浅谈乙肝病毒检测PPT课件
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乙型病毒性肝炎检测项目及临床应用PPT课件
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乙肝病毒的结构
乙肝表面抗原（澳抗） （HbsAg）
由乙肝病毒的核心抗 原(HBcAg)和E抗原 （HBeAg）组成 环状并且有缺口的 DNA双链，和依附在 上面的DNA聚合酶
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乙肝的传播途径
1.输血传 2.性接触
播
传播
3.垂直传 播
4.密切生 活传播
5、抗病毒治疗乙肝，加查前S1抗原可作为治疗前的患者筛查(适应症 )和治疗后的疗效判断，尤其对抗HBe(+)的慢性乙肝患者抗病毒药 物治疗的排查可起到重要作用。
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乙肝两对半的32种组合及临床意义
序号 1 2
3 9 种 常4 见5 模6 式
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HbsAg HbsAb HbeAg HbeAb HBcAb
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HBeAg
HBeAg一般通称e抗原，它来源于乙型肝炎病毒 的核心，是核心抗原的亚成分，或是核心抗原裂解后 的产物。其在血清中的出现时间稍后于HBsAg，一 般血清HBeAg阳性者，HBsAg亦为阳性。
HBeAg与病毒Dane颗粒、HBV DNA具有伴随 关系，是HBV复制活跃的血清学指标，血清HBeAg 阳性说明传染性强。急性乙肝病人血清HBeAg持续 阳性3个月以上，则有疾病慢性化倾向。
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三、乙肝的临床诊断
既往有乙型肝炎病史或HBsAg阳性超过6个月，现 HBsAg和（或）HBV DNA仍为阳性者，可诊断为慢性 HBV感染。根据HBV感染者的血清学、病毒学、生物化学 试验及其他临床和辅助检查结果，可将慢性HBV感染分为：
乙肝病毒的检测ppt课件
聚合酶链反应-限制性片段 长度多态性分析法 (PCR-
RFLP)
较测序法简便，适于大样本检测，但由于需要进行酶切，所 以操作仍较为繁琐，成本较高，并存在酶切不彻底等问题。
pre-S2单克隆抗体酶联免疫 简单、快速，已商品化，适于大样本检测，但检测费用较高
测定 (mAbs EIA法)
并不能有效鉴别有些混合型感染和HBsAg低表达及某些表位
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2
乙型肝炎病毒HBV
• HBV是嗜肝脱氧核糖核酸病毒科的哺乳动 物属的一员。
• HBV阳性的血清中有三种病毒颗粒． １.大球形颗粒，完整的HBV颗粒直径为
42nm，又名Dane颗粒，分为包膜与核心的 两部分，外衣壳及包膜含有表面抗原，衣 壳内为核心结构，有核心抗原，核心抗原 下面藏有e抗原。
3
• ２.小球形颗粒，阳性血清中最多的颗粒，主 要为表面抗原，不含核酸及ＤＮＡ成分，为 不完整的ＨＢＶ．
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①一种亚型的HBsAg及异型的抗HB（s 常见）；②血清从HBsAg 26 + + + + + 转化为抗HBs 的过程（少见）。 27 - + + + 28 - + + + + 29 - - + + 30 + - + + 31 + + + - 32 + + + + -
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大三阳
小三 阳
HBeAg 阴性的慢乙肝患者，肝硬化年发生率8%-10%； HBeAg 阳性的慢乙肝患者，肝硬化年发生率2%-5% 对HBeAg 阴性患者应该开展更积极的治疗
