荧光及荧光分析
荧光分析技术的原理和方法
荧光分析技术的原理和方法荧光分析技术是一种分析和检测物质的方法，它不仅具有灵敏度高、特异性强等优点，而且还可以使用相对简单、易操作的设备和方法进行分析。
本文将探讨荧光分析技术的原理和方法，以及其在实际应用中的优缺点。
一. 荧光分析技术的原理荧光分析的基本原理是物质吸收能量后，由激发态自发辐射发出荧光。
荧光发射的波长与物质的结构和环境密切相关，因此可以根据荧光发射的波长来分析物质的成分和性质。
二. 荧光分析技术的方法荧光分析技术主要有荧光光谱分析、荧光显微镜、荧光免疫分析等几种。
1. 荧光光谱分析荧光光谱分析是一种利用荧光发射波长来分析物质的方法。
它通过激发样品，测量样品发出的荧光光谱来确定物质的化学成分和性质。
荧光光谱分析在生物医学领域有着非常重要的应用，比如用于检测蛋白质和动物细胞等生物分子。
2. 荧光显微镜荧光显微镜是一种利用荧光物质在显微镜下展现的亮度和颜色来观察样品的方法。
它可以将荧光染料标记在生物样品中，从而实现对生物分子和细胞的可视化。
荧光显微镜已经成为生物医学领域中最重要的观测手段之一，也是生物光学、光子学研究领域的必备工具。
3. 荧光免疫分析荧光免疫分析是一种利用荧光标记的抗体来检测分子的方法。
它通过将荧光标记的抗体与特定的分子结合，在荧光显微镜下观察荧光信号以检测分子。
荧光免疫分析主要用于医学诊断中的分子检测和细胞成像。
三. 荧光分析技术的应用荧光分析技术在许多领域中都有着广泛的应用。
主要涉及到生物医学、环境监测、食品安全检测、工业生产等方面。
1. 生物医学荧光分析在生物医学中的应用较为广泛，包括荧光显微镜观察生物结构、荧光免疫分析检测各种分子等。
2. 环境监测荧光分析技术可以将其应用于环境监测和环境污染控制。
比如用于污染物的快速检测、废水污染的监测、空气污染的监测等。
3. 食品安全检测荧光分析也可以用于食品安全检测，比如寻找食品中有害物质如农药、污染、病原体等。
4. 工业生产荧光分析技术也可以应用于工业生产，如半导体晶片生产、光学元器件制造等。
荧光分析第一章讲课
荧光强度与浓度的关系
荧光强度与浓度成正比
线性范围
在一定范围内，荧光物质的荧光强度 与其浓度成正比，可用于定量分析。
荧光分析方法适用的浓度范围，超出 此范围可能导致荧光强度与浓度关系 偏离线性。
荧光猝灭
当荧光物质浓度过高时，由于分子间 的相互作用，可能导致荧光强度降低， 即荧光猝灭现象。
图像处理系统
将观察到的荧光图像转换为数字信号，并进行处理和 分析
其他辅助设备
荧光标准品
用于荧光分析的定量和定性分析，常用荧光染料或荧光标记物
样品前处理设备
用于样品的提取、纯化、浓缩等前处理步骤，以保证分析的准确性 和可靠性
数据处理和分析软件
用于荧光数据的处理、分析和可视化，提高分析效率和准确性
其他辅助设备
荧光分析第一章讲课
目
CONTENCT
录
• 荧光分析概述 • 荧光分析的基本原理 • 荧光分析的仪器与设备 • 荧光分析的实验方法与技术 • 荧光分析的应用实例 • 荧光分析的优缺点及发展前景
目
CONTENCT
录
• 荧光分析概述 • 荧光分析的基本原理 • 荧光分析的仪器与设备 • 荧光分析的实验方法与技术 • 荧光分析的应用实例 • 荧光分析的优缺点及发展前景
荧光光谱的测定与解析
荧光光谱仪的组成与原理
01
了解荧光光谱仪的基本组成，如光源、单色器、样品室、检测
器等，并掌握其工作原理。
荧光光谱的测定步骤
02
熟悉荧光光谱测定的基本步骤，包括仪器的预热、样品的放置、
光谱的扫描等。
荧光光谱的解析方法
03
荧光物质的荧光特性及其定量分析
荧光物质的荧光特性及其定量分析指导老师：吴莹实验人：王壮同组实验：戈畅、陆潇实验时间：2016.5.30 一．实验目的1．测量荧光物质的激发光谱和荧光光谱；2．掌握荧光物质的定量测定方法；3．熟悉F-2500（日立）荧光光谱仪结构及操作。
二．实验原理（一）荧光的产生过程荧光是发射光。
物质分子或原子在一定条件下吸收辐射能而被激发到较高电子能态后，在返回基态的过程中将以不同的方式释放能量。
如在分子吸收分光光度法中，受激分子以热能的形式释放多余的能量，测量的是物质对辐射的吸收，属吸收光谱法；而发光分析是受激分子或原子以发射辐射的形式释放能量，测量的是物质分子或原子自身发射辐射的强度，属发射光谱法。
激发光谱曲线：固定测量波长（选最大发射波长），化合物发射的荧光强度与激发光波长的关系曲线。
