HBV-DNAPCR检测规程
乙肝病毒核酸检测(金豪)作业指导书
HBV-DNA检测（PCR）作业指导书1. 目的：规范本中心对乙型肝炎病毒DNA定量检测的方法细则。
2. 范围：乙型肝炎病毒DNA定量检测。
3. 职责：3.1 检测人员：负责按照本检测细则对被检样品进行检测。
3.2 复核人员：负责对检测操作是否规范以及检测结果是否准确进行复核。
3.3 科室负责人：负责对科室综合管理和检测报告的签发。
4. 方法：实时荧光PCR法5. 仪器：博日FQD-48(M4)荧光定量PCR仪6. 试剂与材料6.1 试剂来源：北京华大吉比爱生物技术有限公司，试剂有效期为12个月。
6.2 材料：PCR所使用的吸管、试管、加样枪头以及微量离心管都应一次性使用。
特别是微量离心管和试管都应为无菌。
6.3 可调移液器（0.5～10ul、10～200ul、100~1000ul）应该用重量法效正后再使用。
7．操作步骤7.1 样本要求：7.1.1、血清：1600rpm20分钟分离全血取血清；7.1.2、血浆：EDTA抗凝剂，1600rpm20分钟，分离血浆。
7.2样本处理7.2.1、待测血清/血浆及对照个100ul，分别加至1.5ml离心管中；7.2.2、再加100ul浓缩液，振荡混匀，13000rmp10分钟，弃上清液；7.2.3、然后加入10ul内参对照品，50ul核酸提取液；7.2.4、100℃干浴或沸水浴10分钟，13000rmp离心10分钟，吸取上清液备用。
7.3扩增试剂准备7.3.1、核酸反应液振荡混匀，2000rpm10秒；7.3.2每管加入反应液25ul；(样本数+1管阴性对照+1管强阳性对照+1管弱阳性对照+4管工作标准品)7.3.3加样：加入处理过的样品个5ul，盖紧管盖，2000rpm10秒。
7.4 PCR 扩增反应程序如下：仪器检测通道选择：HBV发光荧光基团为FAM,淬灭荧光基团为TAMAR荧光素,参考荧光基团为Rox荧光基团。
8. 结果判断：分析软件自动结合,4个定量校准品制定标准曲线，并计算各样品的结果。
HBVDNA核酸扩增及产物分析标准操作程序
HBV-DNA核酸扩增及产物分析标准操作程序一、目的：规范实验室操作，正确使用ABI-5700荧光定量PCR仪进行HBV-DNA扩增分析，以保证实验结果的准确性。
二、适用范围：乙型肝炎病毒(HBV)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒、ABI-5700荧光定量PCR仪。
三、职责：由临床基因扩增检验实验室专业技术人员制定程序文件，实验室负责人审核，科室主任批准实施。
四、程序：1、PCR扩增1）打开稳压器电源，再打开计算机电源。
2）打开扩增仪电源，按仪器操作规程进入扩增循环条件设定。
3）将循环条件设定为4）检查反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。
5）将待反应的PCR反应管放入扩增仪中，并根据实际情况和仪器操作规程在程序中设定好反应孔位置。
6）关闭扩增仪盖，按仪器操作规程开始循环。
7）扩增结束后先保存结果，再关闭扩增仪电源，取出PCR 反应管，密封放入垃圾桶。
2、产物分析1）基线的确定：取3～8个循环的荧光信号。
2）阈值的设定：原则以基线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。
3）对照标准：阳性对照参控品的Ct值应小于28，标准曲线的拟和度应大于等于0.990，否则视为定量结果无效；阴性、空白对照的扩增曲线应平坦，Ct值等于30或0，否则结果无效。
4）结果判断：检测样本中核酸阳性时，按实际结果报告；对可疑结果应复查，需要时与临床联系。
5）填写检验记录，关闭计算机。
此标准操作变更程序：如果本操作程序使用者在实际工作中发现其存在问题，则应向科室负责人提出，科室负责人则召集所有与本程序有关的人员讨论，以决定是否需要变更本程序。
乙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书
乙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书-模板1.目的采用PCR技术、实时荧光探针技术，用于临床血清或血浆标本中的乙型肝炎病毒核酸的定量检测，或用于乙型肝炎的辅助诊断和抗病毒药物治疗中的疗效观察。
2.范围适用于乙型肝炎病毒核酸（HBV DNA）定量检测（PCR-荧光探针法）。
3.职责3.1操作人员：负责标本制备检测、仪器操作、报告发送。
3.2专业组组长：负责本组耗材的请购，监督本组标本检测、仪器操作、报告发送、质控管理等各方面工作。
3.3实验室主任：负责监督和指导实验室各方面工作。