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• 2、试剂的影响 2.1乙肝两对半试剂厂家较多；不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性 存在一定的差别，有资料显示，不同厂家试剂的特异性和敏感性分别 为89.4%—99.3%,78~89%存在较大差异。有的厂家酶标板孔间A值差 大于15%；标记酶的活性及显色液的稳定比较差。使用质劣的试剂必 然导致结果的假阳性或假阴性。因此。选择高质量的试剂是保证结果 准确的关键之一。 2.2不同方法学的检测试剂，会使两对半结果出现一些不同。例如： 在实际工作中常用ELISA检测HBsAg结果为阴性，而电化学发光检测 为阳性。除方法学的灵敏度外；还存在使用单抗或多克隆抗体试剂的 差别。单抗对变异抗原或亚型乙肝标志物检测存在差异，建议试剂厂 家对剂的制备应该考虑亚型及型浓度的问题。
最新浅谈乙肝病毒检测ppt课件
地区的特点和情况，采取特殊政策和灵
④民族团结是实现民族平等的政治基础
A．①③
B．②④
C．①④
D．②③
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【分析】题干主要反映了民族区域自治制度的优越 性及民族团结的重要性，②③正确且符合题意，故 选D项。①与题意不符，不选；民族平等是实现民 族团结的政治基础，④说法错误，不选。
答案 D
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•
认为“民族区域自治就是少数民族
自己管理自己”
7.洗涤
洗涤液充分洗涤5次，洗涤完扣干（每次应保持30-60秒的浸 泡时间）
8.显色
每孔加入A、B底物50 μL，混匀，37℃暗置15分钟
9.终止
每孔加50 μL终止液50 μL，混匀
10.测定
酶标仪单波长450nm或双波长450/630nm测定各空OD值，记 录结果,30分钟内测定完成）
4.结果判定
民族区域自治制度已载入《中华人民共
和国宪法》，成为我国的一项基本政治
制度。坚持民族区域自治制度也是党和
政府坚持依法行事的体现。
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•
我国民族区域自治制度的优越
性
•
（1）有利于维护国家统一和安全：
民族区域自治是以领土完整、国家统一为
前提和基础的，是国家的集中统一领导与
民族区域自治的有机结合。它增强了中华
自治法所规定的，涉及政治、经济、文化和
社会生活各个方面，但不同于特别行政区的
高度自治权。民族区域自治是以领土完整、
国家统一为前提和基础的。
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•
④明确实行民族区域自治制度的
原因。首先，实行民族区域自治是适合
我国国情的必然选择，是由我国的历史
特点和现实情况决定的。其次，民族区
乙肝五项检测的临床意义PPT课件
HBeAg与病毒Dane颗粒、HBV DNA具有伴随关系， 是HBV复制活跃的血清学指标，血清HBeAg阳性说明传染 性强。急性乙肝病人血清HBeAg持续阳性3个月以上，则 有疾病慢性化倾向。
有时临床实验室可见到HBsAg（－）、抗HBs（+）、 HBeAg（+）的模式，则很有可能在病毒编码HBsAg的基 因区发生了突变。
2．抗HBs 当乙型肝炎病毒侵入人体后，刺激人的免疫系统产生免疫反应，
人体免疫系统中的B淋巴细胞分泌出一种特异的免疫球蛋白G，就是 表面抗体，它可以和表面抗原特异地结合，然后在体内与人体的其他 免疫功能共同作用下，可以把病毒清除掉，保护人体不再受乙肝病毒 的感染，故称表面抗体为保护性抗体。有了表面抗体，证明人已产生 了免疫力。人自然感染后或注射乙肝疫苗后，均可产生乙型肝炎表面 抗体；但不是所有的人都能产生表面抗体。一般成人期感染乙型肝炎 病毒，可以发生急性乙型肝炎，也可没有症状，绝大多数在3～6个月 以后才出现表面抗体。检查出抗-HBs阳性，疾病即已逐渐恢复。血液 里表面抗体能维持很长时间，直到老年期抗体水平才有所降低。以 HBsAg作为疫苗免疫机体产生的抗HBs，对HBV的感染具有保护性免 疫作用。10mIU/m1抗HBs为对HBV具有免疫力的临界水平。低于此 值，说明免疫失败。乙肝疫苗接种者，体内血循环中除了抗HBs外， 不应出现其它乙肝病毒感染血清免疫学标志物，如抗HBe、抗HBc等。 一旦出现除抗HBs以外的标志物，则应视为既往HBV感染。
42nm，又名Dane颗粒，分为包膜与核心的 两部分，外衣壳及包膜含有表面抗原，衣 壳内为核心结构，有核心抗原，核心抗原 下面藏有e抗原。
• ２.小球形颗粒，阳性血清中最多的颗粒，主 要为表面抗原，不含核酸及ＤＮＡ成分，为 不完整的ＨＢＶ．
