实验三 细菌的分离培养及移植

实验目的： 实验目的：
1 掌握细菌分离培养的基本要领和方法 掌握挑菌、 2 掌握挑菌、纯培养及移植技术 3 了解细菌的菌落形态及其在各种培养基上的培养 性状
实验材料： 实验材料：
菌种：大肠杆菌斜面、 1 菌种：大肠杆菌斜面、大肠杆菌与金黄色葡萄球 球 菌的混合培养肉汤等； 菌的混合培养肉汤等； 培养基：普通肉汤、普通琼脂斜面、 2 培养基：普通肉汤、普通琼脂斜面、普通琼脂平 板 器械：剪刀、记号笔、酒精灯、 3 器械：剪刀、记号笔、酒精灯、接种环
4.穿刺培养法 4.穿刺培养法
半固体移植多用穿刺法接种。 半固体移植多用穿刺法接种。 多用穿刺法接种 方法基本与纯培养接种相同， 方法基本与纯培养接种相同，不同的是用接种针 挑取菌落，垂直刺入培养基内 从培养基表面的中 挑取菌落，垂直刺入培养基内。从培养基表面的中 部一直刺入管底，然后按原方向退出即可。 部一直刺入管底，然后按原方向退出即可。 原方向退出即可
1. 生物学法
动物组织及其他物质加入法：在液体培养基内加入肝脏、 (1) 动物组织及其他物质加入法：在液体培养基内加入肝脏、肾脏等动 物脏器，因其中的半胱氨酸的一SH基极不稳定，为强还原剂。 SH基极不稳定 物脏器，因其中的半胱氨酸的一SH基极不稳定，为强还原剂。 共栖培养法：将厌氧菌与需氧菌共同培养在同一个平皿内， (2) 共栖培养法：将厌氧菌与需氧菌共同培养在同一个平皿内，利用需 氧菌的生长繁殖将氧气消耗后，造成厌氧环境利于厌氧菌生长。 氧菌的生长繁殖将氧气消耗后，造成厌氧环境利于厌氧菌生长。
7.利用化学药品的分离培养法 7.利用化学药品的分离培养法
(1)抑菌作用: 有些药品对某些细菌有极强的抑制作用， (1)抑菌作用: 有些药品对某些细菌有极强的抑制作用，而对另外一些细菌没有 抑菌作用 抑制作用，所以可利用这种特性进行细菌的分离。 抑制作用，所以可利用这种特性进行细菌的分离。 (2)杀菌作用: 将病料如结核病料用15 硫酸溶液处理，其他杂菌均被杀死， 15％ (2)杀菌作用: 将病料如结核病料用15％硫酸溶液处理，其他杂菌均被杀死，而 杀菌作用 结核杆菌因具有抗酸性而存活。 结核杆菌因具有抗酸性而存活。 (3)鉴别作用: 利用细菌对某种糖的分解能力，通过培养基中指示剂的变化来鉴 (3)鉴别作用: 利用细菌对某种糖的分解能力， 鉴别作用 别某种细菌。 别某种细菌。
2.1
两试管间的斜面移植
斜持菌种管和 左手斜持菌种管 被接种琼脂斜面管， 左手斜持菌种管和被接种琼脂斜面管，使 管口相互并齐，管底部放在拇指和食指之间， 管口相互并齐，管底部放在拇指和食指之间， 松动两管塞子，以便接种时易拔出（ 松动两管塞子，以便接种时易拔出（图3）。 ）。 右手持接种棒，火焰灭菌后 右手持接种棒，火焰灭菌后，用右手小 指和无名指并齐同时拔出两管塞， 指和无名指并齐同时拔出两管塞，将管口 进行火焰灭菌，使其靠近火焰。 进行火焰灭菌，使其靠近火焰。 将接种环深入菌种管内， 将接种环深入菌种管内，先在无菌生长 深入菌种管内 琼脂上接触使之冷却， 使之冷却 的琼脂上接触使之冷却，再挑取少许细菌 后拉出接种环立即放入另一斜面培养基上， 后拉出接种环立即放入另一斜面培养基上 放入另一斜面培养基 勿碰及斜面和管壁，直达斜面底部。 勿碰及斜面和管壁，直达斜面底部。 从斜面底部开始划曲线，向上至斜面顶 斜面底部开始划曲线， 端为止，管口通过火焰灭菌，塞好棉塞， 端为止，管口通过火焰灭菌，塞好棉塞， 灭菌接种环，作好标记，置于37 37℃ 灭菌接种环，作好标记，置于37℃温箱培 。（图 养。（图4）