4.原理采用荧光PCR技术，以HBV基因组中相对保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，在样品核酸纯化之后，通过荧光定量PCR对HBV DNA进行扩增，并检测荧光信号，仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线，根据阈循环值（CT）实现对未知样品的检测。
另外，本试剂盒带有内标物质，用于对核酸提取的整个过程进行监控，减少假阴性结果的出现。
5.样品要求5.1适用样品类型：血清或血浆。
5.2样品采集：5.2.1血清用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2:^，注入无菌的真空采血管中（未加抗凝剂），室温（22-25℃）放置30-60min血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1500rpm离心5min，吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管。
5.2.2血浆用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml，注入含EDTA （乙二胺四乙酸二钠）抗凝剂的真空采血管，立即轻轻颠倒混匀5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，5-10min后分离血浆于无菌的1.5ml 灭菌离心管。
5.3样品保存和运送使用专用样品0c冰壶送检，温度约维持在4℃左右。
分离后的血清或血浆可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月。
5.4拒收样品：拒绝重度溶血样品、肝素抗凝的血浆。
6.仪器和试剂6.1仪器AB7500核酸扩增仪、恒温金属浴、生物安全柜、低温离心机等。
乙肝病毒核酸检测实验操作流程
原理图
每产生一条DNA链，就切断一条探针 每切断一条探针，就产生一个荧光信号 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比
操作流程
一、标本采集
一次性无菌注射器抽取 受检者静脉血2毫升，注 入无菌的干燥玻璃管 用一次性无菌注射器抽取 受检者静脉血2毫升，注 入含EDTA或枸橼酸钠抗凝 剂的试管
血 清 的 采 集
93℃ 30秒→55℃ 45秒→30个循环
结果分析
1.
2.结果读取
3.结果报告
结果的报告必须简单清楚 定量测定则必须报告量的多少 1、结果高于测定方法线性范围上限，可报告>多少； 也可对样本稀释后再测，结果乘以稀释倍数 2、结果低于方法的测定范围下限，则报告多少即可， 不能报告“0”或阴性
乙肝病毒核酸检测 实验操作流程
广西临床检验中心 唐 娟
主要内容
HBV-DNA的检测原理
标本采集
HBV-DNA操作流程
DNA 提取 PCR 扩增
HBV-DNA检测结果分析
临床意义
检测原理
HBV ： 用一对乙型肝炎病毒特性引物（Primer）和一
条乙型肝炎病毒特异性荧光探针，配以PCR反
应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、四种脱氧 核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩 增法定量检测乙型肝炎病毒DNA
室温（22～25ºC）放置 30～60 分钟血标本使用 水平离心机，4000转/分 离心5分钟
血 浆 的 采 集
立即轻轻颠倒玻璃管混合 5～10次，使抗凝剂与静 脉血充分混匀
吸取上层血清，转移至 1.5ml灭菌离心管
5～10分钟后即可分离出 血浆，转移至1.5ml灭菌 离心管
HBV-DNAPCR检测规程
1 目的规范LightCycler荧光PCR检测仪检测乙型肝炎病毒（HBV-DNA）的检验工作，指导检验人员正确进行乙肝病毒核酸定量的检测，保证检验结果的质量。
2 范围本规程适用于LightCycler荧光PCR检测仪检测乙型肝炎病毒（HBV-DNA）3 试剂中山大学达安基因公司乙肝病毒(HBV)核酸扩增荧光检测试剂盒4 仪器Roche LightCycler荧光PCR检测仪高速台式冷冻离心机微量加样器（覆盖1-1000μl）5 样品处理样品处理按《PCR实验室标本处理规程》进行收集和处理，具体操作见本规程附录1和附录2。
6 测定6.1 PCR扩增6.1.1 打开稳压器电源，再打开计算机电源。
6.1.2 打开扩增仪电源，按仪器操作规程进入扩增循环条件设定。
6.1.3 将循环条件设定为：6.1.4 检查反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。
6.1.5 将待反应的PCR反应管放入扩增仪中，并根据实际情况和仪器操作规程在程序中定好反应孔位置。
