PCR扩增检测乙肝病毒
乙型肝炎dna定量标准
乙型肝炎dna定量标准乙型肝炎（HBV）是一种由乙型肝炎病毒（HBV）引起的肝炎。
HBV是一种DNA病毒，它的基因组由约3.2 kb的DNA组成。
乙型肝炎dna定量标准是用来测定HBV DNA的数量。
这个标准通常用于确定患者是否感染了HBV，以及患者在治疗过程中的病毒负荷。
HBV DNA定量是通过PCR（聚合酶链式反应）技术来实现的。
PCR是一种在实验室中复制DNA序列的技术。
在PCR反应中，DNA模板被加入到PCR反应混合物中，该混合物包括引物、酶和核苷酸。
引物是一种特殊的DNA片段，它们会结合到DNA模板的两端，并指示酶从这些端开始复制DNA。
酶会将核苷酸添加到新合成的DNA链上，直到整个DNA序列被复制完毕。
通过PCR，可以将少量的DNA扩增成大量的DNA，从而使得HBV DNA定量成为可能。
乙型肝炎dna定量标准通常使用国际单位（IU）或拷贝数（cp/mL）来表示HBV DNA的数量。
IU是一种标准化单位，它可以用于比较不同实验室之间的结果。
拷贝数是指HBV DNA在样本中的实际数量。
根据世界卫生组织（WHO）的建议，对于HBV DNA定量，应该使用IU/mL来表示结果。
此外，WHO还建议使用标准化的HBV DNA定量试剂盒进行测试，以确保结果的准确性和可比性。
根据乙型肝炎dna定量标准，对于患者而言，一般认为HBV DNA水平在2000 IU/mL以下是低病毒载量，而2000 IU/mL 以上则是高病毒载量。
在治疗过程中，目标是将患者的HBV DNA水平降至低于检测限度（通常为20 IU/mL以下）。
这通常需要使用抗病毒药物进行长期治疗。
总之，乙型肝炎dna定量标准是用来测定HBV DNA数量的重要工具。
它可以帮助医生确定患者是否感染了HBV，并监测患者在治疗过程中的病毒负荷。
对于患者来说，了解自己的HBV DNA水平可以帮助他们更好地管理自己的健康，并更好地控制乙型肝炎的发展。
乙肝病毒核酸检测实验操作流程
原理图
每产生一条DNA链，就切断一条探针 每切断一条探针，就产生一个荧光信号 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比
操作流程
一、标本采集
一次性无菌注射器抽取 受检者静脉血2毫升，注 入无菌的干燥玻璃管 用一次性无菌注射器抽取 受检者静脉血2毫升，注 入含EDTA或枸橼酸钠抗凝 剂的试管
血 清 的 采 集
93℃ 30秒→55℃ 45秒→30个循环
结果分析
1.
2.结果读取
3.结果报告
结果的报告必须简单清楚 定量测定则必须报告量的多少 1、结果高于测定方法线性范围上限，可报告>多少； 也可对样本稀释后再测，结果乘以稀释倍数 2、结果低于方法的测定范围下限，则报告多少即可， 不能报告“0”或阴性
乙肝病毒核酸检测 实验操作流程
广西临床检验中心 唐 娟
主要内容
HBV-DNA的检测原理
标本采集
HBV-DNA操作流程
DNA 提取 PCR 扩增
HBV-DNA检测结果分析
临床意义
检测原理
HBV ： 用一对乙型肝炎病毒特性引物（Primer）和一
条乙型肝炎病毒特异性荧光探针，配以PCR反
应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、四种脱氧 核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩 增法定量检测乙型肝炎病毒DNA
室温（22～25ºC）放置 30～60 分钟血标本使用 水平离心机，4000转/分 离心5分钟
血 浆 的 采 集
立即轻轻颠倒玻璃管混合 5～10次，使抗凝剂与静 脉血充分混匀
吸取上层血清，转移至 1.5ml灭菌离心管
5～10分钟后即可分离出 血浆，转移至1.5ml灭菌 离心管
乙肝病毒核酸检测标本采集、送检、处理流程
乙肝病毒核酸检测标本采集、送检、处理流程一、引言乙肝病毒核酸检测是一种重要的手段，用于乙肝病毒感染的早期诊断和监测治疗效果。