荧光（发射）光谱曲线：固定激发光波长（选最大激发波长），化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线。
电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光，所以发射光谱的形状与激发波长无关。
（二）荧光的产生与分子结构的关系1．跃迁类型：*ππ→的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；2．共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移；3．刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。
如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有；4．取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强。
（三）荧光分析荧光分析可应用于物质的定性及定量，由于物质结构不同，所吸收的紫外—可见光波长不同，所发射荧光波长也不同，利用这个性质可鉴别物质。
在一定频率和一定强度的激发光照射下，荧光物质（稀溶液体系）所产生的荧光强度与浓度呈线性关系，可进行定量分析。
（四）荧光光谱仪荧光光谱仪主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。
荧光分析法实验报告
荧光分析法实验报告
实验目的：
1.了解荧光分析法的原理和应用；
2.学习使用荧光分析法测定样品中的荧光物质的含量。
实验仪器和试剂：
1.荧光分光光度计；
2.紫外灯；
3.导流管；
4.水样、标准品等。
实验原理：
荧光分析法是一种利用物质吸收紫外或可见光而发射荧光的现象进行分析的方法。
当物质受到紫外或可见光的激发，电子跃迁至激发态，然后通过非辐射跃迁回到基态，释放出荧光。
测量荧光的强度可以确定样品中目标物质的含量。
实验步骤：
1.准备样品：将待测样品稀释至合适的浓度；
2.调节荧光分光光度计：设置激发波长和发射波长；
3.激发样品：打开紫外灯，照射样品；
4.测量荧光：将激发波长切换至发射波长，测量样品的荧光强度；
5.绘制标准曲线：使用已知浓度的标准品，测定其荧光强度，绘制荧
光强度与浓度的关系曲线；
6.计算样品中目标物质的含量：根据样品的荧光强度和标准曲线，计
算样品中目标物质的浓度。
实验结果和分析：
通过测量不同浓度的标准品的荧光强度，绘制了荧光强度与浓度的标
准曲线。
然后测量了待测样品的荧光强度，并通过标准曲线计算出样品中
目标物质的浓度为X mg/L。
结论：
本实验成功使用荧光分析法测定了样品中目标物质的含量为X mg/L。
实验总结：
1.样品的选择和处理要准确；
2.标准曲线的绘制要准确，标准品的浓度要覆盖待测样品的范围；
3.实验现场要保持黑暗，避免外界光源对结果的干扰。
2.马志刚等.分析化学实验指导.化学工业出版社,2024.。
仪器分析课件12荧光分析法
ex = 356nm em = 404nm
f = 0.36
16
2. 分子的刚性
• 同样具有*跃迁的长共轭分子中，刚性分子 增加了共平面性， 越大， 长移。
f = 0.2
-O
O
COO-
C H2
f = 1.0
-O
O
O
COO- 荧光素钠
17
原来不发生荧光的，如：8-羟基喹啉
消除干扰，提高选择性、灵敏度
脉冲激光
样品
干扰 组分
44
3. 同步荧光分析
固定，同时扫描激光光谱和发射光谱 若： = em - ex
Fsp = KcFem Fex 提高灵敏度和选择性
混合物的同步荧光光谱（ =3nm）
45
4. 胶束增敏荧光
CH3(CH2)11OSO3-Na+ 非极性疏水基团 极性亲水基团 增加溶解度 增加荧光效率 增加荧光的稳定性
• 荧光分析法的灵敏度高于紫外-可见分光光度法
荧光法
F=Kc
紫外法 A lg T lg I
I0
36
二、定量分析方法
1. 工作曲线法
用空白溶液调零 用标准溶液调满刻度
F cx
c1
c2 c3 c4 c5
20 40 60 80 100%
16 32 48 64 80%
37
2. 比例法（对比法）
光
强
荧光光谱 横坐标em， 度
纵坐标 发射光强度
400
500
(nm)
8
溶液荧光光谱通常具有如下特征
斯托克斯位移 荧光光谱的形状与激发波长无关 荧光光谱与激发光谱的镜像关系
