 入者探针法或嵌合引物荧光PCR，
本身都不能解决在高rcDNA背景条
件下的假阳性问题，必须结合抽提
分离、酶切纯化等步骤，以提高特
异性。
三、影响cccDNA池的因素
cDNA池的自身恒定
cccDNA池：感染肝细胞核内HBV cccDNA的
含量在无外来干扰的情况下保
105~107copy/ml携带者血清
选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA
解决方案
特异性抽提分离cccDNA与其它形式的病毒DNA
采用沉淀法或质粒抽提试剂盒抽提法
酶切纯化cccDNA
采用绿豆核酸酶或ATP依赖的plasmid-safe DNA酶
现有的几种cccDNA检测技术简介
1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR) 侵入者探针法（Invader assaay） 3.嵌合引物荧光PCR法
1820
1820
rcDNA不能被扩增 无荧光信号
cccDNA能被扩增
检测到荧光信号
实时荧光定量PCR的原理
实时荧光定量PCR的原理
实时荧光定量PCR的原理
选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA
结果 ：
标准曲线方程YCt= 42.0827-3.5554logXcopy 相关指数： R2=0.995 灵敏度至少可以达到103copy/ml
3.肝外组织也是cccDNA的储存池？
·肝外组织细胞中HBV标志的存在情况： 肾、胰腺、肺、心肌、心包膜、胃肠黏 膜、皮肤、睾丸、前列腺、唾液腺 等组织或细胞中均检测到HBV的标志物 ·HBV吸附？暂居？建立感染状态？ 依据：从上述组织细胞中检测到cccDNA， 但必须解决检测技术问题
(2)关于血清中是否存在cccDNA的问题
建立cccDNA检测技术必须克服的难点
·多种同源的乙肝病毒DNA分子并存(cccDNA、 rcDNA、ssDNA、整合的HBV DNA），必须有 效地分离cccDNA和其他类型的病毒DNA ·如何进一步解决特异性的问题？ ·如何解决灵敏度不高的问题（细胞内cccDNA 含量的较低），血清中含量？ ·如何简化检测步骤？
3’
+
rcDNA 5’
+
cccDNA
p 3’ 5’ N：与HBVDNA非同源片段 N N
P
Shao, et al. J Virol Methods 2003； 112：45-52
3. 嵌合引物荧光PCR法
3’
5’ N P2
5’
N
P
3’
嵌合引物荧光PCR的优缺点
优点：克服了荧光PCR法的部分缺陷，灵敏 度比侵入法提高 缺点：仍不能完全避免待测标本中存在的 rcDNA被非特异性扩增
· “血清中rcDNA含量越高，cccDNA阳性率 越高和含量越高”的现象，使我们对方法 学提出质疑 ·肝衰竭的病人在一定病期有可能大量释放 cccDNA入血 ·细胞坏死后，cccDNA释放入血是必然的， 但是，裸露的核酸分子在血清中存在多少 时间？
肝脏以外器官组织细胞可能存在cccDNA，成为肝脏
移植术后乙肝复发的来源
还没有稳定、可靠、敏感的cccDNA检测试剂盒问世
为什么没有cccDNA检测试剂盒问世?
·研究和开发该检测技术的时间不长 ·检测技术上的难度较大 ·前期研究主要集中于细胞模型和动物肝脏 模，不能满足临床检验的需求 ·现有技术灵敏度不高，检测低限104 copy /ml左右 ·分研究机构和学者对检测技术的特异性认 识不足，存在缺陷
选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA
与定性法比较增加了一个荧光探 针，探针位于扩增片段区（负链缺口 下游），与cccDNA的负链互补。
选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA
3200(1) EcoR I 3‘ 3200（1） EcoR I
+
P2
+
1590 5‘ 3‘ 5‘
P1 P2
1590
P1
乙 型 肝 炎 病 毒 基 因 组 结 构 示 意 图
乙 型 肝 炎 病 毒 的 复 制 过 程
我们为什么要关注HBV cccDNA?
cccDNA存在于细胞核内，成为乙肝病毒的复制“池
”
目前尚没有可以进入细胞核内，并能够清除cccDNA
的药物，这也是现有抗病毒药物治疗效果不佳和治 疗后容易复发的原因之一
现有的几种cccDNA检测技术简介
1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR) 2.侵入者探针法（Invader assaay） 3.嵌合引物荧光PCR法
现有的几种cccDNA检测技术简介
选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR) 2.侵入者探针法（Invader assaay） 3.嵌合引物荧光PCR法
选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA
缺陷：
·同样存在PCR产物自身退火引起的rcDNA 非特异性扩增的问题
·由于灵敏度较普通PCR高，假阳性率比普
通PCR更高
选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA
质粒标准品107copy/ml
质粒标准品105copy/ml
3.5×108copy/ml携带者血清
“选择性”PCR：并非万无一 失 Kock等：反应管中rcDNA含量不能超过105copy
Hepatology 1996;23:405-413
血清HBV rcDNA超过108copy/ml，进行荧光PCR 可能会出现检测结果假阳性
rcDNA被大量扩增，阳性结果不可靠，定量结 果也不可靠
Hepatology Research 2003;15: 234-243（PBMC） World J Gastroenterol 2004;10(1):82-85(血清)
2.侵入者探针法(Invader assay)
两个体系：
两 种 特 殊 的 探 针 ： invader probe 和 primary probe，后者含与待测模板无关的5’侧翼的碱基片段。
荧光共振能量转移系统：被核酸内切酶Ⅰ (cleavase,裂解酶)特异地切割5’侧翼碱基片段作为第 二个invader，与荧光共振能量转移盒（FRETC）结合 ，裂解酶切割FRETC上含有荧光基团的短臂，发出荧光 信号。 特点：一个模板可以重复使用，每“结合—裂解—结 合—裂解”一次为一个循环，每循环一次产生一个荧 光信号，呈线性信号放大
乙型肝炎ห้องสมุดไป่ตู้毒cccDNA
——检测方法与应用价值
一、几个相关问题简介
什么是HBV cccDNA?
即 共 价 闭 合 环 状 DNA （ covalently
closed circular DNA)。乙肝病毒感染宿
主细胞后在细胞内复制并建立感染状态，
病毒松弛环状DNA（rcDNA）进入细胞核， 利用宿主DNA聚合酶和拓扑酶等“修复”形 成的、结构完整的、超螺旋双链DNA分子。
1.选择性PCR
设计一对特殊引物：跨双缺口引物 正义引物P1 ：与负链互补结合，位于正 链缺口上游
反义引物P2 ：与正链互补结合，位于负
链缺口下游
目的：rcDNA不被扩增
选择性PCR：rcDNA不被扩增
选择性PCR：cccDNA能被扩增
“选择性”PCR：并非万无一 失
PCR产物自身退火（self annealing）