有时临床实验室可见到HBsAg（－）、抗HBs（+）、 HBeAg（+）的模式，则很有可能在病毒编码HBsAg的基 因区发生了突变。
2．抗HBs 当乙型肝炎病毒侵入人体后，刺激人的免疫系统产生免疫反应，
人体免疫系统中的B淋巴细胞分泌出一种特异的免疫球蛋白G，就是 表面抗体，它可以和表面抗原特异地结合，然后在体内与人体的其他 免疫功能共同作用下，可以把病毒清除掉，保护人体不再受乙肝病毒 的感染，故称表面抗体为保护性抗体。有了表面抗体，证明人已产生 了免疫力。人自然感染后或注射乙肝疫苗后，均可产生乙型肝炎表面 抗体；但不是所有的人都能产生表面抗体。一般成人期感染乙型肝炎 病毒，可以发生急性乙型肝炎，也可没有症状，绝大多数在3～6个月 以后才出现表面抗体。检查出抗-HBs阳性，疾病即已逐渐恢复。血液 里表面抗体能维持很长时间，直到老年期抗体水平才有所降低。以 HBsAg作为疫苗免疫机体产生的抗HBs，对HBV的感染具有保护性免 疫作用。10mIU/m1抗HBs为对HBV具有免疫力的临界水平。低于此 值，说明免疫失败。乙肝疫苗接种者，体内血循环中除了抗HBs外， 不应出现其它乙肝病毒感染血清免疫学标志物，如抗HBe、抗HBc等。 一旦出现除抗HBs以外的标志物，则应视为既往HBV感染。
42nm，又名Dane颗粒，分为包膜与核心的 两部分，外衣壳及包膜含有表面抗原，衣 壳内为核心结构，有核心抗原，核心抗原 下面藏有e抗原。
• ２.小球形颗粒，阳性血清中最多的颗粒，主 要为表面抗原，不含核酸及ＤＮＡ成分，为 不完整的ＨＢＶ．
乙肝病毒基因检测和基因型ppt课件
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•抗-HBe：
•意味着 HBV部分被清除或抑制，复制减少， 传染性降低, 但慢性肝炎, 肝硬化阳性率高
• e抗体和e抗原一般不同时存在，e抗原消失， e抗体产生。
• e抗体（+）说明患者曾出现过HBeAg
• 但对e抗体（+）者不可视为HBV复制平息。
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抗-HBc IgM ： 是诊断急性乙型肝炎和判断 病毒复制活跃的指标，并提示病人血液有 强传染性。抗-HBc IgM阳性也可见于慢性 活动性肝炎。
抗-HBc IgG ： 高滴度表明机体正感染HBV； 而低滴度抗-HBc IgG则是既往感染过HBV 的指标，具有流行病学的意义。 (非保护性抗体)
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乙型肝炎病毒血清标志物的综合评价
(1) (2) (3) (4) (5) ＋ － ＋ － ＋ 急性或慢性乙型肝炎，高传染性 ＋ － － － ＋ 急性、慢性乙型肝炎或慢性HBsAg携带者 ＋ － － ＋ ＋ 急性乙肝趋向恢复或慢性乙肝，弱传染性 － ＋ － － ＋ 急性HBV感染康复期或有既往感染史，有
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双标记探针: Taqman probes
5’
5’
3’
Excitation Excitation
RR
Q
3’
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3’
3’ 5’ Q
5’
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1. HBV DNA 检测结果与血清标志物的综合评价
⑴ 与HBsAg检测结果的关系 :
一般来说HBsAg阳性，HBV DNA测定常常阳性。在实践 中可能遇到的问题是HBsAg测定结果阴性，而HBV DNA测定 阳性, 其原因可能是因为:
乙肝病毒检测及其临床意义PPTppt
各项指标的临床意义
HBeAg 是HBV复制及血清具有传染性的指标，其阴转表示病毒复制降低，传染 性下降。 在潜伏期与HBsAg同时活在其出现后数天就可在血清中检出。 持续时间一般不超过10周，如超过提示感染感染转为慢性。 HBeAb 出现于HBeAg阴转后。 其出现比HBsAb晚但消失早。
步骤:1.50ul病人血清+50ul酶 2.37℃孵育30分钟,洗板
3.加显色剂A,B
4.37℃孵育30分钟,洗板 5.加终止剂,10分钟内比色
各项指标的临床意义
HBsAg
HBsAg是HBV感染后第一个出现的血清标志物。 见于急性肝炎、慢性肝炎或无症状携带者。