分析化学 第十一章 荧光分析法
h
29
㈡环境因素
荧光分子所处的溶液环境对其荧光发射有直接的 影响。适当的选取实验条件有利于提高荧光分析的 灵敏度和选择性。 ⑴溶剂效应 ①溶剂的极性：
溶剂的极性增大，π→π＊跃迁的能量减小，红 移。 ②溶剂的粘度
溶剂的粘度降低，分子间碰撞机会增加，无辐 射跃迁几率增加，荧光减弱。
h
30
⑵温度的影响
激发态分子与溶剂和其它溶质分子间的相 互作用及能量转换等过程称为外部能量转换。
外转换过程是荧光或磷光的竞争过程，因该
过程发光强度减弱或消失，该现象称为“猝灭” 或
“熄灭”。
h
10
⑸体系间跨越 系间跃迁是不同多重态之间的一种无辐射跃迁
该过程是激发态电子改变其自旋态，是分子的多 重性发生变化的结果。
当两种能态的振动能级重叠时，这种跃迁的几 率增大。
的吸收(或激发)光谱的波长长。荧光发射这种波长 位移的现象称为Stokes位移。
原因：处于激发态的分子一方面由于振动弛豫 等损失了部分能量，另一方面溶剂分子的弛豫作用 使其能量进一步损失，因而产生了发射光谱波长的 位移。
Stokes位移表明在荧光激发和发射之间所产生 的能量损失。（见P220图11-3）
①对于含有酸性或碱性基团的荧光物质而言， 溶液的pH将对这类物质的荧光强度产生较大的 影响。 如：在pH7～12的溶液中，苯胺以分子形式存 在，产生蓝色荧光；
当pH＜3、 pH＞13时，苯胺以阳离子、 阴离子形式存在，均无荧光。 ②溶液的pH也影响金属配合物的荧光性质。
h
32
⑷荧光猝灭
荧光猝灭：荧光分子与溶剂或其它溶质分子之间相互 作用，使荧光强度减弱的作用。
F0/eF0eKf
则K= 1/τf，将其带入 Ft F0eKt
分析化学第11章--荧光分析法
概述 基本原理 定量分析方法 荧光分析技术及应用
11.1 概述
1.光致发光：物质受到光照射时，除 吸收某种波长的光之外还会发射出比 原来所吸收光的波长更长的光，这种 现象称为光致发光。
2.荧光(fluorescence)：物质分子接受 光子能量被激发后，从激发态的最低 振动能级返回基态时发射出的光。
低一些。 2.荧光的产生 1）激发过程： 基态分子 hv 激发单重态(s1*,s2*)
激发三重态
2）激发态能量传递途径
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 磷光 系间跨越内转换 外转换 振动弛豫
1.无辐射跃迁
a.振动驰豫(vibrational relexation):
处于激发态各振动能级的分子通过 与溶剂分子的碰撞而将部分振动能 量传递给溶剂分子，其电子则返回 到同一电子激发态的最低振动能级 的过程。
2)电子能态的多重性：
M=2S+1
S:总自旋量子数。S＝s1+s2 对于 S=1/2 +(-1/2)=0
M=2S+1=1
对应基线单重态；
对于激发态
s1=1/2,s2=1/2,
S=1/2+1/2=1, M=2×1+1=3 三重态
• 单重态与三重态的区别 1）电子自旋方向不同； 2）激发三重态的能量稍
8-羟基喹啉
8－羟基喹啉镁
弱荧光
强荧光
刚性和共面性增加，可以发射荧光或增 强荧光。
c.位阻效应
NaO3S
N(CH3)2
NaO3S
N(CH3)2
1-二甲氨基萘-7-磺酸钠 f＝0.75
1-二甲氨基萘-8-磺酸钠 f ＝0.03
荧光分析法的基本原理
荧光分析法的基本原理荧光分析法是一种常用的分析技术，它利用样品在受到激发光照射后发出的荧光信号来进行分析。
该方法具有灵敏度高、选择性好、操作简便等优点，在生物医药、环境监测、食品安全等领域得到了广泛的应用。
荧光分析法的基本原理是基于物质在受到激发光照射后会发出荧光的特性。
当分子处于基态时，吸收一定波长的激发光后，电子跃迁至激发态，再从激发态返回基态时会放出荧光。
荧光分析法利用这一原理，通过测量样品在受到激发光后发出的荧光强度来确定样品中所含物质的种类和含量。
在荧光分析法中，激发光源会激发样品中的分子，使其处于激发态，然后测量样品发出的荧光信号。
荧光信号的强度和波长分布可以提供关于样品成分和结构的信息。
通过测量样品的荧光强度和波长分布，可以对样品中的化合物进行定性和定量分析。
荧光分析法的基本原理包括激发和发射两个过程。
激发过程是指样品受到激发光照射后，分子从基态跃迁至激发态的过程；发射过程是指分子从激发态返回基态时发出荧光的过程。
荧光分析法利用这两个过程进行分析，可以实现对样品中微量物质的高灵敏度检测。