2. 化学方法
利用还原能力强的化学物质，将环境或培养基内的氧气消耗，或还 利用还原能力强的化学物质，将环境或培养基内的氧气消耗， 原氧化型物质，降低氧化-还原电势。 原氧化型物质，降低氧化-还原电势。 (1) 焦性没食子酸法: 平板培养法、Buchner氏试管法、史氏厌氧培养 焦性没食子酸法: 平板培养法、Buchner氏试管法、 氏试管法 法、平皿厌氧培养法 、玻罐或干燥器法 (2) 李伏夫（B.M.JIbBOB）氏法 李伏夫（B.M.JIbBOB） 硫乙醇酸钠法：液体培养基法、 (3) 硫乙醇酸钠法：液体培养基法、固体培养基法 厌氧罐法、真空干燥器法、加热密封法、 3. 物理学方法 厌氧罐法、真空干燥器法、加热密封法、高层琼脂柱
图1 划线分离示意图
图2 连续划线法
区划线法
2.纯培养的获得与移植法 2.纯培养的获得与移植法
---琼脂斜面分离法 ---琼脂斜面分离法 的平板从温箱取出， 将37℃下培养 ℃下培养24h的平板从温箱取出，挑取 的平板从温箱取出 单个菌落，镜检不含杂菌，即用接种环挑取 单个菌落，镜检不含杂菌，即用接种环挑取 不含杂菌 单个菌落移植于琼脂斜面培养， 单个菌落移植于琼脂斜面培养，所得的培养 移植于琼脂斜面培养 物即为纯培养物。 物即为纯培养物。 纯培养物
6.芽胞需氧菌分离培养法 6.芽胞需氧菌分离培养法
如果被检材料中可疑有带芽孢的细菌，可先将被检材料加少量生理盐水或肉汤， 如果被检材料中可疑有带芽孢的细菌，可先将被检材料加少量生理盐水或肉汤， 可疑有带芽孢的细菌 置于80℃水浴箱中维持15～20分钟，再进行培养。材料中若有带芽孢的细菌仍可 置于80℃水浴箱中维持15～20分钟，再进行培养。材料中若有带芽孢的细菌仍可 80 15 分钟 带芽孢 存活而生长繁殖，不耐热的细菌繁殖体则被杀灭。 存活而生长繁殖，不耐热的细菌繁殖体则被杀灭。 细菌繁殖体则被杀灭
3.营养肉汤增菌培养法 3.营养肉汤增菌培养法
当组织病料中含病原菌少，或有抗菌药残留时 当组织病料中含病原菌少，或有抗菌药残留时，用 病料中含病原菌少 抗菌药残留 琼脂斜面或平板分离法可能无菌落长出， 提高由病 琼脂斜面或平板分离法可能无菌落长出，为提高由病 料中分离培养细菌的机会，这时可以无菌操作剪取一 料中分离培养细菌的机会， 分离培养细菌的机会 小块病料直接投入肉汤， 37℃培养， 小块病料直接投入肉汤，经37℃培养，在肉汤中长出 肉汤 细菌后，观察其在液体培养基上的生长表现， 细菌后，观察其在液体培养基上的生长表现，再用琼 脂斜面或琼脂平板分离。 脂斜面或琼脂平板分离。
二 厌氧型细菌分离培养法
细菌接种后，直接放在恒温箱内培养， 细菌接种后，直接放在恒温箱内培养，可以使需氧菌与兼性 厌氧菌生长繁殖；但对厌氧菌， 厌氧菌生长繁殖；但对厌氧菌，则需将培养环境或培养基中的 厌氧菌 氧气除去，或将氧化型物质还原，降低其氧化还原电势， 氧气除去，或将氧化型物质还原，降低其氧化还原电势，才能 生长繁殖。在有氧的环境下，培养基的氧化还原电势较高， 生长繁殖。在有氧的环境下，培养基的氧化还原电势较高，不 适于厌氧菌的生长。为使培养基降低电势， 适于厌氧菌的生长。为使培养基降低电势，降低培养环境的氧 分压是十分必要的。 分压是十分必要的。 现有的厌氧培养法很多，主要有生物学法、 现有的厌氧培养法很多，主要有生物学法、化学法和物理学 生物学法 法，可根据各实验室的具体情况而选用。 可根据各实验室的具体情况而选用。