6.1.6 关闭扩增仪盖，按仪器操作规程开始循环。
6.1.7 扩增结束后关闭扩增仪电源，取出PCR反应管，密封放入垃圾桶。
6.2 产物分析6.2.1 条件设置：反应结束后自动保存检测数据文件，调整荧光数值为F1/F2。
点击Quantification读取结果。
6.2.2 基线的确定：取3～8个循环的荧光信号。
6.2.3 噪声容限（阈值）：调节在阴性质控品以上，要求在Step3：Analysis下相关性r值＜-0.97，接近-1.0。
6.2.4 对照标准：保证阴性质控品的Ct值不出现任何数值（默认为40）。
6.2.5 最后记录仪器自动分析计算出的未知标本数值（M），关闭计算机。
7结果判断7.1 如果Ct值＝40，则实验样品的UU DNA含量（基因拷贝数/ml）＜1×103。
7.2 如果Ct值＜40，则实验样品的UU DNA含量（基因拷贝数/ml）＝ M7.3 检测样本中核酸阳性时，按实际结果报告；对可疑结果应复查，需要时与临床联系。
PCR检测HBV DNA - 滁州中心血站
一、检测对象
本院住院、门诊及外院送来的HBV-M检 测阳性血清标本
二、HBV PCR杂交酶联定量检测
• 试剂： 由上海浩源生物科技有限公司提供，按 说明书进行标本预处理、核酸扩增、杂交 检测和实验结果判断等步骤进行，每步操 作都必须严格按说明书操作，否则都可导 致结果无法判断。
二、HBV PCR杂交酶联定量检测
PCR检测HBV DNA
滁州市第二人民医院 谢瑞玉
摘 要
通过乙型肝炎病毒（HBV）核酸扩增 （PCR）酶联免疫吸附试验（ELISA）定量 检测HBV-M阳性标本中的HBV DNA数量， 可以反映HBV真实感染和复制状态，结合 HBV DNA含量测定判断HBV病毒复制状态， 对乙型肝炎的辅助诊断、治疗及判断预后具 有重要的指导意义。
四、讨Байду номын сангаас
论
谢 谢！
• 仪器和实验条件 伯乐公司生产的基因扩增仪和芬兰生产的 酶标仪，实验室必须严格区分三个区域， 即前PCR室，样品制备室和后PCR室。
三、结 果
我们分别对“大三阳”、“小三阳”及 “一五阳”组进行了统计，结果显示“大 三阳”组阳性率为100％且拷贝数范围在 105~109/ml，“小三阳”组阳性率为52％， “一五阳”组阳性率为66％
[医学]乙肝病毒核酸检测实验操作流程
![[医学]乙肝病毒核酸检测实验操作流程](https://img.taocdn.com/s3/m/88d373c2172ded630b1cb63b.png)
主要内容
HBV-DNA的检测原理
HBV-DNA操作流程
标本采集 DNA 提取
PCR 扩增
HBV-DNA检测结果分析
临床意义
检测原理
HBV ：
用一对乙型肝炎病毒特性引物（Primer）和一 条乙型肝炎病毒特异性荧光探针，配以PCR反 应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、四种脱氧 核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩 增法定量检测乙型肝炎病毒DNA
结果分析
1.
2.结果读取
3.结果报告
结果的报告必须简单清楚
定量测定则必须报告量的多少 1、结果高于测定方法线性范围上限，可报告>多少； 也可对样本稀释后再测，结果乘以稀释倍数 2、结果低于方法的测定范围下限，则报告多少即可， 不能报告“0”或阴性
临床意义
1、诊断早期乙型肝炎，提高HBV检测阳性率。 2、判断HBV的传染性及病毒复制情况，综合血清学指
三.PCR 扩增步骤
取上清液2ul点样 ↓↓ 8000rpm离心数秒 ↓↓ 按顺序放进扩增仪微孔中
↓↓
编辑软件，设置循环条件
↓↓
保存文件，运行
注意：吸取上清液中上层2ul进行加样， 不要吸取到沉淀。
循环条件
循环次数、温度 93℃ 2分钟 93℃ 45秒→55℃ 60秒→10个循环 93℃ 30秒→55℃ 45秒→30个循环
注意事项
3.浓缩离心后若出现有“絮状悬浮物”，去上清时应一 并把“絮状悬浮物”吸除，不影响实验结果。如不 吸取絮状悬浮物会导致实验结果偏低。
4.加入20ul的DNA提取液（DNA提取液用前充分融解 混匀),并用震荡器剧烈震荡混匀20秒后,瞬时离心。
乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量检测标准操作规程
乙型肝炎病毒（HBV）核酸定量检测标准操作规程（PCR-荧光探针法）1.目的: 规范乙型肝炎病毒（HBV）核酸定量检测操作流程，保证检测结果的准确性。
2.应用范围: HBV DNA 荧光定量检测。
3.职责:3.1 文件编写：实验室技术员。
3.2 文件审核：实验室主管。
3.3 文件审批：实验室主任。
3.4 执行：PCR实验室所有工作人员。