本文档旨在描述乙肝病毒核酸检测的标本采集、送检和处理流程，以确保流程规范和结果准确性。
二、标本采集1. 标本选择：乙肝病毒核酸检测的标本可使用血清、血浆或乙肝病毒DNA提取物。
根据实验室提供的要求和使用的方法，正确选择合适的标本进行采集。
2. 采集器具：使用无菌器具进行标本采集，如无菌收集管、无菌采血针等。
3. 采集流程：- 患者应事先了解采集流程与注意事项，并保持合作配合。
- 消毒部位：消毒患者采血部位，通常选择肘弯处的静脉。
- 采血：按照相应的方法采集合适数量的血液样本。
注意血液采集的整洁和标本不得受到污染。
4. 采集注意事项：- 采血前需要对采血设备进行消毒处理。
- 采血时要避免对血液标本造成不必要的污染，防止样本交叉感染。
- 采血后进行适当的处理，确保采血点不出现血肿或其他并发症。
三、标本送检1. 样本存放：采集的标本应放入防漏、密封良好的中。
若需要长期保存，应在-80℃低温条件下保存，以防止DNA的降解。
2. 标本信息：在标本上标注清楚患者信息，如姓名、年龄、性别等。
确保标本信息准确，以避免混淆和误诊。
3. 快递选择：选择快递公司进行标本运输，确保安全、快捷的送达实验室。
在包装标记时，应注明标本的特殊性质，以提醒运输人员注意。
四、标本处理1. 样本分装：实验室收到标本后，根据实验要求进行样本分装。
如分装到提取试剂盒、酶解管中，标注清楚样本编号，确保实验过程的可追溯性。
2. 提取和纯化：根据实验方法进行标本的提取和纯化操作。
确保提取和纯化过程的洁净，避免外源性核酸污染。
3. PCR扩增：将提取纯化后的样本进行PCR扩增反应。
注意PCR操作条件的准确性，避免扩增过程中的交叉污染。
4. 结果分析：根据PCR扩增结果，通过相关分析方法，如凝胶电泳、定量PCR等，对乙肝病毒核酸进行检测和分析。
乙肝病毒核酸扩增荧光检测
乙肝病毒核酸扩增荧光检测1．目的：保证HBV DNA检测结果准确、可靠。
2．适用范围：HBV DNA的TaqMan荧光定量检测，标本类型为血清。
3．负责人：操作人：原理：本试剂盒用一对乙型肝炎病毒特异引物和一条乙型肝炎病毒特异性荧光探针，PCR反应液，耐热DNA聚合酶（Taq酶），四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，再用PCR体外扩增法检测乙型肝炎病毒cDNA。
4．性能参数：检出低值＜5×102基因拷贝/ml。
5．标本要求：（1）标本类型：血清。
（2）标本采集：见标本采集手册。
（3）标本储存和运输：室温放置不超过8小时，4-8℃不超过72小时，-20℃保存期6个月，应避免反复冻融。
室温运输。
（4）标本拒收状态：细菌污染、严重溶血或脂血标本不能作测定。
6．容器和添加剂类型：无菌离心管和无菌真空管7．所需设备：SLAN-96P、自动核酸提取仪、台式高速离心机、混匀器、冰箱（4℃、-20℃）、生物安全柜、紫外灯8．试剂：DNA提取液（500μl/管）2管；HBV-PCR反应液（未贴标签管）20管；阳性定量质控标准品（1×103～5×104基因拷贝/ml）（50μl/管）1管；HBV 标准品Ⅰ～Ⅳ（1000μl/管）；阴性质控品（250μl/管）1管。
9．校准程序（计量学溯源性）：送芜湖市计量检测所校准。
10．程序步骤:：11.1试剂准备：按操作说明执行，将磁珠充分混匀；裂解液室温过低时易出现结晶，请放置于37℃环境至晶体融解，结合液含有不容的球型颗粒，混匀后即可使用；洗涤液W中已经加入了乙醇，不需要再加乙醇（注意保存时确保将瓶盖拧紧，以防止乙醇挥发）。
11.2自动核酸提取仪：如下表所示分装试剂，若使用上海之江生物医药科技有限公司核酸自动提取仪进行提取，选择“HBV-25ul或者DNA/RNA-2”规程进行提取，若使用其他匹配仪器根据建议设置核酸提取仪参数。
液→样本→蛋白酶K的顺序加入液体。
乙肝hbv-dna病毒数量标准