HBsAb 急性恢复期可检出，一般在HBsAg从血清消失后发生HBsAb阳 转 是乙肝痊愈的一个重要标志 是疫苗免疫成功的标志。
+
-
+
-
-
-
-
谢 谢
各项指标的临床意义
HBcIgM 是HBsAg消失到HBsAb出现间隔这段核心窗口期唯一能检出的血清学标 志物。 常为急性HBV的感染指标。 HBcIgG 常见于急性感染恢复期和慢性持续性感染期。
各项指标的综合分析
HBsA HBsAg b
+ -
HBeA g
+
HBeA b
-
Hbcab
临床意义
试剂:科华 仪器:洗板机,恒温孵育箱,酶标仪 原理:将抗体(抗原)包被在固相表面后,按不同步骤 加入待测抗原(抗体)和酶标抗体(抗原).充分反应后 洗涤,使固相上形成的抗原抗体复合物与其他物质分 离,洗去游离的酶标抗体(抗原),最后加入底物,根据 酶对底物催化的显色反应程度,而对标本中的抗原 (抗体)进行定性或者定量.
乙肝ppt课件
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基层医务工作者 如何做？
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♥ 正确定位自己。 ♥ 做好教育宣传。 ♥ 正确指导患者，负责任地就医引导。 ♥ 在现有条件下适当治疗。 做好预防。
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如何预防？
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乙型肝炎的预防
疫苗预防 阻断母婴传播 避免医源性传播
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感染恢复期，有免疫力，无传染 性 ①窗口期，抗-HBs即将出现； ②HBV感染已过 ①注射疫苗后；②遥远的过去有 过HBV感染
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乙肝的常规检查
病毒学检查
❖ 表面抗原(HBsAg )及抗体(抗-HBs) ❖ e抗原(HBeAg)及抗体(抗-HBe) ❖ 核心抗原(HBcAg)及抗体(抗-HBc) ❖ 乙型肝炎病毒DNA(HBV DNA＜103copy/ml)
● 若乙肝表面抗体（HbsAb）（+）定量＜ 10 ∕iu ∕ml → 24 小时内接种免疫高价球蛋白200u
● 若乙肝表面抗体（完整H版bppst课A件b）（+）定量＞ 10 ∕iu ∕ml 或 28 HbsAg(+) →不需要特殊处理
职业暴漏的预防
• （1）在进行有可能接触病人血液、体液的诊疗和护理操 作时必须戴手套，操作完毕，脱去手套后立即洗手，必要 时进行手消毒。
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慢性乙型肝炎的管理指南
❖ 当应用口服抗病毒药物进行治疗时，HBeAg阳性患者出现HBeAg血清学 转换后，分别检测HBV DNA 2次均为阴性，每次至少间隔 6个月，则可 终止治疗。HBeAg阴性患者的疗程尚不明确，但如果检测3次且每次间 隔6个月，均提示HBV DNA阴性，则可以考虑不继续治疗。
乙肝病毒五项检测 ppt课件
乙型肝炎病毒表面抗原
乙型肝炎病毒表面抗原
注意事项
本样品仅用于体外诊断，操作应按说明说严格进行。封板膜不能重复使用，不同 批号、酶标试剂和阴性对照不可混用，不能与其它厂家试剂混用。
避免在有挥发性物质及次氯酸类消毒液（如84消毒液）的环境下操作。 使用前请将试剂平稳至室温（平衡30分钟以上），实验前将试剂轻轻振荡混匀， 使用后立即回放2~8℃。未用完的微孔板条与干燥剂一起用自封袋密封2~8℃保存。 过期试剂请勿使用。 加液时必须用加样器，并经常校对加样器的准确性。加入不同样品或不同试剂组 份时，应更换加样器的吸头和加样槽，以防止出现交叉污染。 洗涤时各孔均匀需加满洗液，防止孔内有游离酶不能洗净。使用洗板机应设定 30~60秒浸泡时间。在洗版结束后，必须立即进行下一步，不可使用酶标板干燥。 避免长时间的中断实验步骤，以确保每孔实验条件的均一。 结果判定必须以酶标仪读数为准。读取结果时，应擦干酶标板底部，且孔内不能 有气泡。不要触碰孔底部的外壁，指引或划痕可能影响板孔的读值。 所有样品、废液和废弃物都应按照传染物处理。终止液为硫酸，使用时必须注意
乙型肝炎病毒e抗体
检验方法：
配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释。