划线培养时注意问题： 划线培养时注意问题：
(1) 左手持皿，用左手拇指、食指及中指将平皿揭 左手持皿，用左手拇指、食指及中指将平皿揭 开约呈20°的角度(图 ； 开约呈 °的角度 图1)； (2) 右手持接种环，灼烧冷却后从混合培养肉汤中 右手持接种环，灼烧冷却后从混合培养肉汤中 少量涂布于培养基边缘 开始划线(图 ； 于培养基边缘， 取少量涂布于培养基边缘，开始划线 图2)； (3) 划线前先将接种环稍稍弯曲，使之易与琼脂面 划线前先将接种环稍稍弯曲，使之易与琼脂面 接种环稍稍弯曲 平行，不致划破培养基； 平行，不致划破培养基； (4) 划线中不易过多的重复旧线，以免形成菌苔； 划线中不易过多的重复旧线，以免形成菌苔； 不易过多的重复旧线 (5) 接种完毕，在皿底作好标记（菌名、日期、接 接种完毕，在皿底作好标记 菌名、日期、 作好标记（ 种者等），平皿倒扣，置于37℃培养。 ），平皿倒扣 种者等），平皿倒扣，置于 ℃培养。
三 细菌培养性状的检查
（一）细菌在固体培养基上的生长表现
1.琼脂平皿上的生长表现 细菌于固体培养基表面生长繁殖， 1.琼脂平皿上的生长表现 ：细菌于固体培养基表面生长繁殖，形成单个肉眼 可见的细菌集落群体，称为菌落。各种细菌的菌落，按其特征的不同， 可见的细菌集落群体，称为菌落。各种细菌的菌落，按其特征的不同，可以 在一定程度上鉴别某种细菌。 在一定程度上鉴别某种细菌。 葡萄球菌在琼脂平皿上，由于产生色素的不同， 葡萄球菌在琼脂平皿上，由于产生色素的不同，形成各种颜色的圆形而突 起的菌落；炭疽杆菌形成扁平干燥，边缘不整齐的火焰状菌落， 起的菌落；炭疽杆菌形成扁平干燥，边缘不整齐的火焰状菌落，用放大镜观 察时，呈卷发样构造；肠道杆菌属的细菌，形成圆形、湿润、粘稠、扁平、 察时，呈卷发样构造；肠道杆菌属的细菌，形成圆形、湿润、粘稠、扁平、 大小不等的菌落；巴氏杆菌和猪丹毒杆菌，形成细小露珠状菌落。 大小不等的菌落；巴氏杆菌和猪丹毒杆菌，形成细小露珠状菌落。观察菌落 的方法除肉眼外，还可用放大镜，必要时也可用低倍显微镜进行检查。 的方法除肉眼外，还可用放大镜，必要时也可用低倍显微镜进行检查。(见图 5-6)
实验三 细菌的分离培养及移植
两个概念：
在细菌学检验中， 在细菌学检验中，细菌的分离培养是重要的基 本技术之一。 本技术之一。 分离：从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的 分离： 方法； 方法； 纯培养： 纯培养：一株菌种或一个培养物中所有的细菌 都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。 都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。
图3 斜面接种时试管的拿法
图4 斜面接种时无菌操作接种棒，火焰灭菌，左手打开平皿盖， 手执接种棒，火焰灭菌，左手打开平皿盖，将接种
环置于平皿盖上使之冷却； 环置于平皿盖上使之冷却； 挑取可疑的菌落，左手盖上平皿盖后立即取斜面管， 挑取可疑的菌落，左手盖上平皿盖后立即取斜面管， 深入斜面管中， 斜面底部开始划曲线， 深入斜面管中，从斜面底部开始划曲线，向上至斜面 顶端为止； 顶端为止； 管口通过火焰灭菌，塞好棉塞，灭菌接种环， 管口通过火焰灭菌，塞好棉塞，灭菌接种环，作好 标记，置于37℃温箱培养。 标记，置于37℃温箱培养。 37