乙肝hbv-dna病毒数量标准乙肝(HBV)是由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的一种肝炎疾病。
HBV-DNA是HBV病毒所含的一种核酸，HBV-DNA病毒数量标准是可以评估乙肝患者病情严重程度的指标之一。
本篇文章将重点阐述乙肝HBV-DNA病毒数量标准、治疗方法以及注意事项。
一、乙肝HBV-DNA病毒数量标准HBV-DNA病毒数量可以通过PCR扩增技术测定，计量单位为“国际单位/ml”(IU/ml)，也可以用“拷贝数/ml”(cp/ml)表示。
目前，国内外对于HBV-DNA病毒数量的划分标准不尽相同。
根据中国抗病毒治疗指南2019年版，“HBV-DNA<500IU/ml”被认为是阴性，”HBV-DNA≥500IU/ml“被认为是阳性。
根据美国国立卫生研究院(NIH)建议标准，“HBV-DNA≥2000IU/ml”属于阳性。
HBV病毒的复制速度与其病毒数量呈正比关系。
一般来说，患者血清中HBV-DNA病毒数量越高，说明患者的乙肝病情越严重，肝细胞受损的程度也就越明显。
因此，通过测定HBV-DNA病毒数量的高低，可以评估乙肝的病程严重程度，以指导下一步的治疗方案。
二、乙肝HBV-DNA阳性的治疗方法1. 治疗目标乙肝的治疗旨在抑制HBV病毒复制，降低肝炎的病情恶化，减少肝损伤，同时通过肝功能的改善，提高患者的生活质量，降低肝癌的发生率。
2. 抗病毒治疗目前临床应用的抗病毒药物有拉米夫定、恩替卡韦、阿德福韦等，这些药物都可以有效地抑制HBV病毒的复制。
因此，高病毒载量的乙肝患者，可以选用抗病毒药物进行治疗，以取得抑制病毒复制的效果。
拉米夫定: 口服适用，不良反应小，临床应用最广泛，能有效控制HBV病毒复制，是治疗乙肝的一线药物。
恩替卡韦: 口服适用，单次日剂量可减轻。
一般耐药率较低。
适用于HBV 基因突变的患者以及对拉米夫定耐药的患者。
阿德福韦: 是治疗慢性乙肝的一线药物，纯量形式为口服胶囊，也可以采用注射方式应用。
实时荧光PCR检测乙肝病毒DNA的临床效果分析
１８６实时荧光ＰＣＲ检测乙肝病毒ＤＮＡ的临床效果分析张明跃乙型肝炎的主要感染源即乙肝病毒感染，该疾病在我国的发病率及传染率均较高。
有研究显示，大约２０％急性乙肝患者会逐渐转变为慢性乙肝，严重时可能转化为肝癌或者肝硬化，因此快速且准确地判断乙肝有利于该疾病的治疗和预后。
乙肝病毒血清标志是检测该疾病最常见的指标，可反映患者的免疫反应状态。
有研究显示，定量检测乙肝病毒ＤＮＡ可准确判断乙肝传染性，能判断此病毒感染的不同复制状态。
实时荧光ＰＣＲ检测弥补了传统ＰＣＲ假阳性的缺点，可定量检测乙肝病毒ＤＮＡ，并为乙肝的抗病毒治疗提供有效的疗效评估。
基于此，本研究对实时荧光ＰＣＲ用于乙肝病毒ＤＮＡ检测中的临床效果进行分析，提临床诊断提供参考依据。
１ 资料及方法１．１ 临床资料选择２０１７年５月—２０１８年１０月至我院检查的肝病变患者５００例，另选择５０例体检健康，收集其血液样本，均采取荧光定量ＰＣＲ检测。
研究前须对本研究相关人员详细说明情况。
１．２ 方法仪器及相关试剂选择：乙肝血清标志物酶联免疫吸附实验试剂盒、ＦＱ－ＰＣＲ 试剂盒（购于湖南圣湘生物科技有限公司）、扩增仪（购于上海宏石医疗科技有限公司）、洗板机（北京普朗的ＤＮＸ－９６２０Ｇ）、酶标仪（北京普朗ＤＮＭ－９６０６）、荧光定量 ＰＣＲ 检测仪（购于美国 ＢＩＯ－ ＲＡＤ 公司；型号为ＢＩＯ－ＲＡＤ ｉｃｙｃｌｅｒ）取肝病患者及体检健康者清晨空腹状态的静脉血５ｍＬ，将其装入灭菌的一次性真空塑料管，血液标本进行实时荧光ＰＣＲ检测。
血液标本离心处理后取血清１００ μＬ置于－２０℃环境保存备用，并提取乙肝病毒ＤＮＡ，在乙肝病毒模板中倒入ＰＣＲ的反应液，均匀混合后置于毛细管中，设置阳性对照、阴性对照和空白管。
将其放入荧光定量检测仪中进行ＰＣＲ扩增，温度调控至５０℃，激活其ＵＮＧ，温度调至９３℃，预变性２ ｍｉｎ，在９３℃５ ｓ，６０℃３５ ｓ，共４０个循环。