编号：将样品对应微孔板按序编号，每板应设阴性对照3孔，阳性 对照2孔和空白对照1孔（用双波长检测，可不设空白对照孔）。
加样：分别在相应孔中加入待测样品及阴、阳性对照各50µl。
加酶：每孔加人酶标试剂50ul，空白孔除外，轻轻振荡混匀。 温育：用封板膜封板后置37℃温育30min。 洗涤：小心撕掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。 显色：每孔加人显色剂A、B液各50µl，轻轻振荡混匀，37℃避光 显色15min。 测定：每孔加终止液 50µl ，轻轻振荡混匀， 10min 内测定结果。
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强阳性质控品
临界阳性质控品
质控品及阳性定量参考品 HBV定量参考品（2.0X106IU/ml） HBV定量参考品（2.0X105IU/ml）
HBV定量参考品（2.0X104IU/ml）
HBV定量参考品（2.0X103IU/ml）
PCR检测试剂
HBV-内标溶液 HBV-PCR反应管
规格 4.5ml/瓶
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PCR分四个阶段
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如何定量？
Ct值的概念
Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开 始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循 环次数。
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定量原理
确定初始模板的浓度
初始 DNA量越多, 荧光 达到某一值（域值）时 所需要的循环数越少
Log浓度与循环数呈线 性关系，根据样品扩增 达到域值的循环数就可 计算出样品中所含的模 板量
再检测，则样品HBV DNA浓度=（CX稀释倍数） IU/ml
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5.注意事项
1 每次实验需检测阴性质控品、HBV强阳性质控品、 HBV临界质控品，满足要求方可进行判定（阳性质控 品Ct<30，阴性质控品无明显对数期或Ct值等于30 VIC检测通道扩增曲线有明显对数期） 2 本试剂盒的最低检出浓度为30IU/ml，最低定量浓 度为100IU/ml
T A
GCGCA T
GT
C
AG
CA
C
变性: 无荧光信号
A CGACT A G G A T G GT A C A G T C G TG T GCTGA T C C T A C C A T GT C A G CA C
未结合SYBR Green 1 dye
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2.所用试剂
核酸提取试剂
组分名称 DNA提取液I 阴性质控品
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4.结果判定
1 如果在FAM检测通道检测扩增曲线无明显对数期或 Ct值等于30，VIC检测通道扩增曲线有明显对数期， 则为阴性或小于检测灵敏度
2 FAM检测通道扩增曲线有明显对数期且Ct值小于30 按以下方法判断：
C<100,HBV DNA浓度<100 IU/ml 100≤C ≤ 5.0E+008 ,HBV DNA浓度=C IU/ml C>5.0E+008 ,HBV DNA浓度>5.0X108 IU/ml 如需精确 定量结果，可将样品用阴性质控品稀释到线性范围后
2.PCR试剂准备
直接使用HBV-PCR反应管
3. 加样
HBV-PCR反应管分别加入将待测样本、阳性定量参考品、阴性
质控品、HBV强阳性质控品、 HBV临界质控品上清20 μL。盖紧
管盖，8000rpm离心数秒后扩增
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4.PCR扩增 对各标本进行标记 反应条件： 93℃ 2分钟 93℃ 45秒→55℃ 60秒→10个循环 93℃ 30秒→45℃ 60秒→30个循环 FAM通道检测HBV核酸，VIC通道检测内标
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3、实验步骤