荧光分析法的灵敏度高，可以检测到样品中极微量的物质。
同时，荧光分析法具有良好的选择性，可以通过选择合适的激发光源和检测波长，对不同物质进行区分和分析。
此外，荧光分析法的操作简便，只需一台荧光分析仪和相应的荧光标记剂即可进行分析，无需复杂的前处理步骤，适用于现场快速检测和大样品量分析。
总之，荧光分析法是一种灵敏度高、选择性好、操作简便的分析技术，具有广泛的应用前景。
随着荧光标记技术和荧光分析仪器的不断发展，荧光分析法将在生物医药、环境监测、食品安全等领域发挥越来越重要的作用。
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远红外
10nm~200nm 200nm 380nm 780 nm
2.5 m
50 m
~380nm ~ 780nm ~ 2.5 m ~ 50 m ~300 m
温州大学化材学院
微纳结构材料 & 物理化学研究所
荧光基础理论
➢ 什么是荧光 ？
当紫外或可见光照射到某些物质上时，这 些物质就会发射出波长和强度各不相同的 光线，停止照射光照射时，这种光线马上 或逐渐消失，这就是荧光。
分子的去激发
无辐射跃迁 分子的去激发
辐射跃迁
振动弛豫 内转移 外转移 体系间跨越
荧光（F） 磷光（P）
温州大学化材学院
微纳结构材料 & 物理化学研究所
辐射跃迁
荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振
动能级回到基态所发出的辐射。寿命为10-8 ~ 10 -11s。
由于是相同多重态之间的跃迁，几率较大，速度大，
温州大学 现代物理化学技术
荧光及荧光分析
陈伟
wchen@
温州大学化材学院
微纳结构材料 & 物理化学研究所
荧光及荧光分析
概述 基本原理 荧光分析 仪器与技术 应用与示例
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光学光谱区
远紫外 近紫外 可见光 近红外 中红外
（真空紫外）
于选择最适宜的激发波长。
温州大学化材学院
微纳结构材料 & 物理化学研究所
激发光谱与发射光谱
温州大学化材学院
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荧光的发现及发展
1575年，西班牙医生N. Monardes首先发现荧光
1852年，Stokes发现荧光波长比照射光波长
要长，认定荧光是发射光。
1867年，首次用于分析测定。
1952年，商品荧光分光光度计出现。
2008年，日本村修、美国马丁·沙尔菲、美籍
S0
l1
l2
温州大学化材学院
l3 l 2
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荧光测量
光源
单色器
λ ex
I0
吸
收
池
It
狭缝
单色器
λ em
狭缝
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检测器
荧光的检测
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激发光谱与发射光谱
任何荧（磷）光都具有两种特征光谱：激发 光谱与发射光谱。它们是荧（磷）光定性分析的 基础。 1）激发光谱
荧光是由激发单重态最低振动能层至基态各振 动能层间跃迁产生的；而磷光是由激发三重态的 最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的。
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无辐射跃迁
系间窜越
指不同多重态间的无辐射跃迁， 例如S1→T1就是一种体系间跨跃。 通常，发生体系间跨跃时，电子 由S1的较低振动能级转移至T1的 较高振动能级处。有时，通过热
改变激发波长，测量在最强荧（磷）光发射 波长处的强度变化，以激发波长对荧光强度作图 可得到激发光谱。
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激发光谱与发射光谱
激发光谱形状与吸收光谱形状完全相似，经 校正后二者完全相同！这是因为分子吸收光能的 过程就是分子的激发过程。
激发光谱可用于鉴别荧光物质；在定量时，用
速率常数kf为106~109s-1。
磷光： 从第一激发三重态的最低振动能级回到基态