在此期间，模板工作电压控制在２２０±２２ Ｖ，温度需控制在３０℃￣９９℃之间。
乙肝病毒核酸扩增荧光检测操作规程
乙肝病毒核酸扩增荧光检测操作规程1. 目的：规范乙肝病毒核酸扩增荧光检测，保证HBV -DNA检测结果准确、可靠。
2. 范围：适用于HBV -DNA的TaqMan荧光定量检测，标本类型为血清。
3. 职责：操作人负责按照本操作规程进行乙肝病毒核酸扩增检测。
4. 程序：4.1检验方法：4.1.1 DNA 提取（样本制备区）将待测样本、阳性定量参考品、阴性质控品、HBV 强阳性质控品、HBV 临界阳性质控品进行同步处理。
4.1.1.1 取200μl 样品，加入450μlDNA 提取液I 和4μl 的内标溶液，用振荡器剧烈振荡混匀15 秒，瞬时离心数秒。
100℃恒温处理10±1 分钟；4.1.1.2 12000g 离心5 分钟，备用。
4.1.2 PCR 试剂准备（试剂准备区）直接使用HBV-PCR 反应管。
4.1.3 加样（样本制备区）往上述HBV 反应管中用带滤芯吸嘴分别加入提取后的待测样本核酸、HBV 阴性质控品、HBV 强阳性质控品、HBV 临界阳性质控品和阳性定量参考品的上清各20μl。
盖紧管盖，8,000rpm 离心数秒后转移至扩增检测区。
4.1.4 PCR 扩增（扩增和产物分析区）4.1.4.1打开“Setup”窗口，按样本对应顺序设置阴性质控（NTC）、阳性质控以及未知样本（Unknow）、阳性定量参考品（Standard），并在“Sample Name”一栏中设置样本名称；探针检测模式设置为：Reporter Dye1：FAM，Quencher Dye1：none；Reporter Dye2：VIC ，Quencher Dye2：none；Passive Reference：Rox。
4.1.4.2 打开instrument窗口，设置循环条件如下：93℃2 分钟，93℃45 秒→55℃60 秒→10 个循环，93℃30 秒→55℃45 秒→30 个循环。
保存文件，运行。
4.2 结果分析反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节Baseline 的Start 值、End 值以及Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可以在3～15、End 值可设在5～20，在Log 图谱窗口设置Threshold 的Value 值，使基线位于扩增曲线指数期,调整阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击Analysis 自动获得分析结果，在Report 界面察看结果，记录未知样本数值（C）。
PCR法检测HBV
PCR法检测HBV摘要：目的了解乙型肝炎病毒的相关知识及PCR技术在乙型肝炎病毒检测方面的应用，并通过实验的方法加深理解。
方法将已导入乙肝病毒特定段基因的质粒用基因扩增仪进行扩增，然后分两组进行电泳，并设置阴性对照、阳性对照、空白对照和Marker对照组。
电泳完毕后将胶板放在UVP凝胶成像系统下观察，对照。
结果实验组1弱阳性，实验组2阴性。
讨论分析了实验结果及误差产生的可能原因。
关键词：HBV PCR 琼脂糖凝胶电泳一、引言1.现状乙型肝炎病毒感染是一个全球性的公共卫生问题。
据估计，全世界大约有20亿人是过去或现在的HBV感染者以及超过350万人长期感染乙肝病毒。
在受感染的青少年或成人中， 5 ％ -10 ％将发展成慢性携带者，而在受感染的新生儿达90 ％慢性化发展。
在慢性HBV感染者中， 70 ％ -80 ％可以持续正常多年或终身。
进一步持续病毒感染，可以导致慢性活动性肝炎，甚至可能发展至肝硬化和肝癌。
[1]在我国，乙肝病毒携带者约有1.2亿人。
2.HBV 的形态与结构[2]感染者血清中用电镜观察可见三种不同形态的HBV颗粒，即大球形颗粒、小球形颗粒和管形颗粒。
大球形颗粒亦称Dane颗粒，是具有感染型的完整成熟的HBV，呈球形。