4. 参考文献：4.1 中山大学达安基因股份有限公司乙型肝炎病毒（HBV）核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）说明书。
4.2 中山大学达安基因股份有限公司核酸扩增荧光检测系统DA7600型使用说明书。
5. 内容：5.1 检测方法：PCR-荧光探针法。
5.2 实验原理：用一对乙型肝炎病毒特异性引物和一条乙型肝炎病毒特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、核苷酸单体（dNTPs）等成分，通过PCR体外扩增法，即高温变性、低温退火、适温延伸进行DNA扩增，并对PCR全过程进行实时监测，从而定量检测乙型肝炎病毒DNA。
5.3 性能参数：5.3.1 精密度：检测下限为5.0x102IU/ml。
5.3.2 线性范围：1.0x103～1.0x108IU/ml。
5.4 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集5.4.1 标本类型：血清。
5.4.2 标本采集：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入无菌的干燥玻璃管，室温（22～25℃）放置30～60 min，全血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1500 rpm离心5min；吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管。
5.4.3 标本保存：标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月，应避免反复冻融。
5.4.4 运送条件：标本运送采用0℃冰壶。
5.4.5 标本拒收标准：污染、严重溶血、脂血类或肝素抗凝剂标本。
5.5 设备和试剂：5.5.1 设备： DA7600荧光定量PCR仪、低速水平离心机、生物安全柜、台式高速离心机、移液器、混匀器、恒温水浴箱/干式恒温器、冰箱（4℃、-20℃）、移动/固定紫外灯、冷冻离心机。
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1 目的
规范LightCycler荧光PCR检测仪检测乙型肝炎病毒（HBV-DNA）的检验工作，指导检验人员正确进行乙肝病毒核酸定量的检测，保证检验结果的质量。
2 范围
本规程适用于LightCycler荧光PCR检测仪检测乙型肝炎病毒（HBV-DNA）
3 试剂
中山大学达安基因公司乙肝病毒(HBV)核酸扩增荧光检测试剂盒
4 仪器
Roche LightCycler荧光PCR检测仪
高速台式冷冻离心机
微量加样器（覆盖1-1000μl）
5 样品处理
样品处理按《PCR实验室标本处理规程》进行收集和处理，具体操作见本规程附录1和附录2。
6 测定
6.1 PCR扩增
6.1.1 打开稳压器电源，再打开计算机电源。
6.1.2 打开扩增仪电源，按仪器操作规程进入扩增循环条件设定。
6.1.3 将循环条件设定为：
6.1.4 检查反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。
6.1.5 将待反应的PCR反应管放入扩增仪中，并根据实际情况和仪器操作规程在程序中定好反应孔位置。
6.1.6 关闭扩增仪盖，按仪器操作规程开始循环。
6.1.7 扩增结束后关闭扩增仪电源，取出PCR反应管，密封放入垃圾桶。
6.2 产物分析
6.2.1 条件设置：反应结束后自动保存检测数据文件，调整荧光数值为F1/F2。
点击Quantification读取结果。
6.2.2 基线的确定：取3～8个循环的荧光信号。
6.2.3 噪声容限（阈值）：调节在阴性质控品以上，要求在Step3：Analysis下相关性r值＜-0.97，接近-1.0。
6.2.4 对照标准：保证阴性质控品的Ct值不出现任何数值（默认为40）。
6.2.5 最后记录仪器自动分析计算出的未知标本数值（M），关闭计算机。
7结果判断
7.1 如果Ct值＝40，则实验样品的UU DNA含量（基因拷贝数/ml）＜1×103。
7.2 如果Ct值＜40，则实验样品的UU DNA含量（基因拷贝数/ml）＝ M
7.3 检测样本中核酸阳性时，按实际结果报告；对可疑结果应复查，需要时与临床联系。
8 注意事项
8.1 各标本沸水浴时间误差不超过1分钟。
8.2 加样时每加完一个要立即盖上封闭好离心管。
9 支持性文件
9.1 《乙型肝炎病毒核酸扩增荧光定量检测试剂盒操作说明书》
8.2 《临床基因扩增检验实验室工作规范》
10 质量记录
附录1：HBV项目标本采集、运送流程图
附录2：HBV样本处理流程图
阳性标准品的稀释及处理：
充分混匀。