所发出的辐射。由于磷光的产生伴随自旋多重态的
改变，辐射速度远小于荧光，磷光寿命为10-4 ~10s。
在光照停止后，仍可持续一段时间。
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无辐射跃迁
振动弛豫 它是指 在同一电子能级中，电子由高振动 能级转至低振动能级，而将多余的能量以 热的形式发出。发生振动弛豫的时间为1012s数量级。
华裔钱永健因发现并发展了绿色荧光蛋白质技
术而获诺贝尔化学奖。
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单重态和三重态
电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和 (0或1)；
单重态：全部轨道里的电子都是自旋配对的，S=0,M=1； 三重态：分子具有自旋不配对的电子，S=1,M=3. 平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重 态能级低； 大多数有机分子的基态处于单重态；
hv h h A vF v
P
S1 T1
S0
激发，有可能发生T1→S1，然后 由S1发生荧光。这是产生延迟荧光的机理。 改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。
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内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能 量
吸 收
发
射
外转换
荧
光
T1 T2
发 射 磷 振动弛豫 光
激发态与基态中的电子自旋方向相反，称为激发单重态 （S）抗磁性 激发态与基态中的电子自旋方向相同，称为激发三重态 （T）顺磁性
区别：电子自旋方向不同，激发三重态的能级稍低一些。
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电子跃迁
➢ 处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无 辐射跃迁方式再回到基态。
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无辐射跃迁
内转换
当两个电子能级非常靠近以至其振动能级 有重叠时，常发生电子由高能级以无辐射 跃迁方式转移至低能级。
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无辐射跃迁
外转移
指激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互 作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消 失。这一现象称为“熄灭”或“猝灭”。 荧光与磷光的根本区别：
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电子跃迁类型
允许跃迁
禁阻跃迁
基态单重态
激发单重态 激发三重态
S0
S1, S2, S3…… T1, T2, T3……
区别：电子自旋方向不同，激发三重态的能级稍低一些。
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微纳结构材料 & 物理化学研究所
电子跃迁类型
在单重激发态中，两个电子平行自旋， 单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿 命大约为10-8s，而三重态分子具有顺磁性，其 激发态的平均寿命为10-4 ~ 1s以上（通常用S和 T分别表示单重态和三重态）。
➢ 辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发 射；
➢ 无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能 量，包括振动弛豫（VR）、内转移（IR）、外 转移（EC）及系间窜越（ISC）等，各种跃迁方 式发生的可能性及程度，与荧光物质本身的结构 及激发时的物理和化学环境等因素有关。
温州ห้องสมุดไป่ตู้学化材学院
微纳结构材料 & 物理化学研究所