病毒外层有7nm厚的包膜，内层为病毒核心（核衣壳）结构，成二十面体立体对称。
HBV核心内部含有双股不完全环状的DNA 基因组和DNA多聚酶。
小球形颗粒，主要为HbsAg，不含HBV DNA 和DNA多聚酶，无感染性。
管形颗粒，是由小球形颗粒“串联”而成，不含病毒核酸，无传染性。
3.HBV基因结构及抗原组成[3]HBV-DNA分为负链(长链)及正链(短链)，其中负链有4个开放阅读框架，分别称为S、C、P和X基因区，他们彼此间相互重叠，以不同的启动子编码多种蛋白。
⑴S基因区： S区基因有3个不同的启动子，分别形成S基因、PreS1基因与PreS2基因，分别编码HbsAg、PreS1Ag和PreS2Ag三种包膜蛋白多肽；⑵C基因区：由前C基因和C基因组成,分别编码HBeAg及HBcAg；⑶P基因区： P区基因最长，编码HBV-DNA多聚酶、反转录酶及RNA 酶H（Rnase H）等；⑷X基因区： X区基因编码的蛋白称为HbxAg，可反式激活HBV 的基因，增强HBV 基因的复制和表达。
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乙肝病毒（HBV）感染引起的乙型肝炎， 我国发病率很高 ，HBV的检测极其重要。
HBV DNA存在就可以引起乙肝的传染，乙 肝病毒基因是乙肝病毒的核心成分，是病毒复 制的发动机 。
PCR技术可以检测出极微量的病毒，是判 断其传染性最直接、最可靠的证据。PCR技术 已成为公认的对病毒性肝炎的诊断、疗效观察 及预防研究工作最理想的方法之一。
离心
4.电泳检测：
①制备2%琼脂糖凝胶
电泳槽的准备：
2%琼脂糖的制备：
称取 0.8g琼 脂糖
40mlTBE 加入 电泳缓冲液 冷却
（PH8.0) 60℃左右 煮沸溶解
加入 溴乙啶
EB20μl
倒胶
``
②加样：取扩增后的产物10 ul点样于凝胶孔
取样
点样
③电泳：点样端接“-”，稳压，50V，电泳30分钟。
在局部形成杂交链 3.延伸：耐热DNA聚合酶按5 ′→3′
方向催化以引物为起始点的 延伸反应
一 次 循 环
5’
3’
5’
3’ 模板DNA
3’
5’
高温变性
低温退火
适温延伸
5’
3’
引物
Tap酶
3’
两条子代DNA
5’
经过25-35次循环后，目的片段扩增2n倍
三、主要器材及试剂
1.主要器材：
9700型PCR仪
4种dNTP混合物
TapDNA聚合酶 Mg2+
引 物(小分子DNA片段）
加入提取好的标本4μl，6000转离心10秒。
3.PCR仪上扩增：
三个扩增步骤温度及时间
变性
温度 93℃
时间 45″（首次5′）
退火
55 ℃
45″
延伸
72 ℃
60″（末次5′）
循环次数：25次
加入标本
6000转离心10秒
PCR仪上扩增
Thank you!
一、实验目的
1.掌握PCR技术扩增的原理 2.熟悉PCR扩增检测乙肝病毒的基本操作
过程。
二、实验原理
聚合酶链反应(Polymerase Chain
Reaction) 简称PCR,是在体外条件下利 用DNA聚合酶、催化一对引物间的特 异性DNA片段合成的基因体外扩增技 术，它包括三个基本过程：
1.变性：加热使双链DNA变为单链 2.退火：急速降温使引物和互补模板
五、结果观察：紫外分析仪下观察，出现橙黄色
条带则为HBV阳性
点样孔
HBV阳性对照
HBV阳性
HBV阴性对照
HBV阴性
正极
负极
五、注意事项
1. 试剂盒内阳性标本及DNA提取液使用前需充 分融化离心。
2. 反应液的表面为固体封盖剂，电泳取样时从 反应管底部吸液。
3. EB为强致癌物，操作过程应注意防护。 4. 注析仪
台式高速离心机
2.主要试剂：
HBV阳性标本 PCR反应管
HBV-PCR定性检测试剂盒
DNA提取液
四、操作步骤
1.标本处理：取患者血清40μl，加入DNA
提取液40μl，沸水浴10分钟，10000转离心 5分钟，取上清液4μl做PCR反应。
10×扩增缓冲液
2.加样：
取试剂盒中PCR反应管