1.DNA提取
将待测样本、阳性定量参考品、阴性质控品、HBV强阳性质
控品、 HBV临界质控品进行同步处理。
1.1 取200 μL样品，加入450 μL DNA提取液I和4 μL内标溶液，
用振荡器剧烈震荡摇匀15秒，瞬时离心数秒，100℃处理10分
钟
1.2 12000rpm离心5分钟，备用
既往感染恢复期
-
-
- -+
既往感染
-
+
-
- --
既往感染或接种疫苗
-
-
-
- --
未感染，无免疫力
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二、乙肝病毒核酸定量检测
1.检测原理
利用荧光PCR技术，以HBV基因组中相对保守区为 靶区域，设计特异引物及荧光探针，通过PCR对DNA 进行快速定量检测。
荧光探针TaqMan 探针实时荧光 PCR 技术。在 PCR 反应过程中，同时利用 Taq 酶的 5’→3’聚合酶活 性和核酸外切酶活性，使得 TaqMan 探针降解，荧光 报告基团和淬灭基团分离使得荧光信号发射， FAM 荧 光检测乙型肝炎病毒JOE/RED610 nm 波长通道检测 内参。
数量 2
250ul/管
1
250ul/管
1
250ul/管
1
250ul/管
1
250ul/管
1
250ul/管
1
250ul/管
1
100ul/管
1
1人一份/管 20
主要成分 DNA提取液 HBV阴性血清 灭活HBV阳性血清 灭活HBV阳性血清 灭活HBV阳性血清 灭活HBV阳性血清 灭活HBV阳性血清 灭活HBV阳性血清 内标质粒及稳定剂 引 物 、 探 针 、 taq酶 等
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荧光化学 TaqMan
SYBR Green 1
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TaqMan
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SYBR Green I 工作原理
。 SYBR Green 1 结合到双链DNA的小沟部位
SYBR Green 1 染料只有和双链DNA结合后才发荧光
TAGCCGTAGCATTA
G C
G C
A T
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HBV抗原抗体系统检测临床意义
HBs 抗- HBe 抗- 抗-HBc Ag HBs Ag HBe
Ig Ig MG
+
-
-
- --
临床意义 感染或无症状携带者
+
-
+
- + - 急性或慢性乙型肝炎（传染性强）
（大三阳）
+
-
-
+ -+
急性肝炎趋向恢复 （小三阳）
-
+
-
+ -+
既往感染恢复期
-
+
-
+ --
3 所有样品包括质控品均按传染性标本对待严格遵循
无菌操作（带口罩手套），所有操作在生物安全柜内
操作，物品不能随意带出生物安全柜，用完的物品集
中放置高压灭菌后方可处置。
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一、乙肝病毒e抗原检测
1.检测原理
在微孔板上预包被鼠抗-Hbe单克隆抗体（ HbeAb）， 配以辣根过氧化物酶标鼠抗-Hbe单克隆抗体 （ HbeAb-HRP）及TMB（四甲基联苯胺）等试剂， 采用双抗夹心法检测血清中的乙肝病毒e抗原 （ HbeAg）
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2.所用试剂
组成成分
规格
组成成分
规格
1.HbeAg微孔板
（包被鼠抗Hbe单克隆抗体
96TX块
7.底物B （过氧化氢）
7mlX1支
（ HbeAb））
乙肝病毒检测
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病毒鉴定方法
一、分离培养方法 二、快速诊断方法
1、光学显微镜检查
病毒包涵体及某些大病毒颗粒的检查
2、电子显微镜的检查
电镜直接检查 免疫电镜检查
3、血清学检查 4、病毒基因组检查
核酸杂交和聚合酶链反应
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乙肝病毒检测
一、乙肝五项（两对半） 二、乙肝病毒核酸定量检测
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